TheraScreen : K-RAS Mutation Kit 7 mutāciju noteikšanai K-RAS gēnā

Transcription

1 TheraScreen : K-RAS Mutation Kit 7 mutāciju noteikšanai K-RAS gēnā Lietošanai sistēmā Roche LightCycler 480 Real-Time PCR System (Instrument II) (kataloga nr.: ) un sistēmā Applied BioSystems 7500 Real-Time PCR System (detaļas nr.: ) Ietver TheraScreen : K-RAS Mutation Kit CE-IVD paredzētās Roche Diagnostics programmatūras LightCycler Adapt Software v1.1 lietotāja rokasgrāmatu (kataloga nr.: ) Lietošanas pamācība Preču kodi Komplekta lielums DxS preces kods Roche Diagnostics pasūtījuma numurs 20 reakcijas KR reakcijas KR Pamācības versija: DU001g Pārskatīšanas datums: gada maijs Uzglabāt no -18 C līdz -25 C temperatūrā 1. lpp no 39

2 Saturs 1. Paredzētā izmantošana/lietošanas norādījumi Testa kopsavilkums un paskaidrojums Tehnoloģiskie principi Reaģenti BRĪDINĀJUMI UN PIESARDZĪBAS PASĀKUMI Uzglabāšana, stabilitāte un transportēšanas nosacījumi Ierīce Paraugi K-RAS mutāciju noteikšanas protokols Testa ierobežojumi Pārbaudes veiktspējas īpašības Tehniskais atbalsts Ražotāja un izplatītāju kontaktinformācija Pēdējās pārskatīšanas publicēšanas datums Izmantotā literatūra Informācija pircējam lpp. no 39

3 SVARĪGI! Rūpīgi izlasiet šo pamācību un iepazīstieties ar visām K-RAS komplekta sastāvdaļām pirms tā lietošanas. 1. Paredzētā izmantošana/lietošanas norādījumi Paredzētā izmantošana DxS TheraScreen : K-RAS Mutation Kit (K-RAS komplekts) ir in vitro diagnostikas tests, kas paredzēts septiņu somatisko mutāciju noteikšanai K-RAS onkogēnā, kā arī kvalitatīvai mutāciju statusa novērtēšanai. K-RAS komplektu ir paredzēts lietot speciāli aprīkotas laboratorijas apstākļos personālam, kas ir apmācīts darbam ar DNS paraugiem, iegūtiem no parafīnā ieguldītiem, formalīnā apstrādātiem kolorektālajiem audiem. Lietošanas norādījumi K-RAS komplekta rezultāti palīdzēs klīnicistam identificēt kolorektālā vēža slimniekus, kuriem antiepidermālā augšanas faktora receptoru (Epidermal Growth Factor Receptor EGFR) terapija, piemēram, panitumumabs vai cetuksimabs, varētu izrādīties nelietderīga. K-RAS komplekts nav paredzēts kolorektālā vēža diagnosticēšanai. To ir paredzēts izmantot papildus citiem atbilstošiem prognostiskiem faktoriem, lai, ņemot vērā pacienta mutāciju statusu, noteiktu anti-egfr terapijai piemērotus pacientus. Lai pieņemtu lēmumu par atbilstošu terapiju, klīnicistam jānovērtē pacienta mutāciju statuss saistībā ar citiem slimību ietekmējošiem faktoriem. Lēmumu par ārstēšanas veidu vēža slimniekiem nevajadzētu pieņemt, pamatojoties tikai uz informāciju par K-RAS mutāciju statusu. 2. Testa kopsavilkums un paskaidrojums K-RAS komplekts ir diagnostiska ierīce ar CE marķējumu, atbilstoša Eiropas Savienības in vitro diagnostikas medicīnisko ierīču direktīvai 98/79/EK. K-RAS onkogēna mutācijas tiek bieži atklātas cilvēka ļaundabīgajos audzējos (l-4). Šo mutāciju esamība korelē ar atbildes trūkumu pret atsevišķu EGFR inhibitoru vēža terapijām metastātiska kolorektālā vēža slimniekiem (5-10)(14-21). K-RAS gēna septiņu mutāciju noteikšana iespējama, salīdzināšanai izmantojot savvaļas tipa genoma DNS fonu reāllaika polimerāzes ķēdes reakcijas (Polymerase Chain Reaction PCR, turpmāk PĶR) pārbaudē, pamatojoties uz DxS Scorpions tehnoloģiju. Šī metode ir ļoti selektīva. Pieņemot, ka ir pietiekami daudz DNS kopiju, ir iespējams noteikt aptuveni 1% mutanta gēnu uz savvaļas tipa genoma DNS fona. K-RAS komplekts nosaka septiņas K-RAS mutācijas K-RAS onkogēna 12. un 13. kodonā, kā norādīts 1. tabulā. 3. lpp. no 39

4 1. tabula. K-RAS mutāciju noteikšana ar DxS komplektu Vēža somatisko mutāciju ID ir ņemti no Vēža somatisko mutāciju kataloga COSMIC (Catalogue of Somatic Mutations in Cancer). Mutācija Bāzes izmaiņas Vēža somatisko mutāciju ID Gly12Ala (GGT>GCT) 522 Gly12Asp (GGT>GAT) 521 Gly12Arg (GGT>CGT) 518 Gly12Cys (GGT>TGT) 516 Gly12Ser (GGT>AGT) 517 Gly12Val (GGT>GTT) 520 Gly13Asp (GGC>GAC) Tehnoloģiskie principi K-RAS komplekts apvieno divu veidu tehnoloģijas, ARMS un Scorpions (11, 12, 13), lai noteiktu mutācijas reāllaika PĶR pārbaudēs. ARMS ARMS veic alēļu vai mutācijai specifisko amplifikāciju. Taq (thermus aquaticus) DNS polimerāze ir īpaši efektīva PĶR praimera 3' gala atbilstības vai neatbilstības noteikšanā. Specifiskām mutāciju sekvencēm var veikt selektīvu amplifikāciju pat tādos paraugos, kuros vairākums sekvenču notiek bez mutācijām: Ja praimeris ir pilnīgi atbilstīgs, amplifikācija notiek pilnā apjomā. Ja 3' bāze ir neatbilstīga, notiek tikai zema līmeņa fona amplifikācija. Scorpions Amplifikācijas noteikšana tiek veikta ar Scorpions palīdzību. Scorpions ir bifunkcionālas molekulas, kas satur zondei kovalenti piesaistītu PĶR praimeri. Fluorofors zondē mijiedarbojas ar zondē esošo dzēsēju, tādējādi samazinot fluorescenci. PĶR reakcijas laikā, zondei saistoties ar amplikonu, fluorofors un dzēsējs tiek atdalīti. Tas izraisa pastiprinātu reakcijas stobriņa fluorescenci. Datu analīze: Ct metode Scorpions reāllaika pārbaudes ietver vairākus PĶR ciklus, kas nepieciešami, lai noteiktu fluorescences signālu, kas izceļas uz fona līmeņa, un reakcijas sākumā varētu konstatēt esošās mērķa molekulas. Punktu, pie kura tiek noteikts signāls, kas izceļas virs fona līmeņa fluorescences, sauc par cikla slieksni (Cycle threshold Ct). Parauga Ct vērtību aprēķina kā starpību starp mutāciju noteikšanas pārbaudes Ct un kontrolpārbaudes Ct no tā paša parauga. Paraugi tiek klasificēti kā pozitīvi attiecībā pret mutāciju, ja tajos noteiktā Ct vērtība pārbaudē nesasniedz 1% Ct vērtību. 4. lpp. no 39

5 Ja šī vērtība ir lielāka, tas liecina, ka vai nu satur mazāk nekā 1% mutāciju (ir ārpus pārbaudes robežām), vai arī ir negatīvs attiecībā pret mutācijām. Lietojot ARMS praimerus, dažos gadījumos var notikt neefektīva piesaiste, dodot ļoti vēlu fona Ct no DNS, kas nesatur mutāciju. Visas Ct vērtības, kas aprēķinātas, veicot fona amplifikāciju, ir lielākas par 1% no Ct vērtībām, un tiek klasificēts kā negatīvs attiecībā pret mutāciju. K-RAS komplekts ir in vitro diagnostiska ierīce ar CE marķējumu lietošanai vai nu Roche Diagnostics sistēmā LightCycler 480 Real-Time PCR System (Instrument II) (LightCycler 480 Instrument) 96 bedrīšu formātā ar Roche detaļas numuru vai sistēmā Applied BioSystems 7500 Real-Time PCR System ar detaļas numuru (ABI7500). Izmantojot sistēmu LightCycler 480 Instrument, K-RAS komplekts ir jālieto kopā ar programmatūru LightCycler Adapt Software v1.1, kas paredzēta TheraScreen K-RAS Mutation Kit CE-IVD (LightCycler Adapt Software). Šī programmatūra ir izstrādāta pozitīvas vai negatīvas amplifikācijas apgabala automatizētai noteikšanai, un tā aprēķina atbilstošu slieksni Ct vērtību iegūšanai. Tās izmanto to parauga Ct vērtību aprēķināšanai, kuras salīdzina ar 1% atskaites vērtībām. Programmatūra paziņo par pozitīvu vai negatīvu mutācijas rezultātu un novērš jebkādas subjektivitātes izpausmes K-RAS komplekta datu analīzē un interpretācijā. K-RAS komplekta formāts K-RAS komplektā ir ietvertas astoņas pārbaudes: viena kontrolpārbaude; septiņas mutāciju pārbaudes. Visi reakciju maisījumi satur eksogēnās kontroles (iekšējās kontroles) pārbaudi ar HEX marķējumu (lai to varētu noteikt JOE detektorā ar sistēmu ABI7500). Tā nosaka inhibitoru klātbūtni, kas var izraisīt nepatiesi negatīvu rezultātu iegūšanu. Kontrolpārbaude Kontrolpārbaude, marķēta ar FAM, tiek lietota, lai novērtētu parauga kopējo DNS. Kontrolpārbaudē tiek veikta K-RAS gēna 4. eksona reģiona amplifikācija. Praimeri un zonde ir izstrādāti tā, lai izvairītos no visiem zināmajiem K-RAS polimorfismiem. Mutāciju pārbaudes Katra mutāciju noteikšanas pārbaude, marķēta ar FAM, satur vienu Scorpion praimeri un vienu ARMS praimeri, lai reāllaika PĶR pārbaudē būtu iespējams nošķirt savvaļas tipa DNS no mutācijas DNS. 5. lpp. no 39

6 4. Reaģenti Šajā K-RAS komplektā ir pietiekams reaģentu daudzums paraugu kvalitātes novērtēšanai un K-RAS pārbaužu veikšanai līdz pat 20 vai 80 reakcijās atkarībā no komplekta lieluma. Komplekta lielums DxS preces kods Roche Diagnostics pasūtījuma numurs 20 reakcijas KR reakcijas KR Paraugu skaits, kuriem var izdarīt testu, ir atkarīgs no parauga paketes lieluma. 2. tabula. K-RAS komplekta sastāvs Nodrošinātie reaģenti 20 reakcijas 80 reakcijas Stobriņš Tilpums Tilpums Kontrolreakcijas maisījums 1300 µl 5200 µl 1 12ALA reakcijas maisījums 650 µl 2600 µl 2 12ASP reakcijas maisījums 650 µl 2600 µl 3 12ARG reakcijas maisījums 650 µl 2600 µl 4 12CYS reakcijas maisījums 650 µl 2600 µl 5 12SER reakcijas maisījums 650 µl 2600 µl 6 12VAL reakcijas maisījums 650 µl 2600 µl 7 13ASP reakcijas maisījums 650 µl 2600 µl 8 Standarta maisījums 300 µl 1000 µl 9 Taq DNS polimerāze 60 µl 240 µl 10 Aprīkojums un reaģenti, kas nav iekļauti K-RAS komplektā Lietotājam nepieciešams šāds aprīkojums un patēriņa preces: Ierīce LightCycler 480 Instrument vai ABI7500 Real-time PCR Machine (reāllaika PĶR mašīna), kas var veikt 9. sadaļā K-RAS mutāciju noteikšanas protokolā aprakstīto ciklēšanu. Programmatūra Roche Diagnostics LightCycler Adapt Software v1.1 (kataloga nr ). 0,2 ml DNS-āzi nesaturošas PĶR plates (LightCycler 480 Instrument Multiwell Plate 96 (kataloga numurs ) vai ABI MicroAmp Optical 96-well reaction Plate (96 bedrīšu reakcijas plate) (detaļas numurs ) ar līmplēvi MicroAmp Optical Adhesive Film (detaļas numurs )). Sterili stobriņi pamata maisījumu pagatavošanai. Speciālas pipetes PĶR maisījuma pagatavošanai. Speciālas pipetes DNS šablona izdalīšanai. Sterils, nukleāzi nesaturošs H 2 O. 6. lpp. no 39

7 5. BRĪDINĀJUMI UN PIESARDZĪBAS PASĀKUMI Paredzēts in vitro diagnostiskai. K-RAS komplekts nav paredzēts, lai veiktu kāda veida vēža, ieskaitot kolorektālā vēža, skrīningu vai diagnosticēšanu. Tas ir paredzēts lietošanai papildus citiem pašlaik izmantotajiem prognostiskajiem līdzekļiem, lai noteiktu pacientus, kuriem anti-egfr pretvēža terapija varētu nebūt efektīva. Vēža pacientu terapijas izvēle nedrīkst pamatoties tikai uz informāciju par K-RAS gēna mutāciju statusu. Klīnicistam ir jāizvērtē pacienta mutāciju statuss kopā ar citiem slimību ietekmējošiem faktoriem. K-RAS komplekta saturu drīkst sasaldēt un atkausēt līdz pat 8 reizēm, neizraisot nelabvēlīgu ietekmi uz pārbaudes norisi. NESASALDĒJIET UN NEATKAUSĒJIET K-RAS komplekta reaģentus vairāk par 8 reizēm. Ievērojiet, ka audzēja paraugi ir nehomogēni, un dati, kas iegūti no audzēja parauga, var atšķirties no datiem par citām tā paša audzēja daļām. Audzēja paraugi var saturēt arī vēža neskartus audus. Nav paredzams, ka DNS no audiem, kas nav audzēja audi, varētu saturēt K-RAS mutācijas, kuras var noteikt ar K-RAS komplektu. Visās K-RAS komplekta pārbaudēs tiek iegūti neliela izmēra PĶR produkti. Tomēr K-RAS komplektu nevar izmantot ar sevišķi sīki fragmentētu DNS. DNS novērtējums jāveic, pamatojoties uz PĶR, un tas var atšķirties no daudzuma noteikšanas pēc optiskā blīvuma rādījumiem. Komplektā ir iekļauts papildu kontrolreakcijas maisījums, kas ļauj veikt paraugu DNS kvalitātes un kvantitātes novērtējumu pirms K-RAS komplekta izmantošanas. K-RAS komplekta reaģenti ir optimāli atšķaidīti. Reaģenta papildu atšķaidīšana nav ieteicama, jo var mazināt to veiktspēju. Nav ieteicams izmantot par 25 µl mazāku reakcijas materiālu daudzumu, jo tas palielina nepatiesi negatīvu rezultātu iegūšanas risku. Visu K-RAS komplekta reaģentu sastāvs ir īpaši izstrādāts lietošanai norādītajos testos. Lai nodrošinātu optimālu K-RAS komplekta veiktspēju, nav ieteicams aizstāt tā reaģentus. Lai nodrošinātu optimālu aktivitāti un veiktspēju, Scorpions praimeri (tāpat kā visas fluorescenti marķētās molekulas) ir jāsargā no gaismas, nepieļaujot fotoķīmisku noārdīšanos. Ievērojiet īpašu piesardzību, lai nepieļautu piesārņošanu ar sintētisko kontroles materiālu PĶR reakciju laikā. Reakcijas maisījumu sagatavošanai un DNS šablona pievienošanai ieteicams lietot atsevišķas īpaši šim nolūkam paredzētas pipetes. 7. lpp. no 39

8 Reakcijas maisījumu sagatavošana un nodalīšana jāveic atsevišķā darba zonā, kura ir atdalīta no vietas, kurā notiek šablona pievienošana. Pēc PĶR reakcijas stobriņus nekādā gadījumā nedrīkst atvērt. Katrai K-RAS komplektā iekļautajai pārbaudei ir savas unikālas īpašības. Rezultātu aprēķini jāveic, izmantojot pareizus pārbaudes parametrus (sk. sadaļu Ziņojuma/datu interpretēšana ). Mutāciju Ct vērtības, kas ir vienādas ar 38 vai lielākas, jāvērtē kā negatīvs rezultāts vai kā rezultāts ārpus komplekta noteikšanas robežām. Papildus veicamajai reakcijai mutāciju noteikšanas pārbaudes satur eksogēnu kontrolreakciju (iekšējo kontroli) (sk. sadaļu Tehnoloģiskie principi ). Ja abas pārbaudes izrādās nederīgas, datus nedrīkst izmantot, jo iespējama inhibitoru klātbūtne, kas var izraisīt nepatiesi negatīvus rezultātus. Inhibitoru ietekmi var mazināt, atšķaidot paraugu, bet ir svarīgi atcerēties, ka tādējādi tiek atšķaidīta arī DNS. Jāievēro vispārīgie laboratorijas darba piesardzības pasākumi, tostarp, bet ne tikai, šādi: a) neievelciet materiālu pipetē ar muti; b) nesmēķējiet, neēdiet un nedzeriet vietās, kur darbojaties ar paraugiem vai komplekta reaģentiem; c) nomazgājiet rokas pēc testa veikšanas. Lietojiet tikai komplektā pieejamo Taq polimerāzi (Taq), neaizstājiet to ar Taq no tāda paša vai cita veida komplektiem vai ar cita piegādātāja Taq. Atkausējiet tikai tos reaģentus, kuri nepieciešami konkrētās darbības veikšanai, neatkausējiet katru reizi visu komplektu, lai samazinātu sasaldēšanas/atkausēšanas ciklu daudzumu. Informācija par drošību Uzmanību! Visas ķimikālijas un bioloģiskais materiāls ir jāuzskata par potenciāli kaitīgiem. Paraugi var izraisīt infekcijas, tāpēc, tos izmantojot, ir jāievēro atbilstoši drošības pasākumi. Ar K-RAS komplektu drīkst rīkoties tikai tie darbinieki, kas ir apmācīti atbilstošu laboratorijas procedūru veikšanā. Strādājot ar K-RAS komplekta sastāvdaļām, vienmēr valkājiet piemērotu laboratorijas virsvalku, vienreizējās lietošanas cimdus un aizsargbrilles. Pēc lietošanas K-RAS komplekta sastāvdaļas ir jāiznīcina kā klīniskie atkritumi. 8. lpp. no 39

9 6. Uzglabāšana, stabilitāte un transportēšanas nosacījumi Uzglabāšana Visas K-RAS komplekta sastāvdaļas nekavējoties pēc tā saņemšanas jāievieto saldētavā ar nemainīgu temperatūru no -18 C līdz -25 C un tumsā. Izvairieties no nevajadzīgas K-RAS komplekta sastāva sasaldēšanas un atkausēšanas. Stabilitāte Nelietojiet K-RAS komplektu pēc noteiktā derīguma termiņa beigām. K-RAS komplekta saturs saglabā stabilitāti līdz derīguma termiņa beigām, ja vien tiek uzglabāts atbilstoši norādījumiem un oriģinālajā iepakojumā. K-RAS komplekta saturu drīkst sasaldēt un atkausēt līdz pat 8 reizēm, neizraisot nelabvēlīgu ietekmi uz pārbaudes norisi. NESASALDĒJIET UN NEATKAUSĒJIET K-RAS komplekta reaģentus vairāk par 8 reizēm. Transportēšanas nosacījumi K-RAS komplekta saturs jātransportē uz sausā ledus, un saņemšanas brīdī tam joprojām jābūt sasaldētam. Ja saņemot K-RAS komplekts nav sasaldēts, tā ārējais iepakojums ir bojāts transportēšanas laikā, sūtījums nesatur pavadzīmi, lietošanas pamācību vai reaģentus, lūdzu, sazinieties ar vietējo Roche Diagnostics biroju. Kontaktinformāciju skatiet 12. sadaļā Tehniskais atbalsts. 7. Ierīce Pilna apjoma instrukcijas par reāllaika PĶR ierīces uzstādīšanu un lietošanu atrodamas ierīces lietotāja rokasgrāmatā. 8. Paraugi Parauga materiālam jābūt cilvēka genoma DNS, izdalītai no formalīnā apstrādātiem parafīnā ieguldītiem kolorektālā vēža audu paraugiem. Parauga paņemšana un sagatavošana 1. Parauga transportēšana: patoloģiskā materiāla standarta transportēšanas metodes parauga kvalitātes nodrošināšanai. 2. Ieteicamais parauga ekstrakcijas process: DNS ekstrakcija, izmantojot Qiagen QIAamp DNA FFPE audu komplektu (kataloga nr ). Ir jāievēro šādi Qiagen protokola labojumi: FFPE daļas ir jāsavāc uz stikla priekšmetstikliņiem. Pārpalikušais parafīns ap audu daļām ir jānokasa ar nelietotu sterilu skalpeli. Nokasiet audu daļas materiālu un ieberiet to mikrocentrifūgas stobriņos, izmantojot nelietotu skalpeli katram ekstrakcijai paredzētajam paraugam. Sašķelšana ar proteināzi K ir jāturpina līdz procesa pabeigšanai. Tas var ilgt līdz pat 48 stundām. 9. lpp. no 39

10 Paraugi ir jāizskalo ar 200 µl ATE bufervielas, kas ir iekļauta Qiagen ekstrakcijas komplektā. Citas alternatīvas paraugu sagatavošanas metodes ir jāapstiprina galapatērētājam. 3. Ekstrahētās DNS uzglabāšana: pirms analīzes veikšanas uzglabāt -20 C temperatūrā. Parauga novērtēšanas protokols Lai novērtētu parauga kopējo DNS, jāizmanto K-RAS komplektā iekļautais papildu kontrolpārbaudes maisījums. Kontrolpārbaudē tiek veikta K-RAS gēna 4. eksona reģiona amplifikācija. Paraugi ir jāsagatavo tikai ar kontrolpārbaudi, izmantojot standarta maisījumu kā pozitīvo kontroles vielu un ūdeni kā nešablona kontroles vielu. Ievērojiet, ka optimālas K-RAS komplekta reaģentu izmantošanas nolūkā paraugi ir jāapstrādā paketēs. Visos eksperimentālajos procesos ir jāiekļauj kontroles. Ja paraugi tiek testēti atsevišķi, tiek izlietots vairāk reaģentu un samazinās paraugu skaits, ko var pārbaudīt ar K-RAS komplektu. Parauga novērtēšanas protokols plates uzstādīšana 1. Istabas temperatūrā atkausējiet K-RAS komplekta kontrolreakcijas maisījumu un standarta maisījumu. Kad šķīdumi ir atkusuši, maisiet tos, 10 reizes apgriežot otrādi katru stobriņu, lai izvairītos no lokālas sāļu koncentrācijas. Sagatavojiet DNS paraugiem pietiekamu maisījumu daudzumu, vienu standarta maisījuma reakciju un vienu nešablona kontrolreakciju, kā arī vēl 2 papildu reakcijas. 2. Pamatmaisījuma pagatavošanai izmantojiet 3. tabulā norādīto reaģentu daudzumu reakcijai. 3. tabula. Kontrolpārbaudes pamatmaisījuma daudzums Pārbaude Pamatmaisījums Reakcijas Taq (µl)x1 maisījums (µl)x1 Kontrolpārbaude 19,8 0,2 3. NEVORTEKSĒJIET Taq vai jebkuru citu reakcijas maisījumu, kas satur Taq, jo tas var izraisīt enzīma inaktivāciju. 4. Pirms lietošanas pārbaudiet, vai Taq ir istabas temperatūrā. Centrifugējiet pudelīti, lai nodrošinātu, ka viss Taq ir sakrājies pudelītes apakšā, pēc tam ievelciet to pipetē, pipetes galiņu iegremdējot tieši zem Taq virsmas, lai samazinātu risku galiņam pārklāties ar lieko Taq. 5. Sajauciet pamatmaisījumu, to uzmanīgi ievelkot pipetē un izspiežot no tās. 6. Nekavējoties pievienojiet 20 µl kontroles pamatmaisījuma katrā reakcijas bedrītē. 10. lpp. no 39

11 7. Nekavējoties pievienojiet 5 µl parauga, standarta maisījuma vai ūdens (nešablona kontrolēm) reakcijas bedrītēs. 8. Plate ir jāuzstāda tā, lai standarta maisījums būtu pievienots bedrītei A1 un nešablona kontrole (ūdens) būtu pievienota A2. Visās pārējās izmantotajās bedrītēs ir jābūt paraugiem. 9. Noslēdziet un īsu brīdi centrifugējiet PĶR plati, lai reaģenti sakrātos bedrīšu pamatnēs. 10. Lai izvēlētos atbilstošu platformu, ievērojiet ierīces uzstādīšanas norādes. Parauga novērtēšanas protokols LightCycler 480 Instrument iestatīšana 1. Nekavējoties ievietojiet plati ierīcē LightCycler 480 Instrument. 2. Izvēlieties programmatūras LightCycler 480 Software ikonu ierīcei pieslēgtās darbstacijas darbvirsmā. Piereģistrējieties programmatūrā un ekrānā Overview izvēlieties New Experiment from Template. Darba šablonu sarakstā izvēlieties K-RAS LC480II Run Template. Šim šablonam ir šādi parametri: 1. Noteikšanas formāts ir DxS IVD Assays. 2. Reakcijas apjoms ir Sākotnējās turēšanas solis 95 C temperatūrā uz 4 minūtēm soļu amplifikācija 45 cikliem ar denaturāciju 95 C temperatūrā uz 30 sekundēm un saistīšanu 60 C temperatūrā uz 1 minūti. Fluorescences iegūšana ir vienreizēja iegūšana 60 C pakāpē. 3. Izvēlieties cilni Sample Editor un zem Step 1: Select Workflow atzīmējiet izvēles rūtiņu Abs Quant. Pārliecinieties, vai zem Select Filter Combinations ir atlasīti abi filtri ( nm un nm). Iestatiet paraugu nosaukumus 2. un 3. solī. Kvantifikācijas parauga tipa (Quantification Sample Type) iestatījumam ir jābūt unknown. Kopiju kolonna ir jāatstāj tukša. 4. Noklikšķiniet uz pogas Experiment un pēc tam uz pogas Start Run, lai saglabātu eksperimentu un sāktu ciklēšanu. 5. Pabeidzot darbu, logā Create New Analysis izvēlieties cilni Analysis un Abs Quant/2nd Derivative Max. Apstipriniet noklusējumus ekrānā Create New Analysis. Pārliecinieties, vai pogas Filter Comb iestatījums ir , un noklikšķiniet uz pogas Calculate. Ct vērtības tiek parādītas tabulā Samples. 11. lpp. no 39

12 6. Noklikšķiniet uz pogas Filter Comb un nomainiet filtrus uz nm. Noklikšķiniet uz pogas Calculate un iegūstiet eksogēnās kontroles Ct vērtības tabulā Samples. Parauga novērtēšanas protokols ABI7500 iestatīšana 1. Nekavējoties ievietojiet plati ierīcē ABI Izvēlieties programmatūras 7500 System Software ikonu ierīcei pieslēgtās darbstacijas darbvirsmā. Programmatūras 7500 Sequence Detection Software versijas 1.4 faila izvēlnē atveriet jaunu darba failu. 3. Zem Assay izvēlieties Standard Curve (Absolute Quantification). Zem Run Mode izvēlieties Standard Pārejiet uz detektora iestatīšanas logu, noklikšķinot uz pogas Next. Pievienojiet detektoru sarakstam detektoru FAM un JOE, izvēloties dzēsēju iestatījumu none. Ja šie detektori vēl nav izveidoti, noklikšķiniet uz pogas New Detectors un iestatiet detektoru FAM un JOE, izvēloties dzēsēju iestatījumu none. 5. Izvēlieties Passive Reference iestatījumu None un noklikšķiniet uz pogas Next. 6. Izvēlieties visu plati un atzīmējiet detektoru FAM un JOE izvēles rūtiņas, lai nodrošinātu, ka katrā bedrītē tiek kontrolētas abas krāsvielas. Noklikšķiniet uz pogas Finish. 7. Cilnē Instrument iestatiet ciklēšanu, kā norādīts 4. tabulā. 4. tabula. ABI7500 ciklēšanas apstākļi Temperatūra Laiks Cikli Iegūtie dati 1. pakāpe 95 C 4 min pakāpe 95 C 30 sek. 60 C 1 min. 40 FAM, JOE 8. Noklikšķiniet uz pogas Start, lai saglabātu eksperimentu un sāktu ciklēšanu. 9. Pabeidzot darbu, pārliecinieties, vai bedrīšu pārbaudes ekrānā pasīvā references iestatījums ir none'. Amplifikācijas shēmas cilnē atlasiet visas lietotās bedrītes un detektora nolaižamajā sarakstā izvēlieties JOE krāsvielu. 10. Pārbaudiet no katra parauga saņemto JOE signālu un salīdziniet to ar JOE signālu NTC bedrītē. Atzīmējiet visus paraugus, kuriem ir vēlāks amplifikācijas grafiks vai nav izdevusies eksogēnās kontroles amplifikācija salīdzinājumā ar NTC. 12. lpp. no 39

13 11. Amplifikācijas shēmas cilnē atlasiet visas lietotās bedrītes un detektora nolaižamajā sarakstā izvēlieties FAM krāsvielu. Lietojiet automātisko bāzlīnijas iestatījumu un manuālo Ct un pēc tam manuāli uzstādiet slieksni eksponenciālās fāzes vidū, lietojot logaritmisko skalu Y asij, kā aprakstīts ABI7500 lietotāja rokasgrāmatā. 12. Lai iegūtu Ct vērtības, noklikšķiniet uz pogas Analyse. Parauga novērtējuma interpretēšana Novērtējiet NTC Ct vērtības, lai nodrošinātu, ka FAM kanālā nav piesārņojuma, kas dod pozitīvu amplifikāciju (Ct mazāks par 40), vai HEX kanālā nav neizdevusies eksogēna kontrolreakcija (nav Ct), kas norāda uz iestatījumu problēmu. Standarta maisījumam ir jāparāda kontrolpārbaudes Ct (FAM kanāla) vērtība ierīcē ABI7500 un 29 ierīcē LightCycler 480 Instrument. Datus nedrīkst izmantot, ja nav izdevusies kāda no šīm divām darba kontrolēm. Kontrolpārbaudes Ct 29 35: interpretējiet piesardzīgi, jo ļoti zema līmeņa mutācijas, iespējams, netiek konstatētas. Kontrolpārbaudes Ct 35 38: šādos paraugos ir tikai dažas amplificējamas DNS kopijas, un mutācijas varētu konstatēt tikai tādā gadījumā, ja mutācija notiek lielākajā daļā kopiju. Kontrolpārbaudes Ct 38: nepieņemiet paraugu, jo tajā ir minimāls DNS daudzums un K-RAS komplekts nevarēs konstatēt mutācijas. Ievērojiet: ja uzrāda vēlu kontrolpārbaudes Ct, tad šī parauga eksogēnās kontroles Ct ir jāsalīdzina ar NTC eksogēnās kontroles rezultātiem. Ja parauga eksogēnās kontroles rezultāts ir aizkavēts vai negatīvs, salīdzinot ar NTC, tajā var būt inhibitors. Inhibitora ietekmi var samazināt, paraugu atšķaidot, lai gan tas atšķaidīs arī DNS. Parauga atšķaidīšana. Kontroles Ct, kas ir <24, pārslogos mutāciju pārbaudes. Paraugi, kuru kontroles Ct ir <24, ir jāatšķaida. Ievērojiet, ka ierīcē LightCycler 480 Instrument ar 2. atvasināšanas metodi iegūtās Ct vērtības var nedaudz atšķirties no tām vērtībām, kas iegūtas ar programmatūru LightCycler Adapt Software. Ir ieteicams atšķaidīt koncentrētus paraugus, lai tie būtu robežās no >24 līdz <29 (Ct vērtības programmatūrā 7500 Sequence Detection Software vai LightCycler 480 Instrument Software), pieņemot, ka atšķaidīšana ½ palielina Ct vērtību par K-RAS mutāciju noteikšanas protokols Rūpīgi izlasiet šo pamācību un iepazīstieties ar visām K-RAS komplekta sastāvdaļām pirms tā lietošanas. Lai varētu lietderīgi izmantot K-RAS komplektu, paraugi ir jāsagrupē paketēs pa 10 paraugiem katrā (lai aizpildītu vienu 96 bedrīšu plati). Mazākas paketes nozīmē to, ka ar K-RAS komplektu var pārbaudīt mazāk paraugu. 13. lpp. no 39

14 Ierīces LightCycler 480 Instrument eksperimentālā iestatīšana Katram DNS paraugam kontroles un mutāciju pārbaude ir jāanalizē vienas un tās pašas PĶR laikā, lai izvairītos no variācijām dažādās reakcijās. 1. Istabas temperatūrā atkausējiet K-RAS komplekta reakcijas maisījumus un standarta maisījumu. Kad šķīdumi ir atkusuši, samaisiet tos, 10 reizes apgriežot otrādi katru stobriņu, lai izvairītos no lokālas sāļu koncentrācijas. Sagatavojiet pietiekamu daudzumu maisījumu DNS paraugiem, standarta maisījumu un nešablona kontroles, kā arī 2 papildu reakcijas katram maisījumam, kā norādīts 5. tabulā. 5. tabula. K-RAS pamatmaisījumu daudzums Pārbaude Kontrolpārbaude Mutāciju pārbaudes Reakcijas maisījums (µl)x1 Pamatmaisījumi Reakcijas Taq (µl)x1 maisījums (µl) platē (x14) Taq (µl) platē (x14) 19,8 0,2 277,2 2,8 19,8 0,2 277,2 2,8 2. NEVORTEKSĒJIET Taq vai jebkuru citu reakcijas maisījumu, kas satur Taq, jo tas var izraisīt enzīma inaktivāciju. 3. Pirms lietošanas pārbaudiet, vai Taq ir istabas temperatūrā. Centrifugējiet pudelīti, lai nodrošinātu, ka viss Taq ir sakrājies pudelītes apakšā, pēc tam ievelciet to pipetē, pipetes galiņu iegremdējot tieši zem Taq virsmas, lai samazinātu risku galiņam pārklāties ar lieko Taq. 4. Sajauciet pamatmaisījumus, tos uzmanīgi ievelkot pipetē un izspiežot no tās. 5. Nekavējoties pievienojiet 20 µl pamatmaisījumu reakcijas bedrītēs. 6. Nekavējoties pievienojiet 5 µl parauga, standarta maisījuma vai ūdens (nešablona kontrolēm) reakcijas bedrītēs. Katrs DNS jāpārbauda gan ar kontroles, gan visām mutāciju noteikšanas pārbaudēm. Plates uzstādījums ir norādīts 6. tabulā. 14. lpp. no 39

15 6. tabula. K-RAS komplekta plates izkārtojums 96 bedrīšu plate Pārbaude A Standarta NTC maisījums Kontrole B 12ALA C 12ASP D 12ARG E 12CYS F 12SER G 12VAL H 13ASP Standarta 1. NTC maisījums Standarta 1. NTC maisījums Standarta 1. NTC maisījums Standarta 1. NTC maisījums Standarta 1. NTC maisījums Standarta 1. NTC maisījums Standarta 1. NTC maisījums Noslēdziet un īsu brīdi centrifugējiet PĶR plati, lai reaģenti sakrātos bedrīšu pamatnēs. 8. Nekavējoties ievietojiet plati ierīcē LightCycler 480 Instrument. Ierīces LightCycler 480 Instrument iestatīšana 1. Izvēlieties ierīces LightCycler 480 Instrument programmatūras ikonu ierīcei pieslēgtās darbstacijas darbvirsmā. Piereģistrējieties programmatūrā un apskata lapā izvēlieties New Experiment from Template. 2. Darba šablonu sarakstā izvēlieties K-RAS LC480II Run Template (papildinformāciju skatiet sadaļā par ierīces LightCycler 480 Instrument paraugu novērtēšanu). 3. Izvēlieties cilni Sample Editor un zem Step 1: Select Workflow atzīmējiet izvēles rūtiņu Abs Quant. Pārliecinieties, vai zem Select Filter Combinations ir atlasīti abi filtri ( nm un nm). Iestatiet paraugu nosaukumus 2. un 3. solī. 1. kolonnā parauga nosaukumam jābūt Mixed Standard. 2. kolonnā parauga nosaukumam jābūt NTC. No 3. līdz 12. kolonnai ir jāievada paraugu nosaukumi. Visu 1. kolonnā esošo bedrīšu nosaukumiem ir jābūt vienādiem. Kvantifikācijas parauga tipa iestatījumam ir jābūt unknown. Kopiju kolonna ir jāatstāj tukša, jo programmatūrā LightCycler Adapt Software kopijas netiek ņemtas vērā. 4. Noklikšķiniet uz pogas Experiment un pēc tam uz pogas Start Run, lai saglabātu eksperimentu un sāktu ciklēšanu. 15. lpp. no 39

16 Ierīces LightCycler 480 Instrument paraugu analīze 1. Pabeidzot darbu ierīces LightCycler 480 Instrument navigatora logā, eksportējiet eksperimentu (.ixo failu) uz atbilstošu atrašanās vietu, kurai var piekļūt ar programmatūru LightCycler Adapt Software. 2. SVARĪGI! Programmatūra LightCycler Adapt Software ir apstiprināta izmantošanai viena datora sistēmā, ko dēvē par vienu kontroles vienību (darbstaciju), kuru Roche Diagnostics nodrošina lietošanai ar vienu ierīci LightCycler 480 Instrument II. Šis programmatūras LightCycler Adapt Software apstiprinājums pašlaik attiecas tikai uz tādu kontroles vienību, kas ir atsevišķs dators (t.i., nav tīkla daļa). Cita datora izmantošana ir aizliegta, jo programmatūra var nedarboties paredzētajā veidā. 3. Atveriet programmatūru LightCycler Adapt Software, noklikšķinot uz ikonas LightCycler Adapt Software darbstacijas darbvirsmā, un aizpildiet lietotājvārda lauku. Šis vārds tiek reģistrēts kā ziņojuma autors. 4. Galvenajā logā izmantojiet pārlūkprogrammas pogu, lai izvēlētos vienu ierīces LightCycler 480 Instrument darba failu (lai atsauktu izvēlni, programma ir jāaizver un atkal jāatver). 5. Izvēlieties ziņojuma veidu (pdf vai csv). Ja ir izvēlēts csv formāts, tad papildus tiek automātiski izveidota pdf versija. 6. Izvēlieties Analyse, lai izveidotu ziņojumu par rezultātiem. Ziņojums tiek automātiski saglabāts mapē, kurā atrodas darba fails, un tam tiek piešķirts tāds pats nosaukums kā darba failam. 7. Ziņojums tiek automātiski parādīts. 8. Ziņojumā iekļautie rezultāti tiek parādīti tabulas Sample Result Table kolonnā Mutation Status. Programmatūras LightCycler Adapt Software ziņojuma interpretēšana 1. Programmatūras LightCycler Adapt Software ziņojumā ir ietverta vispārīga informācija par analīzi Ziņojuma autors ir persona, kas ir izmantojusi šo programmatūru un izveidojusi ziņojumu Analīzei tiek piešķirts datums un laiks. 2. Ziņojums sniedz analīzes pārskatu, norādot izmantotā darba faila nosaukumu, algoritma definīcijas failu un algoritmu secību. Algoritmu dati ir fiksēti un tos nevar mainīt. 3. Rezultātu sadaļā ir sīkāk norādīts ierīces LightCycler 480 Instrument darba faila pilnais nosaukums un ceļš, kā arī šāda informācija: 3.1. Ierīces LightCycler 480 Instrument sērijas numurs Instrument Name LightCycler 480 Instrument programmatūrā ierīcei LightCycler 480 Instrument piešķirtais identifikators. 16. lpp. no 39

17 3.3. Run Date ierīces LightCycler 480 Instrument darba datums un laiks Run Operator tās personas vārds, kas bija piereģistrējusies LightCycler 480 Instrument programmatūrā, kad tika veikts eksperiments Experiment Name darba faila nosaukums Software Version ierīcē LightCycler 480 Instrument lietotās programmatūras versija Lot Number tiek iegūts no LightCycler 480 Instrument programmatūras eksperimenta iestatīšanas ekrāna lauka Lot No. 4. Plates izkārtojumā ir norādīti paraugu nosaukumi, kurus iegūst no LightCycler 480 Instrument programmatūras paraugu rediģēšanas ekrāna. 5. Tiek nodrošināts izpildes rezultāta kopsavilkums Run Summary Result, kurā izpilde tiek norādīta kā derīga (Valid) vai nederīga (Invalid). Tas ir atkarīgs no 1. un 2. kolonnā ietvertajām darba kontrolēm. 6. Darba kontroles 6.1. Programmatūra LightCycler Adapt Software automātiski aprēķina standarta maisījuma Ct vērtību pēc šādas formulas: Mutāciju Ct Kontroles Ct = Ct 6.2. Programmatūra LightCycler Adapt Software šīs vērtības salīdzina ar 7. tabulā norādītajām plānotajām vērtībām. 7. tabula. Programmatūras LightCycler Adapt Software plānotās Ct vērtības Pārbaude Standarta maisījuma Ct 12ALA -0,61 12ASP -0,61 12ARG 0,34 12CYS -0,79 12SER -0,13 12VAL 0,1 13ASP -0, Tiek reģistrētas Ct un Ct vērtības. 17. lpp. no 39

18 6.4. Darba kontrolēm 1. un 2. kolonnā tiek norādīti šādi karodziņi/ brīdinājumi: 8. tabula. Darba kontroļu karodziņi/brīdinājumi programmatūrā LightCycler Adapt Software Karodziņi/brīdinājumi Nozīme CT_OUT_OF_RANGE Kontrolpārbaudes FAM Ct ir ārpus robežas EXO_FAIL Standarta maisījuma eksogēnās kontroles Ct ir <30 vai ir negatīvs, ja FAM rezultāts ir negatīvs DELTA_CT_OUT_OF_RANGE Mutācijas Ct vērtības ir ārpus noteiktās robežas EXO_CONTROL_INVALID NTC nav izdevusies eksogēnā kontrolreakcija TARGET_CHANNEL_INVALID NTC FAM reakcijai ir pozitīva Ct vērtība Sīkāks karodziņu/brīdinājumu nozīmes skaidrojums: CT_OUT_OF_RANGE maisījuma standarta kontrolpārbaudes Ct vērtībai ir jābūt 26,60 ± 2. Ja pārbaude ir ārpus šīm robežām, šis karodziņš/brīdinājums tiek parādīts visām standarta maisījuma bedrītēm, jo netiek aprēķinātas Ct vērtības, un standarta maisījums nav derīgs. Tas norāda, ka kontrolpārbaude nedarbojas pareizi EXO_FAIL šis karodziņš/brīdinājums tiek parādīts, ja eksogēnā kontrolpārbaude kādā no standarta maisījuma bedrītēm ir zemāka par 30, jo tas var nozīmēt, ka šajā maisījumā ir piesārņota PĶR. Gadījumā, ja neizdodas eksogēnā kontrolpārbaude, kad kādā no standarta maisījuma bedrītēm neizdodas FAM reakcija, tiek parādīts arī EXO_FAIL karodziņš/brīdinājums. Tas norāda, ka šajā pārbaudē ir problēma, kas var izraisīt nepatiesus negatīvus rezultātus. Standarta maisījums jau ir atzīts par nederīgu neizdevušās FAM dēļ DELTA_CT_OUT_OF_RANGE ja standarta maisījuma Ct vērtības ir ±2,00 robežās no 7. tabulā sniegtajām vērtībām, tad programmatūra reģistrē derīgu statusu. Ja Ct ir ārpus plānotās robežas, tad tā statuss tiek uzrādīts kā nederīgs un tiek parādīts šis karodziņš/brīdinājums. Tas norāda uz pārbaudes problēmu, kas var izraisīt nepatiesus rezultātus EXO_CONTROL_INVALID nešablona kontroles bedrītēs eksogēnai kontrolpārbaudei ir jāsniedz pozitīvs rezultāts visās 8 bedrītēs (Ct<41). Ja tiek iegūts negatīvs rezultāts, tiek parādīts šis karodziņš/brīdinājums un nederīgs statuss. Tas norāda uz šīs pārbaudes problēmu, kas var izraisīt nepatiesus rezultātus TARGET_CHANNEL_INVALID 8 nešablona kontroles bedrītēs ir jābūt negatīvam FAM rezultātam (Ct>38). Jebkāda amplifikācija norāda uz piesārņojumu. 18. lpp. no 39

19 Pozitīva rezultāta gadījumā tiek parādīts šis karodziņš/brīdinājums un nešablona kontrole tiek atzīta par nederīgu Ja kādai no standarta maisījuma bedrītēm vai nešablona kontroles bedrītēm ir nederīgs statuss, tad izpildes rezultāta kopsavilkums (Run Summary Result) ir Run Invalid (nederīga izpilde). Tabulā Sample Result Table tiek parādīti paraugu nosaukumi un kontroles Ct vērtības, bet mutācijas statuss tiek reģistrēts kā nederīgs (Invalid). Standarta maisījums norāda, ka visas pārbaudes darbojas pareizi. Ja izrādās, ka tas tā nav, tas var izraisīt nepatiesas pozitīvas vai nepatiesas negatīvas mutācijas nosaukšanu. Nešablona kontrole norāda, ka pamatmaisījumos nav piesārņojuma un eksogēnā kontrole darbojas kā paredzēts Ja programmatūra LightCycler Adapt Software tomēr izveido kļūdas ziņojumu, lūdzu, skatiet 12. sadaļu Tehniskais atbalsts. 7. Parauga rezultāti 7.1. Tabulā Sample Result Table tiek reģistrēti no LightCycler 480 Instrument programmatūras iegūtie paraugu nosaukumi un kontrolpārbaudes Ct vērtības Programmatūra LightCycler 480 Adapt Software aprēķina Ct vērtības un nosaka, vai ir pozitīvs vai negatīvs attiecībā pret mutācijām, pamatojoties uz 9. tabulā sniegtajām 1% robežvērtībām. 9. tabula. Programmatūras LightCycler Adapt Software 1% robežvērtības Pārbaude 1% Ct 12ALA 6,25 12ASP 7,72 12ARG 6,83 12CYS 6,95 12SER 8,95 12VAL 6,5 13ASP 9, Ja parauga mutāciju Ct vērtība ir mazāka par atbilstošo 1% Ct robežvērtību, tad šo paraugu sauc par pozitīvu attiecībā pret mutācijām. Programmatūra LightCycler Adapt Software paziņo, kura mutācija pastāv, bet tā ziņo tikai par vienu mutāciju. Ja ir 2 pozitīvas Ct vērtības, tiek reģistrēta mazākā vērtība. Tiek pieņemts, ka otrā vērtība ir izveidojusies viena mutāciju praimera, kas ir saistīts ar citu mutāciju un sakņojas tajā, krusteniskās reaktivitātes rezultātā. Retos gadījumos, kad ir atklāta dubulta mutācija, klīnicista lēmumam jābūt tādam pašam kā gadījumā, ja ir atklāta viena mutācija. 19. lpp. no 39

20 7.4. Ja parauga Ct vērtības ir lielākas par 1% Ct vērtībām, šāds tiek reģistrēts kā negatīvs attiecībā pret mutācijām (tajā var būt mutācija, bet tā ir tādā līmenī, kas sniedzas ārpus komplekta noteikšanas robežām) Karodziņi/brīdinājumi Programmatūra LightCycler Adapt Software parāda vairākus karodziņus/brīdinājumus attiecībā uz paraugiem tabulā Sample Result Table, kā aprakstīts 10. tabulā. 10. tabula. Programmatūras LightCycler Adapt Software paraugu karodziņi/brīdinājumi Karodziņš/brīdinājums Nozīme REP_DILUTION Kontroles Ct ir mazāks par 24 CONF_LEVEL Kontroles Ct ir lielāks par 28,9, un mutācijas nav reģistrētas LIMITED Kontroles Ct ir lielāks par 35 EXO_FAIL Eksogēnā kontrolpārbaude nav izdevusies, ja mutācijas reakcijā nav izdevusies arī FAM reakcija, vai eksogēnās kontroles Ct ir mazāks par 30 FAIL Programmatūra nevar nosaukt grafiku par pozitīvu vai negatīvu Detalizētāka karodziņu/brīdinājumu nozīme: REP_DILUTION kontroles Ct ir <24. Pārbaudes ir apstiprinātas tādam DNS līmenim, kas sniedz kontroles Ct vērtību 24 vai lielāku. Ja parauga kontrolpārbaudes Ct vērtība ir mazāka, tas ir jāatšķaida, lai nodrošinātu tā atbilstību derīgajam darba diapazonam CONF_LEVEL kontroles Ct ir >28,9. Negatīvam paraugam, kura kontroles Ct ir >28,9, tiek parādīts CONF_LEVEL karodziņš/brīdinājums. Mutācijas Ct vērtības tiek klasificētas kā negatīvas vai ārpus komplekta noteikšanas robežām, ja tās ir lielākas vai vienādas ar 38. Lai noteiktu 1% mutāciju, kontroles Ct vērtībai jābūt 28,9 vai mazākai, kas nodrošina pietiekamu DNS daudzumu, ja ir noteiktas 1% robežvērtības un Ct robežvērtība ir 38. Ja kontroles Ct ir lielāks par 28,9 un ir konstatēta mutācija, tiek uzrādīta pozitīva mutācija un šis karodziņš/brīdinājums netiek parādīts, jo attiecīgajam paraugam ir konkrēta mutācija. Tomēr, ja kontroles Ct ir virs 28,9 un izrādās negatīvs pret mutācijām, šis karodziņš/brīdinājums tiek parādīts, brīdinot, ka, iespējams, nav ievērotas zema līmeņa mutācijas. Kontroles Ct palielinoties virs 28,9, samazinās mutāciju noteikšanas jutība LIMITED kontroles Ct ir >35. Tas norāda, ka ir pieejams ļoti maz amplificējamās DNS. Līdz ar to var noteikt tikai lielā procentu daudzumā esošās mutācijas. 20. lpp. no 39

21 Ja pozitīvai mutācijai LIMITED paraugos Ct ir <38, šai mutācijai tik un tā tiek piešķirts derīgs statuss un tā tiek reģistrēta. Zema līmeņa mutāciju klātbūtni paraugā ar negatīvu rezultātu un LIMITED karodziņu/brīdinājumu nedrīkst neņemt vērā EXO_FAIL programmatūra pārbauda eksogēnās kontrolpārbaudes amplifikāciju, lai noskaidrotu, vai tajā ir inhibitors, kas var izraisīt nepatiesu negatīvu rezultātu. Tiek izmantots šāds loģisks pamatojums: a. Eksogēnās kontroles reakcija tiek novērtēta tikai mutāciju reakcijas bedrītēs, bet ne kontrolpārbaudes bedrītē, izņemot standarta maisījuma un NTC kolonnas (sk. 6. punktu) vai, ja eksogēnās kontroles Ct ir <30. b. Ja mutācija ir nosaukta par pozitīvu, bet attiecībā pret mutācijām pozitīvajā bedrītē eksogēnā kontrolpārbaude nav izdevusies, EXO_FAIL karodziņš/brīdinājums netiek parādīts, jo reakcijā var būt konkurējoša inhibīcija no FAM reakcijas. Mutāciju statuss ir derīgs. c. Ja paraugam vienā mutāciju bedrītē mutācija ir nosaukta par pozitīvu, bet eksogēnā kontrolpārbaude nav bijusi veiksmīga šī paša parauga citā mutāciju bedrītē, tiek nosaukta pirmajā bedrītē esošā mutācija un šis rezultāts ir derīgs. Tomēr tiek parādīts EXO_FAIL karodziņš/brīdinājums. Tas norāda, ka pastāv problēma ar pārbaudi eksogēna kontrolpārbaudes bedrītē un šajā bedrītē, iespējams, nav ievērota mutācija. Iespējams, ka nosauktā mutācija ir krusteniskā reaktivitāte starp pārbaudēm, nevis īsta neievērota mutācija. Tomēr mutācijas statuss pārbaudē, kurā ir reģistrēts pozitīvas mutācijas nosaukums, paliek spēkā, jo tajā ir atrasta skaidra mutācija, un klīniskais lēmums paliek tāds pats, neatkarīgi no tā, kāda mutācija ir atklāta. d. Ja ir nosaukts par negatīvu, bet kādā no mutāciju pārbaudēm nav izdevusies eksogēna kontrolreakcija, tiek parādīts EXO_FAIL karodziņš/brīdinājums un statuss ir nederīgs. Iespējams, ka nav ievērota kāda mutācija. e. Ja eksogēnās kontrolpārbaudes Ct ir <30 jebkurā no 8 bedrītēm, tiek parādīts EXO_FAIL karodziņš/brīdinājums un statuss ir nederīgs. Iespējams, ka šajā pārbaudē ir notikusi PĶR produkta piesārņošana. f. Varat apskatīt ierīces LightCycler 480 Instrument darba failu, lai noskaidrotu neizdevušos eksogēno kontrolpārbaužu iespējamo cēloni. 21. lpp. no 39

22 Ja kolonnā nav izdevušās visas eksogēnās kontrolreakcijas, tas var liecināt par inhibitora klātbūtni. Ja reakcija nav izdevusies tikai 1 bedrītē, tā var būt plates uzstādīšanas problēma FAIL FAIL karodziņš/brīdinājums tiek parādīts, ja programmatūra nevar noteikt, vai amplifikācijas grafiks ir pozitīvs vai negatīvs, piemēram, ja grafika forma ir anomāla Programmatūra LightCycler Adapt Software pārbauda, vai parauga nosaukums kolonnā ir identisks, lai nodrošinātu, ka mutāciju pārbaudes un kontrolpārbaudes Ct vērtības, kuras izmanto Ct vērtību aprēķināšanai, tiek ņemtas no attiecīgā parauga. Paraugu nosaukumus iegūst no ierīces LightCycler 480 Instrument parauga redaktora ekrāna eksperimenta darba failā. Ja kolonnā ir neatbilstības, programmatūra reģistrē SAMPLE MISMATCH (parauga neatbilstību) parauga rezultātu tabulas 'Sample Result Table' parauga nosaukuma kolonnā 'Sample Name'. Plates izkārtojumā programmatūra reģistrē parauga nosaukumu, pievienojot tam tekstu '(MISMATCH)' (neatbilstība). Ja tā ir drukas kļūda, tad nosaukumu var izlabot LightCycler 480 Instrument darba failā un datus var analizēt vēlreiz ar programmatūru LightCycler Adapt Software. ABI7500 eksperimentālā iestatīšana Katram DNS paraugam kontroles un mutāciju pārbaude ir jāanalizē vienas un tās pašas PĶR laikā, lai izvairītos no variācijām dažādās reakcijās. 1. Istabas temperatūrā atkausējiet K-RAS komplekta reakcijas maisījumus un standarta maisījumu. Kad šķīdumi ir atkusuši, samaisiet tos, 10 reizes apgriežot otrādi katru stobriņu, lai izvairītos no lokālas sāļu koncentrācijas. Sagatavojiet pietiekamu daudzumu maisījumu DNS paraugiem, standarta maisījumu un nešablona kontroles, kā arī 2 papildu reakcijas katram maisījumam, kā norādīts 11. tabulā. 11. tabula. K-RAS pamatmaisījumu daudzums Pārbaude Kontrolpārbaude Mutāciju pārbaudes Reakcijas maisījums (µl)x1 Pamatmaisījumi Reakcijas maisījums Taq (µl)x1 (µl) platē (x14) Taq (µl) platē (x14) 19,8 0,2 277,2 2,8 19,8 0,2 277,2 2,8 2. NEVORTEKSĒJIET Taq vai jebkuru citu reakcijas maisījumu, kas satur Taq, jo tas var izraisīt enzīma inaktivāciju. 22. lpp. no 39

23 3. Pirms lietošanas pārbaudiet, vai Taq ir istabas temperatūrā. Centrifugējiet pudelīti, lai nodrošinātu, ka viss Taq ir sakrājies pudelītes apakšā, pēc tam ievelciet to pipetē, pipetes galiņu iegremdējot tieši zem Taq virsmas, lai samazinātu risku galiņam pārklāties ar lieko Taq. 4. Sajauciet pamatmaisījumus, tos uzmanīgi ievelkot pipetē un izspiežot no tās. 5. Nekavējoties pievienojiet 20 µl pamatmaisījumu reakcijas bedrītēs. 6. Nekavējoties pievienojiet 5 µl parauga, standarta maisījuma vai ūdens (nešablona kontrolēm) reakcijas bedrītēs. Katrs DNS jāpārbauda gan ar kontroles, gan mutāciju noteikšanas pārbaudēm. Plates uzstādījums ir norādīts 12. tabulā. 12. tabula. ABI7500 K-RAS plates izkārtojums 96 bedrīšu plate Pārbaude A Standarta NTC maisījums Kontrole B Standarta NTC maisījums 12ALA C Standarta NTC maisījums 12ASP D Standarta NTC maisījums 12ARG E Standarta NTC maisījums 12CYS F Standarta NTC maisījums 12SER G Standarta NTC maisījums 12VAL H Standarta NTC maisījums 13ASP Noslēdziet un īsu brīdi centrifugējiet PĶR plati, lai reaģenti sakrātos bedrīšu pamatnēs. 8. Nekavējoties ievietojiet plati ierīcē ABI7500. Ierīces ABI7500 Instrument iestatīšana 1. Izvēlieties programmatūras 7500 System Software ikonu ierīcei pieslēgtās darbstacijas darbvirsmā. Programmatūras 7500 Sequence Detection Software versijas 1.4 faila izvēlnē atveriet jaunu darba failu. 2. Zem Assay izvēlieties Standard Curve (Absolute Quantification). Zem Run Mode izvēlieties Standard lpp. no 39

24 3. Pārejiet uz detektora iestatīšanas logu, noklikšķinot uz pogas Next. Pievienojiet detektoru sarakstam detektoru FAM un JOE, izvēloties dzēsēju iestatījumu none. Ja šie detektori vēl nav izveidoti, noklikšķiniet uz pogas New Detectors un iestatiet detektoru FAM un JOE, izvēloties dzēsēju iestatījumu none. 4. Izvēlieties Passive Reference iestatījumu None un noklikšķiniet uz pogas Next. 5. Izvēlieties visu plati un atzīmējiet detektoru FAM un JOE izvēles rūtiņas, lai nodrošinātu, ka katrā bedrītē tiek kontrolētas abas krāsvielas. Noklikšķiniet uz pogas Finish. 6. Cilnē Instrument iestatiet ciklēšanu, kā norādīts 13. tabulā. 13. tabula. ABI7500 ciklēšanas apstākļi Temperatūra Laiks Cikli Iegūtie dati 1. pakāpe 95 C 4 min pakāpe 95 C 30 sek. 60 C 1 min. 40 FAM, JOE 7. Noklikšķiniet uz pogas Start, lai saglabātu eksperimentu un sāktu ciklēšanu. ABI7500 parauga analīze 1. Pārliecinieties, vai bedrīšu pārbaudes ekrānā pasīvās references iestatījums ir none` (nav). 2. Pārliecinieties, vai katra bedrīte eksogēnajā kontrolpārbaudē dod JOE signālu. a. Ja eksogēnajā kontrolpārbaudē tiek iegūts pozitīvs rezultāts, turpiniet analīzi. b. Ja eksogēnā kontrolpārbaude nav izdevusies, bet FAM reakcija uzrāda spēcīgu amplifikāciju, turpiniet analīzi, jo FAM reakcija ir izkonkurējusi eksogēno kontrolreakciju. c. Ja neizdodas gan FAM, gan eksogēnās kontrolreakcijas, dati nav izmantojami, jo ir iespējama inhibitoru klātbūtne. Šie inhibitori var izraisīt nepatiesi negatīvu rezultātu noteikšanu. 3. Amplifikācijas shēmas cilnē atlasiet visas lietotās bedrītes un detektora nolaižamajā sarakstā izvēlieties FAM krāsvielu. Lietojiet automātisko bāzlīnijas iestatījumu un manuālo Ct un pēc tam manuāli uzstādiet slieksni eksponenciālās fāzes vidū, lietojot logaritmisko skalu Y asij, kā aprakstīts ABI7500 lietotāja rokasgrāmatā. 24. lpp. no 39

25 4. Analizējiet datus un aprēķiniet Ct vērtības šādi: [parauga mutācijas pārbaudes Ct] [parauga kontrolpārbaudes Ct] = Ct Lai atvieglotu analīzi, datus var eksportēt uz programmu Microsoft Excel. ABI7500 datu interpretēšana 1. Kontroles Ct vērtības: 1.1. Kontroles Ct vērtībai jābūt 24, lai izvairītos no pārbaudes pārslogošanas Kontroles Ct ir <29: K-RAS komplekts šajos paraugos spēj noteikt pat 1% mutāciju Paraugos, kuros kontroles Ct 29, komplekts nevar noteikt 1% mutāciju, tomēr tas var noteikt augstāka līmeņa mutācijas Ja kontroles Ct 35, paraugā ir tikai dažas amplificējamas DNS kopijas un mutācijas visdrīzāk var noteikt tikai tad, ja mutācijas notiek lielākajā daļā kopiju Ja kontroles Ct 38, DNS ir ierobežota un datus nedrīkst izmantot. 2. Standarta maisījuma Ct vērtības 2.1. Standarta maisījuma Ct vērtībām jābūt tādām, kā norādīts 14. tabulā, taču ir iespējamas ±2 novirzes atšķirīgu sliekšņa vērtību iestatījumu vai dažādu instrumentu dēļ. 14. tabula. ABI7500 standarta maisījuma Ct vērtības un 1% robežvērtību punkti Pārbaudes Standarta maisījuma Ct Standarta maisījuma pieļaujamais diapazons Parauga 1% Ct 12ALA -0,70 no -2,70 līdz 1,30 6,5 12ASP -1,04 no -3,04 līdz 0, ARG -0,02 no -2,02 līdz 1, CYS -0,98 no -2,98 līdz 1, SER 0,02 no -1,98 līdz 2, VAL -0,19 no -2,19 līdz 1,81 6,5 13ASP -1,12 no -3,12 līdz 0, Parauga Ct vērtības: 3.1. Ja parauga Ct vērtība ir lielāka par 1% vērtību (kā norādīts 14. tabulā), tad DNS tiek klasificēts kā negatīvs attiecībā pret mutācijām vai ārpus K-RAS komplekta noteikšanas robežām esošs Ja parauga Ct vērtība ir mazāka par 1% vērtību, DNS tiek klasificēts kā pozitīvs attiecībā pret mutācijām Mutāciju Ct vērtības, kas ir vienādas ar 38 vai lielākas, jāvērtē kā negatīvs rezultāts vai kā rezultāts ārpus komplekta noteikšanas robežām. 25. lpp. no 39

26 10. Testa ierobežojumi 1% mutāciju uz savvaļas tipa DNS fona noteikšanai parauga kontrolpārbaudes Ct ir jābūt <29 ierīcē ABI7500 un <28,9 ierīcē LightCycler 480 Instrument. Pārbaudēs nevar noteikt 1% mutācijas paraugos, kuru kontroles Ct vērtības ir lielākas, un, kontroles Ct pārsniedzot šīs vērtības, samazinās mutāciju noteikšanas jutība. Parauga DNS kontroles Ct vērtība ir atkarīga no PĶR noteiktās koncentrācijas. Pēc optiskā blīvuma nolasījumiem noteiktās vērtības neatbilst kontrolpārbaudes Ct vērtībām fragmentētas DNS paraugos. Tiek nodrošināts papildu kontrolreakciju maisījums, lai pirms komplekta lietošanas varētu novērtēt parauga Ct vērtību. Ja uzrāda rezultātu, kas ir pozitīvs attiecībā pret mutāciju, un mutācijas Ct vērtība ir 38, tad pārbaudes rezultāts ir jāvērtē kā negatīvs vai ārpus komplekta noteikšanas robežām esošs. To automātiski paveic programmatūra LightCycler Adapt Software. Dažkārt starp mutācijām novērojama signāla saņemšana no krusteniskas reaktivitātes. Piemēram, ja tiek novērots augsts 12ALA mutāciju līmenis, arī dažas citas mutāciju reakcijas varētu sniegt pozitīvu rezultātu. Tas ir tādēļ, ka ARMS praimeri konstatē citas mutācijas atsevišķās citu praimeru bāzēs. Sintētiska kontrolmateriāla gadījumā krusteniskās reaktivitātes signāls ABI7500 veido viegli nolasāmu šablonu, kas ļauj no vairākiem signāliem nošķirt patiesi pozitīvo rezultātu (sk. 15. tabulu). 15. tabula. No sintētiska kontrolmateriāla iegūts krusteniskās reaktivitātes signāla šablons ierīcē ABI7500 Jā norāda uz patiesu signālu. Skaitļi norāda aptuveno ciklu skaitu pēc patiesā signāla, kad iespējams saņemt signālu no krusteniskas reaktivitātes. Vērtības virs 9 cikliem nav norādītas, jo tās atrastos negatīvajā zonā. Pozitīvs 12ALA signāls 12ASP signāls 12ARG signāls 12CYS signāls 12SER signāls 12VAL signāls 13ASP signāls 12ALA Jā ASP 9 Jā ARG - - Jā CYS Jā SER Jā VAL Jā - 13ASP Jā Piezīme. Signāla veids, kas saņemts no krusteniskas reaktivitātes, var atšķirties dažādos DNS paraugos, piemēram, parafīnā ieguldītos DNS paraugos. K-RAS komplekts ir paredzēts vienas mutācijas noteikšanai DNS paraugā. Ja pārbaude norāda uz vēl vienu pozitīvu mutāciju, tas visdrīzāk ir signāls no krusteniskas reaktivitātes. 26. lpp. no 39