Гени за имуноглобулин и Т-ћелијски рецептор као молекуларни маркери код деце с акутном лимфобластном леукемијом

Transcription

1 384 Srp Arh Celok Lek Jul-Aug;137(7-8): DOI: /SARH L ОРИГИНАЛНИ РАД / ORIGINAL ARTICLE UDC: :575 Гени за имуноглобулин и Т-ћелијски рецептор као молекуларни маркери код деце с акутном лимфобластном леукемијом Jelena Lazić 1, Lidija Dokmanović 1, Nada Krstovski 1, Jelica Predojević 2, Nataša Tošić 3, Sowa Pavlović 3, Dragana Janić 1 1 Služba za hematologiju i onkologiju, Univerzitetska dečja klinika, Beograd, Srbija; 2 Dečja klinika, Kliničko-bolnički centar, Bawa Luka, Bosna i Hercegovina; 3 Institut za molekularnu genetiku i genetičko inžewerstvo, Beograd, Srbija KRATAK SADRŽAJ Uvod Akut na lim fo blast na le u ke mi ja (ALL) je ma lig na klo nal na bo lest i jed na od naj če šćih neo pla zmi deč jeg uz rasta. Pri me nom sa vre me nih pro to ko la po sti žu se vi sok ste pen re mi si je i du go go di šwa sto pa pre ži vqa va wa. Uvođe wem me to da mo le ku lar ne ge ne ti ke omo gu će ni su sub mi kro skop ska kla si fi ka ci ja i pra će we mi ni mal ne re zi dual ne bo le sti (MRB), od go vor ne za na sta nak re ci di va. Ciq ra da Ciq ra da je bi lo is pi ti va we uče sta lo sti re a ran žma na gen skih lo ku sa za te ške lan ce imu no glo bu li na (IgH) i T-će lij ski re cep tor (TCR) i wi ho va ko re la ci ja s kli nič kim pa ra me tri ma. Me to de ra da Is pi ta no je 41 de te obo le lo od ALL ko ji ma je na di jag no zi ra đe na mo le ku lar na de tek ci ja re a ran žmana gen skih lo ku sa za IgH i TCR me to dom lan ča nog umno ža va wa DNK (PCR). Po sma tra we raz vo ja MRB je ra đe no u in dukci o noj fa zi le če wa, ka da se oče ku je mor fo lo ški od go vor na te ra pi ju. Re zul ta ti Re a ran žman gen skog lo ku sa za IgH za be le žen je kod 82,9%, a za TCR kod 56,1% is pi ta ni ka. Po sle 33 da na induk ci o ne te ra pi je re a ran žma ni za IgH gen ski lo kus su zabeleženi kod 39%, a za TCR kod 36,5% de ce. Za kqu čak Ot kri va we ge net skih abe ra ci ja na mo le ku lar nom ni vou i wi ho va ko re la ci ja sa stan dard nim prog nostič kim pa ra me tri ma uka za la je na zna čaj no ve stra ti fi ka ci je ri zič nih gru pa, ko je zah te va ju pro me nu in ten zi te ta he mi o te ra pi je. Pra će we MRB se po ka za lo pre ci znim pre dik tiv nim fak to rom u na stan ku re ci di va bo le sti. Kquč ne re či: akut na lim fo blast na le u ke mi ja; mi ni mal na re zi du al na bo lest; re a ran žma ni gen skih lo ku sa za IgH i TCR UVOD Akut na lim fo blast na le u ke mi ja (ALL) je jed no od naj če šćih ma lig ni te ta deč jeg uz ra sta. Na sta je klon skom pro li fe ra ci jom lim fo bla sta, ne zrelih pre kur sor skih će li ja lim fo id ne lo ze ko ji su pret hod no pod le gli ma lig noj tran sfor ma ci ji [1]. Za hva qu ju ći sa vre me nim pro to ko lima, in tra tekal noj primeni lekova i zračewu cen tral nog nervnog si ste ma (CNS), da nas se kod oko 80% de ce s ALL po sti že du go traj na kli nič ka re mi si ja, koja je de fi ni sa na pri su stvom ma we od 5% bla sta u kost noj sr ži. Me đu tim, s ob zi rom na to da se kod 10-15% de ce raz vi je re ci div bo le sti, sma tra se da kon ven ci o nal na mor fo lo ška re mi si ja mo že bi ti udru že na s re zi du al nim bla sti ma, ko ji su naj če šći uzrok ponovne ak ti va ci je bo le sti [2]. Ot kri va we i pra će we re zi du al nih ma lig nih će li ja se na zi va mi ni mal na re zi du al na bo lest (MRB) i pred sta vqa naj ni ži mer qi vi ni vo bole sti [2]. Kao ne za vi sni prog no stič ki fak tor, MRB omo gu ća va stra ti fi ka ci ju no vih gru pa rizi ka i pru ža osno vu za pot pu no in di vi du al ni te ra pij ski pri stup [3]. Oda bir bo le sni ka prema ge net skom pro fi lu bo le sti omo gu ća va po de lu na gru pu ko ja zah te va in ten zi fi ka ci ju te ra pi je i na gru pu gde se pri me wu ju stan dard ni pro to ko li le če wa sa sma we nim do za ma, či me se ne ugro ža va is hod le če wa, a iz be ga va se iz la ga we mno gim toksič nim dej stvi ma ci to sta ti ka [4]. To kom po sled we dve de ce ni je za be le že ni su poku ša ji da se raz li či tim me to da ma ot kri je i prati MRB. Me to da iz bo ra za MRB tre ba da za do vo qi ne ko li ko va žnih kri te ri ju ma: sen zi tiv nost od naj ma we 10-3, spo sob nost raz li ko va wa ma lig nih od nor mal nih će li ja, po sto ja we sta bil nih le u kemi ja spe ci fič nih mar ke ra, la ku stan dar di za ciju, br zo do bi ja we re zul ta ta i mo guć nost kvan tifi ka ci je [5]. Jed na od me to da je lan ča na re ak ci ja umno ža va wa DNK (engl. polyme ra se chain re ac tion PCR). PCR esej je spo so ban da ot kri je jed nu le uke mij ski iz me we nu će li ju me đu mi lion nor malnih će li ja [6]. Za pra će we MRB ko ri ste se me tode kva li ta tiv na RT-PCR (engl. re ver se tran scrip ta se PCR) i kvan ti ta tiv na RQ-PCR (engl. real-ti me quan ti ta ti ve PCR), za sno va ne na ot kri va wu fu zi o nih tran skri pa ta i an ti gen-re cep tor ge na. MRB u ALL pod ra zu me va ot kri va we i pra će we struk tur nih fu zi o nih abe ra ci ja i re a ran žma na gen skih lo ku sa imu no glo bu li na (IgH) i T-će lijskog re cep to ra (TCR). Na svo joj po vr ši ni B-limfo ci ti eks pri mi ra ju imu no glo bu lin, a T-lim foci ti TCR, ko ji pre po zna ju an ti ge ne. Sva ki klon B ili T lim fo ci ta no si re cep tor je din stve ne spe ci fič no sti od re đe ne kom bi na ci jom V (engl. va ri a ble pro men qiv), D (engl. di ver sity ra znovr stan) i J (engl. jo i ning spa ja ju ći) gen skih segme na ta, de lo vi ma lo ku sa, ka ko za imu no glo bu lin, ta ko i za TCR za an ti gen. Ve li ki re per to ar razli či tih spe ci fič nih me sta za an ti gen po sti že

2 SERBIAN ARCHIVES OF MEDICINE 385 se to kom sa zre va wa lim fo ci ta kom bi na ci jom po jednog ge na iz V, D i J re gi o na. Va ri ja bil nost se do datno uve ća va de le ci jom i in ser ci jom nu kle o ti da na mestu spa ja wa, či me na sta je se kven ca je din stve na za svaki B i T lim fo cit ni klon [7]. To kom sa zre va wa B i T lim fo ci ta od i gra va se proces so mat skih re kom bi na ci ja, pri če mu se se kven ce odre đe nog ti pa kom bi nu ju i stva ra ju gen sa ko jeg se prepi su je in for ma ci ja za sin te zu od go va ra ju ćeg lan ca [8]. Na ovaj na čin ge ne ri še se ogro man di ver zi tet anti gen skih re cep to ra, ko ji se ogle da u po sto ja wu vi še od bi lion (10 12 ) raz li či tih klo no va B i T lim fo cita, sva ki s re cep to rom raz li či te spe ci fič no sti [9]. Klon-spe ci fič ni IgH i TCR re a ran žma ni su marke ri spe ci fič ni za tu mor i bo le sni ka, ko ji se mo gu pre po zna ti na di jag no zi vi še od 95% pa ci je na ta s lim fo pro li fe ra tiv nim bo le sti ma. Raz li či ti klonal ni imu no glo bu lin ski i TCR re a ran žma ni mo ra ju bi ti tač no de fi ni sa ni, da bi se raz li ko va li od sličnih po li klo nal nih, ko ji se isto vre me no s wi ma ampli fi ku ju. Re a ran žma ni ima ju po se ban zna čaj kao mete spe ci fič ne za bo le sni ka za ot kri va we i pra će we re zi du al ne bo le sti de ce bez hro mo zom skih abe ra cija. Kod zdra vih oso ba lim fo cit ni re per to ar je sta bilan i po li klo na lan. Re kom bi na ci je se u lim fo id nim pro ge ni to ri ma od i gra va ju po od re đe nom hi je rar hijskom re do sle du, zbog če ga se u vi še od 95% B-pre kursor skih ALL mo že ot kri ti IgH re a ran žman. Pot pu no re a ran ži ra ni IgH lo ku si ni su od li ka iskqu či vo B-le u ke mi ja, kao što se ni TCRγ re a ran žmani ne ot kri va ju is kqu či vo kod T-ma lig ni te ta. Zna tan pro ce nat B i T le u ke mi ja se od li ku je isto vre me nom eks pre si jom oba re a ran ži ra na lo ku sa [10]. Ana li zom IgH re per to a ra na di jag no zi se u 30-40% B-pre kur sor skih ALL mo že ot kri ti vi še od jed ne klonal ne po pu la ci je le u ke mij skih će li ja. Oli go klo nalnost se ta ko đe mo že ot kri ti s fre kven ci jom od oko 10% za imu no glo bu lin i pri bli žno 20% za TCR genske lo ku se. Ka da su u pi ta wu T-ALL, oli go klo nal nost TCR lo ku sa se ja vqa kod ma we od 5%, dok je IgH uzo rak oli go klo na lan kod 27% bo le sni ka [11]. Klo nal na evo lu ci ja je mo di fi ka ci ja po sto je ćih rea ran žma na ko jom le u ke mij ski klon da je vi še po pu laci ja sub klo no va. Po re đe we she me imu no glo bu li na i TCR re a ran žma na na di jag no zi i u re ci di vu bo le sti uka zu ju na pro me nu, za vi sno od ti pa le u ke mi je, ste pena sa zre va wa i vr ste sa mog re a ran žma na. Zbog mo gu će po ja ve la žno ne ga tiv nih re zul ta ta, sta bil nost ovih re a ran žma na se mo ra uze ti u ob zir ka da se oni ko riste kao mar ke ri za po sma tra we na pre do va wa bo le sti. Ka ko bar je dan re a ran ži ran IgH, TCRγ, od no sno TCRδ alel osta je sta bi lan u 75-90% B-ALL, od no sno 90% T-ALL, pre po ru ču je se po sma tra we bar dva mar ke ra, ko li ko je i do stup no kod ve ći ne bo le sni ka s ALL [12]. Re zul ta ti mno gih stu di ja su po ka za li da se she ma imu no glo bu lin skih i TCR re a ran žma na me wa s napret kom bo le sti. S ob zi rom na to da je kon fi gu ra cija gen skih lo ku sa spe ci fi čan mar ker le u ke mij ske ćeli je, po mo ću ko jeg se ona mo že po sma tra ti, pro me na te kon fi gu ra ci je u vre me nu mo že da uka že i na pro me nu sa me ma lig ne će li je i we nih bi o lo ških od li ka. Odvi ja we re kom bi na ci ja na do stup nim imu no glo bu linskim i TCR lo ku si ma uka zu je na to da je re kom bi nator ni si stem ak ti van, a me ha ni zmi za tva ra wa hro mati na ne funk ci o ni šu kao kod nor mal nih će li ja. Stoga je mo gu će pret po sta vi ti da i ne ki dru gi de lo vi geno ma mo gu bi ti otvo re ni za pri stup re kom bi na ci ji, usled če ga mo že do ći do na go mi la va wa mu ta ci ja. Neke od wih mo gu bi ti uzrok pro me ne fe no ti pa le u kemij skog klo na, što na vo di na za kqu čak da je klo nal na evo lu ci ja, pra će na kroz re a ran žma ne imu no glo bu lina i TCR, mo del na pret ka bo le sti [13]. CIQ RADA Ciq ra da je bio da se utvr de fre kven ci ja i klo nalnost re a ran žma na u ge ni ma za IgH i TCR u tre nutku po sta vqa wa di jag no ze i wi ho va ko re la ci ja s klinič kim i stan dard nim prog no stič kim pa ra me trima bo le sti kod de ce obo le le od ALL. Po sma tra ni su i raz voj MRB 33. da na in duk ci o nog le če wa i ko re laci ja ge ne tič kih mar ke ra s po ja vom re ci di va i smrtnim is ho dom. METODE RADA Is tra ži va we je ob u hva ti lo 41 de te obo le lo od ALL (22 de ča ka i 19 de voj či ca), uz ra sta od 1,9 do 16,5 go di na (me di ja na šest go di na), kod ko jih je di jag no za obo qewa po sta vqe na iz me đu 1. de cem bra i 1. ju la go di ne, a nad gle da na su do 1. av gu sta go di ne. Na Uni ver zi tet skoj deč joj kli ni ci (UDK) u Be o gra du su di jag no sti ko va na i le če na 32 bo le sni ka, dok je kod deve to ro de ce di jag no za po sta vqe na na UDK, ali su ona le če na na Deč joj kli ni ci Kli nič ko-bol nič kog centra u Ba wa Lu ci. Is pi ta ni ci su u pro se ku nad gle dani dve go di ne i tri me se ca (ras pon 0,7-53,7 me se ci). Di jag no za je po sta vqe na na osno vu stan dard nih ci to mor fo lo ških, ci to he mij skih i imu no fe no tipskih kri te ri ju ma. Le če we je iz ve de no pre ma ak tu el nom pro to ko lu ALL IC-BFM 2002, ko ji se sa sto ji od uobi ča je nih fa za leče wa: in duk ci je, kon so li da ci je, re in duk ci je (de termi ni sa na ran do mi za ci jom) i fa ze odr ža va wa. Proto kol na la že stra ti fi ka ci ju ri zi ka u od no su na uzrast, ini ci jal ni broj le u ko ci ta, po zi ti van ci to genet ski na laz t(9;22) i t(4;11), pri su stvo fu zi o nih gena BCR/ABL i MLL/AF4, od go vor na pro ni zon osmog da na, od no sno pro ce nat bla sta u kost noj sr ži 15. i 33. da na le če wa. Ma te ri jal za PCR ana li zu re a ran žma na gen skih lo ku sa (IgH i TCR) uzet je stan dard nom aspi ra ci jom kost ne sr ži u tre nut ku po sta vqa wa di jag no ze i 33. dana le če wa, ka da pro to kol pred vi đa ula zak bo le sni ka u mor fo lo šku re mi si ju. Mo le ku lar no ge ne tič ke ana li ze su ura đe ne u Insti tu tu za mo le ku lar nu ge ne ti ku i ge ne tič ko in žewer stvo u Be o gra du. DNK je izo lo va na iz će li ja kost

3 386 СРПСКИ АРХИВ ЗА ЦЕЛОКУПНО ЛЕКАРСТВО ne sr ži stan dard nom fe nol-hlo ro form-izo a mi lalko hol nom me to dom. Ot kri va we IgH gen skih re a ran žma na vr še no je meto dom PCR. Praj me ri su kom ple men tar ni se kven ca ma ko je ogra ni ča va ju tri hi per va ri ja bil na re gi o na (CDR) eg zo na, ko ji ko di ra va ri ja bil ni do men te škog lan ca, i de le vi sok ste pen ho mo lo gi je iz me đu raz li či tih V, odno sno J seg me na ta. Na ovaj na čin omo gu će no je umno žava we kom plet nog IgH re per to a ra. Nor ma lan po li klona lan uzo rak zdra vih in di vi dua ot kri va se kao smir na du ži ni iz me đu 100 i 200 bp i pred sta vqa ve li ki broj tra ka raz li či te du ži ne ko je po ti ču od raz li čitih lim fo ci ta. Po ja va jed ne do mi nant ne tra ke ili vi še wih uka zu je na po sto ja we klo nal nih po pu la cija će li ja s iden tič nim re a ran žma nom, tj. VDJ H kombi na ci jom gen skih seg me na ta (Sli ka 1). Ko ri šće na su dva pa ra praj me ra, jer se PCR am pli fi ka ci ja ra di u dva ko ra ka (engl. ne sted PCR): FR1 (5 -(G/C)AGGT(A/G) CAGCTG(G/C/T)(AT)G(GC)AGTC(G/A/T/C)G-3 ) i J1H (5 -AC CTGAG GA GACGGTGAC CAGGGT-3 ) pr vi par praj me ra; FR1 (5 -(G/C)AGGT(A/G)CAGCTG(G/C/T)(AT) Сли ка 2. Ана ли за TCRγ-PCR про из во да на осмо по стот ном по лиа кри ла мид ном ге лу Figure 2. TCRγ-PCR analyzed products on 8% polyacrilamid gel 1 здрав испитаник; 2 пацијент са моноклоналним TCRγ; 3 контрола PCR реакције; 4 ДНК маркер (лествица од по 100 bp) 1 healthy individual; 2 patient with monoclonal TCRγ rearrangement; 3 PCR reaction control; 4 DNA marker (100 bp scale) G(GC)AGTC(G/A/T/C)G-3 ) i FR3A (5 -ACACGGC(C/T) (C/G)TGTAT TACTGT-3 ) dru gi par praj me ra [11]. Uslo vi am pli fi ka ci je su: de na tu ra ci ja na 94 C (10 mi nu ta), po sle ko je sle di 35 ci klu sa de na tu ra ci je tako đe na 94 C (15 se kun di), ani lin ga na 55 C (20 se kundi) i elon ga ci je na 72 C (30 se kun di). Re ak ci ja se zavr ša va fi nal nom elon ga ci jom na 72 C (pet mi nu ta). Ot kri va we pro iz vo da PCR vr še no je elek tro fo re zom DNK na po li a kri la mid nom ge lu. Ot kri va we TCRγ gen skih re a ran žma na vr še no je me to dom PCR, praj me ri ma ko ji omo gu ća va ju umno žava we naj ve ćeg de la TCRγ re per to a ra. Nor ma lan po liklo na lan uzo rak zdra vih in di vi dua ot kri va se kao smir na du ži ni iz me đu 400 i 500 bp. Po ja va jed ne do mi nant ne tra ke ili vi še wih uka zu je na po sto ja we klo nal nih po pu la ci ja će li ja s iden tič nim re a ran žmanom, tj. VDJγ kom bi na ci jom gen skih seg me na ta (Slika 2). Is pi ta ni ci sa do mi nant nom tra kom ozna če ni su kao po zi tiv ni, i to: s jed nom kao mo no klo nal ni, sa dve bi klo nal ni, sa tri tri klo nal ni, a sa vi še od tri kao oli go klo nal ni. Ko ri šće na su dva pa ra praj me ra: TCRγ1 (5 -CTGTGA CA A CA AGTGTTGTTCCAC-3 ) i TCRγ2 (5 -GTGCTTCTAGCTTTCCTGTCTC-3 ) pr vi par praj me ra; TCRγ3 (5 -GAG TACGCTGCCTA CA GA- GAGG-3 ) i TCRγ4 (5 -CCACTGCCA A A GAGTTTCTT-3 ) dru gi par praj me ra [14]. Uslo vi am pli fi ka ci je bi li su: de na tu ra ci ja na 94 C (10 mi nu ta), po sle ko je sle di 35 ci klu sa de na tura ci je na ta ko đe 94 C (45 se kun di), ani lin ga na 65 C (30 se kun di) i elon ga ci je na 72 C (60 se kun di). Re akci ja se za vr ša va fi nal nom elon ga ci jom na 72 C (pet mi nu ta). Ot kri va we pro iz vo da PCR vr še no je elektro fo re zom DNK na po li a kri la mid nom ge lu. REZULTATI Сли ка 1. Ана ли за IgH-PCR про из во да на осмо про цент ном по лиа кри ла мид ном ге лу Figure 1. IgH-PCR analyzed products on 8% polyacrilamid gel 1 здрав испитаник; 2 ДНК маркер (лествица од по 100 bp); 3 пацијент са моноклоналним IgH; 4 пацијент са биклоналним IgH 1 healthy individual; 2 DNA marker (100 bp scale); 3 patient with monoclonal IgH rearrangement; 4 patient with biclonal IgH rearrangement Kod 70 de ce je ra đe no ini ci jal no ot kri va we mo le kular nih re a ran žma na za IgH i TCR me to dom PCR, a razvoj MRB je po sma tran ra di be le že wa od go vo ra na prime we no le če we i ko re la ci je s kli nič kim prog no stičkim fak to ri ma. Kod is pi ta nih bo le sni ka broj le u koci ta (Le) u krv noj sli ci na di jag no zi je bio u pro seku 15400/mm 3 (op seg /mm 3 ). CNS sta tus 1 (iz o sta nak bla sta u li kvo ru i kli nič kih zna ko va bole sti CNS) usta no vqen je kod 37 de ce (90,3%), CNS sta tus 2 (ne tra u mat ska lum bal na punk ci ja sa ma we od pet će li ja po mi kro li tru u ce re bro spi nal noj teč nosti) utvr đen je kod dva de te ta (4,9%), dok je CNS sta

4 SERBIAN ARCHIVES OF MEDICINE 387 tus 3 (kli nič ki zna ci in fil tra ci je CNS i ma we od pet će li ja po mi kro li tru u li kvo ru sa pre do mi na cijom bla sta na ci to spi nu) ta ko đe usta no vqen kod dva de te ta (4,9%). FAB kla si fi ka ci ja je po ka za la da je podtip L1 bio za stu pqen kod 16 de ce (39%), dok su morfo lo ške od li ke pod ti pa L2 za be le že ne kod 25 de ce (61%). Imu no fe no tip ko ji od go va ra B-će lij skoj lini ji je utvr đen kod 29 de ce (70,7%), dok je kod 12 dece (29,3%) za be le že na eks pre si ja an ti ge na spe ci fičnih za T-će lij sku li ni ju. Pre ma pred vi đe noj stra tifi ka ci ji ri zi ka, u stan dard ni ri zik (SR) je svr stano 12 de ce (29,3%), u in ter me di jar ni ri zik (IR) 22 (53,7%), a u vi sok ri zik (VR) se dam is pi ta ni ka (17%). U gru pi od 41 is pi ta ni ka re a ran žman za IgH gen ski lo kus je za be le žen kod 34 de te ta (82,9%): mo no klo nalnost kod 17 de ce (41,5%), bi klo nal nost kod 14 (34,1%), tri klo nal nost kod jed nog de te ta (2,4%) i oli go klonal nost kod tri is pi ta ni ka (7,3%). U is toj gru pi ispi ta ni ka re a ran žman za TCRγ gen ski lo kus je za be ležen kod 23 de te ta (56,1%): mo no klo nal nost kod 20 ispi ta ni ka (48,8%), bi klo nal nost kod tri (7,3%) i triklo na lost kod jed nog de te ta. Kli nič ke od li ke de ce sa IgH i TCRγ re a ran žma ni ma su pri ka za ne u ta be li 1. Табела 1. Клиничке одлике испитаника с откривеним генским реаранжманима Table 1. Clinical characteristics of patients with detected gene rearrangements Параметар Parameter Укупан број испитаника Total number of patients Пол Sex Узраст (године) Age (years) Број леукоцита Number of leukocytes Хепатомегалија Hepatomegaly Спленомегалија Splenomegaly Статус ЦНС CNS status Имунофенотип Immunophenotype Морфологија бласта Morphology of blasts Апсолутни број бласта 8. дана Absolute blast count on day 8 Костна срж 15. дана Bone marrow on day 15 Костна срж 33. дана Bone marrow on day 33 * p<0.05; ** p<0.01 Генски реаранжмани Gene rearrangements IgH TCR Мушки Male 18 9 Женски Female < < ** Да / Yes Не / No Да / Yes Не / No B 26* 15 T 8 8 L L < M M2 8 5 M3 1 1 M M2 - - M Re a ran žma ni oba gen ska lo ku sa isto vre me no utvrđe na su kod 19 is pi ta ni ka (43,9%). U gru pi bo le sni ka sa IgH re a ran žma nom 11 de ce (26,8%) je stra ti fi ko vano u stan dard ni ri zik, 18 (43,9%) u in ter me di jar ni, a pe to ro (12,2%) u vi so ki ri zik. Me đu is pi ta ni ci ma sa TCRγ re a ran žma nom u gru pi in ter me di jar noj ri zika bi lo je 14 de ce (65,2%), dok su u gru pi stan dard nog i vi so kog ri zi ka bi la po če ti ri is pi ta ni ka (17,4%). Po zi tiv nost na BCR/ABL ot kri ve na je kod če ti ri ispi ta ni ka (11,8%) s re a ran žma ni ma IgH gen skog lo kusa i pet is pi ta ni ka (21,7%) sa TCRγ re a ran žma ni ma. Na kon Ia fa ze in duk ci o nog le če wa, kod 15 de ce (39%) s IgH re a ran žma nom ot kri ve na je MRB: mo no klo nalnost je za be le že na kod šest is pi ta ni ka (14,6%), a biklo nal nost i oli go klo nal nost kod po tri (7,3%). U gru pi bo le sni ka sa TCRγ re a ran žma nom, kod 15 de ce (65,2%) je 33. da na le če wa uočen re zi du al ni ma lig ni klon. Mo no klo nal nost je za be le že na kod 11 is pi tani ka (47,8%), a bi klo nal nost, tri klo nal nost i oli goklo nal nost kod po jed nog de te ta (4,3%) (Gra fi kon 1). Kli nič ka re mi si ja je po stig nu ta kod 97,6% is pita ni ka, a jed na de voj či ca je umr la usled sep se pre proce ne re mi si je 33. da na le če wa. Ra ni me du lar ni re cidiv je di jag no sti ko van kod če tvo ro de ce (9,4%). Smrt je na stu pi la kod ta ko đe če ti ri is pi ta ni ka (9,4%): kod jed nog de ča ka na kon re ci di va bo le sti, a kod tri dete ta usled sep se. Tran splan ta ci ja ma tič ne će li je hema to po e ze je ura đe na kod jed nog de te ta, kod ko jeg je otkri ven BCR/ABL fu zi o ni tran skript, ko ji je sa da u pot pu noj re mi si ji. DISKUSIJA 82,9% IgH 39% 56,1% Дијагноза On set 33. дан терапије Therapy day 33 TCR 36,5% Графикон 1. Брзина елиминације малигног клона код деце са IgH и TCRγ реаранжманима Graph 1. Speed of elimination of malignant clone in children with IgH and TCRγ rearrangements U le če wu ALL se po sti že vi sok ste pen kli nič ke i mor fo lo ške re mi si je kod vi še od 95% de ce, a du gogo di šwe pre ži vqa va we bez zna ka ak ti va ci je bo le sti kod oko 80% [15]. Me đu tim, i po red pri me ne sa vre menih pro to ko la, kod oko 15% bo le sni ka se ja vqa re cidiv bo le sti, za šta se sma tra od go vor nom MRB, ko ja se ne mo že ot kri ti kon ven ci o nal nim mi kro skop skim

5 388 СРПСКИ АРХИВ ЗА ЦЕЛОКУПНО ЛЕКАРСТВО me to da ma [16]. In ten zi fi ka ci ja te ra pi je pre ma gru pi ri zi ka je već prin cip le če wa u mno gim pro to ko lima na ci o nal nih i me đu na rod nih ko o pe ra tiv nih grupa [17]. Mno ge stu di je uka zu ju na to da se usme ra va wem le če wa pre ma vi še stru kim prog no stič kim fak to rima po sti že po zi ti van is hod i znat no sma wu je tok sičnost te ra pi je [18]. Ot kri va we fu zi o nih ge na, kao neza vi snih mo le ku lar nih mar ke ra, po mo gla je raz u meva wu na stan ka le u ke mi ja [19] i di rekt nom usme ra vawu le če wa. Me đu tim, s ob zi rom na to da se struk turne hro mo zom ske abe ra ci je ja vqa ju kod tre ći ne de ce s ALL [20], ot kri va we i pra će we re a ran ži ra nih ge na za IgH i TCR stva ra ju uslo ve za pre ci znu stra ti fika ci ji ri zi ka kod svih bo le sni ka. Ana li zom IgH re per to a ra na di jag no zi se u 30-40% B-pre kur sor skih ALL mo že ot kri ti vi še od jed ne klo nal ne po pu la ci je le u ke mij skih će li ja. Ka da su u pi ta wu T-ALL, oli go klo nal nost TCR lo ku sa se ja vqa kod ma we od 5%, a IgH lo ku sa kod 27% bo le sni ka [21]. S dru ge stra ne, TCR re a ran žma ni se mo gu ot kri ti kod 30-80% B-pre kur sor skih ALL. Ova fre kven ci ja je u ve zi sa ste pe nom sa zre va wa ma lig ne B-će li je, jer što je ma wa zre lost ma lig no al te ri sa ne će li je, ma wi je i pro ce nat ot kri va wa, dok se IgH re a ran žma ni ja vqaju u 10-20% T-ALL. U na šem is tra ži va wu, re a ran žman za IgH gen ski lo kus je za be le žen kod 82,9% is pi ta ni ka, i to: mo noklo nal na po pu la ci ja le u ke mij ski iz me we nih će lija kod 41,5%, bi klo nal na kod 34,1%, tri klo nal na kod 2,4%, a oli go klo nal na kod 7,3%. Re a ran žman TCRγ genskog lo ku sa je za be le žen kod 56,1% de ce, od če ga mo noklo nal nost kod 48,8%, bi klo nal nost kod 7,3%, a triklo na lost kod 2,4% bo le sni ka. Kao što se za struk tur ne hro mo zom ske abe ra ci je po sta vqa pi ta we raz li či to sti u od no su na et nič ku osno vu, ta ko se ras po de la i klo nal nost IgH i TCR rea ran žma na is pi tu ju u od no su na ge o graf sko po re klo ili so ci o e ko nom ske uslo ve ži vo ta. Skri de li (Scride li) i To ne (To ne) [22] su su mi ra wem re zul ta ta brojnih mul ti cen trič nih stu di ja za kqu či li da su in ciden ci ja i oso bi ne ana li zi ra nih re a ran žma na razli či ti u od no su na et nič ku pri pad nost i so ci o e konom ski sta tus. Me đu is pi ta ni ci ma sa IgH i TCR re a ran žma ni ma gen skog lo ku sa kod 7,3% de ce je ot kri ven BCR/ABL fuzi o ni tran skript. Ovaj po da tak je od su štin ske važno sti, jer me wa kli nič ku sli ku ovih bo le sni ka, kao i oče ki va ni od go vor na le če we u ko rist usta no vqene tran slo ka ci je. U obe gru pe de ce sa IgH i TCR rea ran žma nom vi še je bi lo de ča ka, ko ji su u pro se ku bi li uz ra sta od 5,6 do 6,8 go di na, s tim što je u grupi is pi ta ni ka sa TCR re a ran žma nom bi lo vi še dece sta ri je od šest go di na. Kod is pi ta ni ka sa TCR re a ran žma nom bi la je očeki va no ve ća me di ja na bro ja le u ko ci ta, jer je ini ci jalno po vi še na vred nost le u ko ci ta po ve za na sa T-imuno fe no ti pom. U obe gru pe is pi ta ni ka bio je do mi nan tan morfo lo ški pod tip L2, kao i B-imu no fe no tip bla sta (76,5% pre ma 65,2%), što do ka zu je da pot pu no re a ranži ra ni IgH lo ku si ni su od li ka is kqu či vo B-le u kemi ja, od no sno TCR re a ran žma ni T-le u ke mi ja. Van der Vel den (Van der Vel den) i sa rad ni ci [23, 24] su po tvrdi li da se zna tan pro ce nat B i T le u ke mi ja od li ku je isto vre me nom eks pre si jom oba re a ran ži ra na lo ku sa. U obe gru pe na ših is pi ta ni ka za be le žen je loš od go vor na pro ni zon osmog da na le če wa (11,8% prema 13%), ali su, iz u zev jed nog de te ta, to bi li bo le snici sa tran slo ka ci jom BCR/ABL. Ta ko đe, kod jed nog dete ta je iz o sta la kli nič ka i mor fo lo ška re mi si ja 33. da na le če wa, što se ob ja šwa va we go vom Ph po zi tivno šću i isto vre me nim ot kri va wem re a ran žma na za IgH i TCRγ gen ski lo kus. Po re đe we she me IgH i TCR re a ran žma na na di jagno zi to kom pra će wa MRB i u re ci di vu bo le sti ukazu ju na pro me ne, i to za vi sno od ti pa le u ke mi je, stepe na sa zre va wa i vr ste sa mog re a ran žma na. Kam pa na (Cam pa na) [25] je za kqu čio da je ova kav re zul tat posle di ca pro me ne IgH i TCR re a ran žma na s na pre dova wem bo le sti, što je uoče no i u na šem is tra ži va wu. Kon fi gu ra ci ja gen skih lo ku sa je spe ci fi čan mar ker le u ke mij ske će li je, te sva ka pro me na u vre me nu uka zuje i na pro me nu sa me ma lig ne će li je i we nih bi o loških oso bi na [26]. Klo nal na evo lu ci ja je va žna od li ka agre siv nih B-pre kur sor skih le u ke mi ja, jer je po sma tra wem razvo ja MRB to kom re ci di va bo le sti uoče no da je značaj no vi še de ce kod ko je je na početku bolesti ustano vqe na oli go klo nal nost. Van Don gen (Van Don gen) i sa rad ni ci [27] u svom ra du ob ja vqe nom još godi ne na vo de da su de ca ko ja za dr ža va ju oli go klo nal nu po pu la ci ju će li ja to kom le če wa znat no kra će u re misi ji bo le sti i da je kod wih ri zik od na stan ka smrti de set pu ta ve ći, što se, bez ob zi ra na ma wi uzo rak is pi ta ni ka, mo že od no si ti i na bo le sni ke na šeg istra ži va wa. Bjon di (Bi on di) i sa rad ni ci [28] su za kquči li da pra će we MRB u ra nim fa za ma le če wa uka zuje na po čet ni od go vor na te ra pi ju, he mi o sen zi tivnost i klo nal nost pre o sta lih bla sta, što je, u slu čaju po zi tiv nog na la za, pre dik tiv ni fak tor za na stanak re ci di va; to je po tvr đe no i u na šoj stu di ji. Među na šim is pi ta ni cima kod ko jih je ot kri ve na oli goklo nal nost IgH re a ran ži ra nih lo ku sa, kod 7,3% wih je do šlo do re ci di va bo le sti, a 11,8% je pre mi nu lo, dok je me đu de com sa TCRγ re a ran žma nom gen skog loku sa re ci div di jag no sti ko van kod 13%, a smrt ni ishod kod 17,4% bo le sni ka. Pro iz vo di do bi je ni pri me nom PCR me to de stvara ju do mi nan tan sig nal u klo nal noj pro li fe ra ci ji u od no su na po sto je ći, ko ji po ti če od nor mal ne po liklo nal ne po pu la ci je lim fo ci ta [29]. Ose tqi vost otkri va wa za vi si od ap so lut nog bro ja za stu pqe nih le uke mij skih će li ja i ap so lut nog bro ja B i T lim fo ci ta u kost noj sr ži, što pred sta vqa raz log za kvan ti fika ci ju PCR pro iz vo da, jer po da tak o klo nal no sti nije do voq no sna žan pre dik tiv ni fak tor [30]. Mo noklo nal ni IgH i TCR gen ski re a ran žma ni mo gu se otkri ti sa sen zi tiv no šću od 0,5-1, iz pe ri fer ne kr vi, od no sno iz aspi ra ta ko sne sr ži, što dijag no sti ko va we i pra će we bo le sti či ni lak šim [31].

6 SERBIAN ARCHIVES OF MEDICINE 389 Re zul ta ti mno gih stu di ja po ka zu ju da se kod oko 50% de ce mo že ot kri ti am pli fi ko van PCR pro iz vod re aran ži ra nih IgH i TCR gen skih lo ku sa na kra ju in dukci je. Ta de ca su si gur ni kan di da ti za na sta nak re cidi va bo le sti, a ri zik je pro por ci o na lan iz me re nom ni vou MRB [32]. Stra ti fi ka ci ja ri zi ka pre ma ova ko usta no vqe nim ge net skim mar ke ri ma omo gu ća va od ređi va we in ten zi te ta te ra pi je, što ih či ni ne za vi snim prog no stič kim fak to ri ma. In di vi du al no usme ra vawe te ra pi je omo gu ća va sma we we tok sič no sti ci to statskih agen sa kod de ce s ra nom i br zom ci to re duk ci jom. Na sta nak le u ke mi ja je di na mi čan pro ces ko ji uslovqa va tok bo le sti stal nim pro me na ma u po pu la ciji ma lig nih će li ja, do vo de ći do ge ne ri sa wa klo nalne fe no tip ske pro men qi vo sti, či me di rekt no uti če na is hod bo le sti [33]. Za hva qu ju ći uvo đe wu mo le kular ne ge ne ti ke u kli nič ku di jag no sti ku, ot kri va se i pra ti pro men qi vost ma lig nih će li ja, ko ja je od go vorna za vi so ko pro li fe ra tiv ne, agre siv ne i re zi stentne sub klo no ve [34, 35]. ZAKQUČAK Re a ran žman IgH gen skog lo ku sa se ot kri va kod če tiri pe ti ne bo le sni ka, a TCRγ ge na kod vi še od po lovi ne. U obe gru pe bo le sni ka do mi nant na je mo no klonal na po pu la ci ja le u ke mij ski iz me we nih će li ja (kod sko ro 50% de ce), dok je oli go klo nal na po pu la ci ja najma we za stu pqe na. Oče ki va no ve ća me di ja na br o ja leu ko ci ta se be le ži kod de ce sa TCRγ re a ran žma nom zbog ko re la ci je sa T-imu no fe no ti pom. Isto vre mena eks pre si ja oba re a ran ži ra na gen ska lo ku sa je bila če šća kod de ce sa B-imu no fe no ti pom. U obe grupe is pi ta ni ka ne po vo qan is hod bo le sti je bio predo mi nan tan kod de ce kod ko je je isto vre me no ot kriven i Fi la del fi ja-hr o mo zom. Iz ra zi to vi sok pr o cenat ula ska u kli nič ku re mi si ju je za be le žen kod svih is pi ta ni ka, dok je pr o ce nat re ci di va i smrt nog isho da usled re ci di va naj ma wi kod de ce bez ge net skih mu ta ci ja. Ova kav re zul tat ne sum wi vo uka zu je na značaj po čet nog ot kri va wa i po sma tra wa mo le ku lar nih mar ke ra to kom le če wa. NAPOMENA Ovaj čla nak je re zul tat ra da na pro jek tu broj Mi ni star stva za na u ku i teh no lo ški raz voj Re publi ke Sr bi je. LITERATURA 1. Greaves M. Childhood leukaemia. BMJ. 2002; 342(7332): Cazzaniga G, Biondi A. Molecular monitoring of minimal residual disease. In: Pui CH. Treatment of Acute Leukemias. New Jersey: Humana Press; p Cave H, van der Werff ten Bosch J, Suciu S, Guidal C, Waterkeyn C, Otten J, et al., for the European Organization for Research and Treatment of Cancer Childhood Leukemia Cooperative Group. Clinical significance of minimal residual disease in childhood acute lymphoblastic leukemia. N Engl J Med. 1998; 339(9): Stock W, Estrov Z. Studies of minimal residual disease in acute lymphocytic leukemia. Hematol Oncol Clin North Am. 2000; 14(6): Netto GJ, Saad RD, Dysert PA. Diagnostic molecular pathology: current techniques and clinical applications. BUMC proceedings 2003; 16: Gribben JG. Minimal residual leukemia. In: Nathan DG, Orkin SH, Ginsburg D, Look AT. Nathan and Oski s Hematology of Infancy and Childhood. Vol 2. Philadelphia: W.B. Saunders; p Virella G. Immunoglobulin structure. In: Virella G. Medical Immunology. 6th ed. New York: Informa Healthcare; p Burmester GR, Pezzutto A. Color Atlas of Immunology. Stuttgart: Thieme; Kuby J. Antibodies structure and function. In: Goldsby RA, et al. Immunology. 5th ed. New York: WH Freeman; p Szczepanski T, Beishuizen A, Pongers-Willemse MJ, Hählen K, van Wering ER, Wijkhuijs AJ, et al. Cross-lineage T cell receptor gene rearrangements occur in more than ninety percent of childhood precursor-b acute lymphoblastic leukemias: alternative PCR targets for detection of minimal residual disease. Leukemia. 1999; 13: Green E, McConville CM, Powell JE, Mann JR, Darbyshire PJ, Taylor AM, et al. Clonal diversity of Ig and T-cell receptor gene rearrangements identifies a subset of childhood B-precursor acute lymphoblastic leukemia with increased risk of relapse. Blood. 1998; 92(3): Szczepanski T, Willemse MJ, Brinkhof B, van Wering ER, van der Burg M, van Dongen JJ. Comparative analysis of Ig and TCR gene rearrangements at diagnosis and at relapse of childhood precursor- B-ALL provides improved strategies for selection of stable PCR targets for monitoring of minimal residual disease. Blood. 2002; 99(7): Germano G, del Giudice L, Palatron S, Giarin E, Cazzaniga G, Biondi A, et al. Clonality profile in relapsed precursor-b-all children by GeneScan and sequencing analyses. Consequences on minimal residual disease monitoring. Leukemia. 2003; 17: Čolović M, Pavlović S, Kragujac N, Čolović N, Janković G, Sefer D, et al. Acquired amegakaryocytic thrombocytopenia associated with proliferation of γ/δ TCR+ t-lymphocytes and a bcr-abl (p210) fusion transcript. Eur J Haematol. 2004; 73: Pui CH, Sandlund JT, Pei D, Campana D, Rivera GK, Ribeiro RC, et al. Improved outcome for children with acute lymphoblastic leukemia: Results of total therapy study XIIIB at St Jude Children s Research Hospital. Blood. 2004; 104(9): Lightfoot TJ, Roman E. Causes of childhood leukemia and lymphoma. Tox App Pharm. 2004; 199: Schultz KR, Pullen DJ, Sather HN, Shuster JJ, Devidas M, Borowitz MJ, et al. Risk and response based classification of childhood B-precursor acute lymphoblastic leukemia: A combined analysis of prognostic markers from the Pediatric Oncology Group (POG) and Children s Cancer Group (CCG). Blood. 2007; 109(3): Arico M, Conter V, Valsecchi MG, Rizzari C, Boccalatte MF, Barisone E, et al. Treatment reduction of highly selected standard-risk childhood acute lymphoblastic leukemia. The AIEOP ALL-9501 study. Haematologica. 2005; 90(9): Mitelman F, Johansson B, Mertens F. The impact of translocations and gene fusions on cancer causation. Nat Rev Cancer. 2007; 7(4): Cazzaniga G, Rossi V, Biondi A. Monitoring minimal residual disease using chromosomal translocations in childhood ALL. Best Prac Res Clin Haematol. 2002; 15(1): Meleshko AN, Belevtsev MV, Savitskaja TV, Potapnev MP. The incidence of T-cell receptor gene rearrangements in childhood B-lineage acute lymphoblastic leukemia is related to immunophenotype and fusion oncogene expression. Leuk Res. 2006; 30: Scrideli CA, Tone LG. Ig and TCR gene rearrangements in childhood ALL: Is there ethnic and socio-economic diversity of rearrangements patterns? Leuk Res. 2006; 30(9):

7 390 СРПСКИ АРХИВ ЗА ЦЕЛОКУПНО ЛЕКАРСТВО 23. Van der Velden VHJ, de Bie M, van Wering ER, van Dongen JJ. Immunoglobulin light chain gene rearrangements in precursor-bacute lymphoblastic leukemia: Characteristics and applicability for the detection of minimal residual disease. Haematologica. 2006; 91: Van der Velden VHJ, Szczepanski T, Wijkhuijs JM, Hart PG, Hoogeveen PG, Hop WC, et al. Age-related patterns of immunoglobulin and T-cell receptor gene rearrangements in precursor-b-all: implications for detection of minimal residual disease. Leukemia. 2003; 17: Campana D. Minimal residual disease studies in acute leukemia. Am J Clin Pathol. 2004; 122(Suppl):S Willemse MJ, Seriu T, Hettinger K, D Aniello E, Hop WC, Panzer- Grumayer ER, et al. Detection of minimal residual disease identifies differences in treatment response between T-ALL and precursor B-ALL. Blood. 2002; 99(12): van Dongen JJ, Seriu T, Panzer-Grumayer ER, Biondi A, Pongers- Willemse MJ, Corral L, et al. Prognostic value of minimal residual disease in acute lymphoblastic leukaemia in childhood. Lancet. 1998, 352: Biondi A, Valsecchi MG, Seriu T, D Aniello E, Willemse MJ, Fasching K, et al. Molecular detection of minimal residual disease is a strong predictive factor of relapse in childhood B-lineage acute lymphoblastic leukemia with medium risk features. A case control study of the International BFM study group. Leukemia. 2000: 14: Szczepanski T. Why and how to quantify minimal residual disease in acute lymphoblastic leukemia? Leukemia. 2007; 21: Neale GAM, Campana D, Pui CH. Minimal residual disease detection in acute lymphoblastic leukemia: Real improvement with the real-time quantitative PCT method? J Pediatr Hematol Oncol. 2003; 25(2): Van der Velden VHJ, Panzer-Grumayer ER, Cazzaniga G, Flohr T, Sutton R, Schrauder A, et al. Optimization of PCR-based minimal residual disease diagnostics for childhood acute lymphoblastic leukemia in a multi-center setting. Leukemia. 2007; 21: Zhou J, Goldwasser MA, Li A, Dahlberg SE, Neuberg D, Wang H, et al. Quantitative analysis of minimal residual disease predicts relapse in children with B-lineage acute lymphoblastic leukemia in DFCIALL Consortium Protocol Blood. 2007; 110: Stanulla M, Cario G, Meissner B, Schrauder A, Moricke A, Riehm H, et al. Integrating molecular information into treatment of childhood acute lymphoblastic leukemia A perspective from the BFM Study Group. Blood Cells Mol Disease. 2007; 39: Apostolidou E, Swords R, Alvarado Y, Giles J. Treatment of acute lymphoblastic leukaemia: a new era. Drugs. 2007; 67(15): Lazić J. Korelacija prisustva minimalne rezidualne bolesti i prognostičkih parametara u toku lečenja dece sa akutnom limfoblastnom leukemijom [magistarska teza]. Beograd: Medicinski fakultet Univerziteta u Beogradu; Immunoglobulin Genes and T-Cell Receptors as Molecular Markers in Children with Acute Lymphoblastic Leukaemia Jelena Lazić 1, Lidija Dokmanović 1, Nada Krstovski 1, Jelica Predojević 2, Nataša Tošić 3, Sonja Pavlović 3, Dragana Janić 1 1 Department of Haematology and Oncology, University Children s Hospital, Belgrade, Serbia; 2 Childrens Hospital, Clinical Centre, Banja Luka, Bosnia and Herzegovina; 3 Institute for Molecular Genetics and Genetic Engineering, Belgrade, Serbia SUMMARY Introduction Acute lymphoblastic leukaemia (ALL) is a malignant clonal disease, one of the most common malignancies in childhood. Contemporary protocols ensure high remission rate and long term free survival. The ability of molecular genetic methods help to establish submicroscopic classification and minimal residual disease (MRD) follow up, in major percent responsible for relapse. Objective The aim of the study was to detect the frequency of IgH and TCR gene rearrangements and their correlation with clinical parameters. Methods Forty-one children with ALL were enrolled in the study group, with initial diagnosis of IgH and TCR gene rearrangements by polimerase chain reaction ( PCR). MRD follow-up was performed in induction phase when morphological remission was expected, and after intensive chemiotherapy. Results In the study group IgH rearrangement was detected in 82.9% of children at the diagnosis, while TCR rearrangement was seen in 56.1%. On induction day 33, clonal IgH rearrangements persisted in 39% and TCR rearrangements in 36.5% of children. Conclusion Molecular analysis of genetic alterations and their correlation with standard prognostic parameters show the importance of risk stratification revision which leads to new therapy intensification approach. MRD stands out as a precise predictive factor for the relapse of disease. Keywords: acute lymphoblast leukaemia; minimal residual disease; IgH and TCR gene rearrangements Dragana JANIĆ Univerzitetska dečja klinika, Tiršova 10, Beograd, Srbija dr.janic@eunet.rs