ETI-DELTA-IGMK-2 (P001653) EN: Pay attention to changes! IT: Attenzione alle modifiche! FR: Faire attention aux modifications! DE: Auf die Änderungen aufpassen! ES: Atención a las modificaciones! PT: Cuidado com as modificações! RO: Atenţie la modificări! NO: Legg merke til endringene! SV: Uppmärksamma vidtagna ändringar! DA: Bemærk ændringerne! CS: Dávejte si pozor na změny! SK: Venujte pozornost zmenám! PL: Należy zwrócić uwagę na zmiany! LT: Atkreipkite dėmesį į pakeitimus! LV: Pievērsiet uzmanību izmaiņām! HU: Kérjük, figyeljen a változásokra! BG: Обърнете внимание на промените! TR: Değişikliklere dikkat edin! EL: Προσοχή στις τροποποιήσεις!
ANTI-HD IgM IMŪNFERMENTATĪVĀS ANALĪZES KOMPLEKTS Procedūra kvalitatīvai IgM klases imūnglobulīnu pret hepatīta Delta antigēnu (anti-hd IgM) noteikšanai cilvēka seruma vai plazmas paraugos Lietošanai tikai in vitro 1. IEVADS Organisma seroloģiskā atbildes reakcija uz akūtu inficēšanos ar hepatīta Delta vīrusu (HDV) sastāv no sākotnējās fāzes, kad asinīs var konstatēt HD antigēnu, kam seko serokonversija, kad nosakāmas specifiskas antivielas (anti-hd). Tā kā HD virēmija ir īslaicīga un tikai agrīnā infekcijas stadijā, HDAg serumā jānosaka tūlīt pēc simptomu parādīšanās. Pozitīvas reakcijas iespējamība turpmāko dienu laikā strauji samazinās. Pretēji straujajai un spēcīgajai anti-hav IgM un anti-hbc IgM sintēzei hepatīta A un B gadījumā, HVD infekcijas gadījumā specifisko antivielu sintēze bieži aizkavējas; laiks līdz antivielu sintēzei lielā mērā ir atkarīgs no tā, vai HDV ir pievienojies HBV infekcijai kā koinfekcija (normāliem indivīdiem) vai kā superinfekcija HBsAg nēsātājiem. Akūtas HBV/HDV koinfekcijas gadījumā IgM klases antivielu pret HDV (anti-hd IgM) koncentrācija pieaug dažu dienu līdz nedēļu laikā pēc simptomu parādīšanās un serokonversija, parādoties anti-hd IgG, notiek vēlāk. Tā kā anti-hd IgM ir antivielas, kas parādās visātrāk, un bieži tās ir vienīgās antivielas klīnisko simptomu fāzē, tās ir izvēles marķieris HBV/HDV koinfekcijas diagnosticēšanai akūtiem pacientiem ar HBsAg pozitīvu hepatītu. Veicot sērijveida analīzes vairāku nedēļu laikā, pareizas diagnozes noteikšanas iespējamība palielinās, bet pieņemams kompromisa variants ir pirmā testa veikšana, parādoties simptomiem, un testa atkārtošana pēc 14 dienām. Šāda divkārša analīzes veikšana palielina diagnosticēto HBV/HDV koinfekciju skaitu par 35 līdz 50%, salīdzinot ar vienas analīzes veikšanu. Kā likums, antivielu produkcija, atbildot uz superinfekciju, ir ātrāka un enerģiskāka kā koinfekcijas gadījumā. Anti-HD IgM antivielas ir nosakāmas, parādoties simptomiem, vai arī to koncentrācija palielinās neilgi pēc simptomu parādīšanās, un drīz pēc tam var noteikt arī IgG klases antivielas; tādējādi anti-hd IgM veidošanās veids palīdz atšķirt koinfekciju no superinfekcijas. Vēl svarīgāks ir fakts, ka, atveseļojoties no hepatīta D, anti-hd IgG parasti saglabājas, bet anti-hd IgM koncentrācija strauji samazinās, bet progresējošas HDV infekcijas gadījumā to koncentrācija pieaug, sasniedzot augstu titru. Tādējādi, anti-hd IgM noteikšana sniedz svarīgu informāciju par hepatīta D gaitu un prognozi, IgM antivielu persistēšana liecina par hepatīta D pāreju hroniskā fāzē. Patiesībā anti-hd IgM atklāšana un titrs tieši korelē ar HDV replikāciju un aknu iekaisuma aktivitāti. 2. ANALĪZES PRINCIPS Kvalitatīvai anti-hd IgM noteikšanai izmanto imūnfermentatīvo analīzi, kas attēlota 1. att.; šai metodei par pamatu izmantota ELISA tehnika (enzimātiskā imūnfermentatīvā analīze) antivielu noteikšanai. Gēnu inženierijas ceļā iegūta HDAg un anti-hd antivielu fragmentu (peles monoklonā lo) izmantošana uzlabo testa uzticamī bu un reproducējamību. 133
1 2 + inkubācija (1 stunda, 37 C) mazgāšana + 3 inkubācija (1 stunda, 37 C) mazgāšana + 4 inkubācija (1 stunda, 37 C) mazgāšana hromogēns/substrāts inkubācija (30 minūtes, istabas temp.) apturēšanas šķīdums instrumenta nolasījums pie 450/630 nm. 1. att. ➀ Iedobe, kas pārklāta ar IgG pret cilvēka IgM (peles monoklonālo). ➁ Anti-HD IgM no parauga vai kontroles. ➂ HDAg (rekombinanta DNS). ➃ Fermentu iezīmētājs: anti-hd Fab (cilvēka un peles monoklonālais), kas konjugēts ar mārrutku peroksidāzi (HRP). 134
Anti-HD IgM un HDAg klātbūtnē fermentu iezīmētājs saistās ar cieto fāzi. Tādējādi fermenta aktivitāte ir proporcionāla parauga vai kontroļu anti-hd IgM koncentrācijai. Fermenta aktivitāti nosaka, pievienojot bezkrāsainu hromogēna/substrāta šķīdumu. Fermentam iedarbojoties uz hromogēnu/substrātu, veidojas krāsa, ko nosaka ar fotometru. 3. REAĢENTI UN PIEDERUMI 3.1. Komplektā iekļautie reaģenti Sloksnes ar pārklājumu 12 sloksnes ar 8 iedobēm Fermentu iezīmētājs 1 flakons, 0,4 ml Negatīvā kontrole 1 flakons, 3,3 ml Pozitīvā kontrole 1 flakons, 3,3 ml rhdag 1 flakons, 15 ml Iezīmētāja atšķaidītājs 1 flakons, 14,7 ml Parauga atšķaidītājs 2 pudeles, 70 ml Mazgāšanas buferis 1 flakons, 40 ml Hromogēns 1 flakons, 9 ml Substrāts 1 flakons, 9 ml Apturēšanas šķīdums 1 flakons, 30 ml Testu skaits 96 UZGLABĀŠANA: Pēc saņemšanas uzglabājiet visus reaģentus 2-8 C temperatūrā, sargājiet no spilgtas gaismas. Nesasaldēt. Pēc atvēršanas komplekta reaģenti ir stabili astoņas nedēļas, ja tie tiek pareizi uzglabāti, ja nav norādīts savādāk. Komplekts ir stabils vienu darba nedēļu, ja to lieto astoņas stundas dienā istabas temperatūrā un naktī uzglabā 2-8 C temperatūrā. Reaģentus nedrīkst lietot pēc derīguma termiņa beigām. Komplekta derīguma termiņš ir norādīts uz ārējā marķējuma. Katras sastāvdaļas derīguma termiņš ir norādīts uz attiecīgā flakona marķējuma. Nedrīkst sajaukt specifiskos reaģentus no dažādām partijām (skatīt 4.a sadaļu). Var savstarpēji aizstāt nespecifiskos reaģentus no dažādām partijām (skatīt 4.b sadaļu). 3.2. Komplekta sastāvā iekļautie materiāli 2 iepriekš piegriezti kartona noslēgi, kas piemēroti 1 līdz 12 sloksnēm 2 kartona noslēgi, kas piemēroti 12 sloksnēm (vienai platei) maisiņa noslēgs. 3.3. Materiāli, kas vajadzīgi, bet nav komplekta sastāvā Fotometrs, kas veic vertikālus lasījumus (piem., ETI-SYSTEM lasītājs vai ekvivalents) ar šādām instrumenta specifikācijām: viļņa garums: divi viļņu garumi 450 nm un 620-630 nm joslas platums: 10 nm absorbcijas diapazons: 0 absorbcijas vienības līdz 2,5 absorbcijas vienības atkārtojamība: 0,005 absorbcijas vienības vai mazāk vai 1%, atkarībā no tā, kurš rādītājs lielāks linearitāte vai ticamība: 0,010 absorbcijas vienības vai mazāk vai 2%, atkarībā no tā, kurš rādītājs lielāks novirze: mazāk nekā 0,005 absorbcijas vienības stundā. Termostatiski kontrolēts mitruma nodalījums ar šādām specifikācijām: temperatūra: 37 C ± 1 C. Manuāls vai automātisks aprīkojums iedobju skalošanai (piem., ETI-SYSTEM mazgātājs vai ekvivalents) ar šādām instrumenta specifikācijām: iepildāmais tilpums: 300-370 μl 135
mazgāšanas ciklu skaits: 5 mērcēšanas laiks: 30 sekundes aspirē pēdējo iepildītā šķidruma sadalījumu: jā. Mikropipetes ar vienreizējās lietošanas uzgaļiem (10 μl: ticamība ± 3%, precizitāte 2%; 100 μl: ticamība ± 2%, precizitāte 1%). Stikla trauki. Destilēts ūdens. Automātiskai testa apstrādei var izmantot ETI-LAB vai ETI-MAX 3000 aprīkojumu. 4. REAĢENTU SASTĀVS UN SAGATAVOŠANA Visas seruma un plazmas vienības, kas tika izmantotas šā komplekta komponentu ražošanā, tika testētas uz HBsAg, anti-hcv un anti-hiv-1/2 klātbūtni, un šiem testiem bija negatīvi rezultāti; izņēmums bija materiāls, kas saturēja anti-hd antivielas tas reaģēja uz HBsAg un anti-hcv. Tomēr HBsAg un HCV klātbūtne galīgajos reaģentos ir izslēgta, jo HBsAg tiek atdalīts attīrīšanas laikā un HCV RNS testa rezultāts ir negatīvs. Tomēr, tā kā neviena testa metode nespēj pilnībā garantēt patogēnu neesamību, visus cilvēka izcelsmes paraugus jāuzskata par potenciāli infekcioziem un ar tiem jārīkojas, ievērojot piesardzību. Komplektā izmantots gēnu inženierijas ceļā iegūts HDAg un himērisks anti-hd IgM, un tiek izslēgta augsti infekcioza cilvēka materiāla izmantošana. a) SPECIFISKIE KOMPLEKTA REAĢENTI 4.1. Sloksnes ar pārklājumu Iedobes ir pārklātas ar IgG (peles monoklonālo) pret cilvēka IgM (ar specifisku μ ķēdi). Sloksnes ir gatavas lietošanai, un tās jāuzglabā 2-8 C temperatūrā. Pirms maisiņa atvēršanas novietojiet pārklātās sloksnes istabas temperatūrā, lai neveidotos ūdens kondensāts. Ievietojiet neizmantotās sloksnes maisiņā, stingri to noslēdziet un uzglabājiet 2-8 C temperatūrā. 4.2. Fermentu iezīmētājs (50x konjugāts) Flakons satur 0,4 ml anti-hd Fab fragmentus (cilvēka un peles monoklonālos), kas konjugēti ar mārrutku peroksidāzi (HRP), TRIS buferi, liellopu seruma albumīnu, stabilizatorus un konservantus. Pirms lietošanas atšķaidiet šķīdumu attiecībā 1:50 ar iezīmētāja atšķaidītāju (4.6) (piem., 100 μl iezīmētāja + 4,9 ml iezīmētāja atšķaidītāja). Sagatavojiet tikai tik daudz fermentu iezīmētāja darba šķīduma, cik nepieciešams cikla veikšanai un uzglabājiet koncentrēto fermentu iezīmētāju 2-8 C temperatūrā. Fermentu iezīmētāja darba šķīdumu pēc sagatavošanas var uzglabāt vienu nedēļu 2-8 C temperatūrā. 4.3. Negatīvā kontrole Flakons satur 3,3 ml cilvēka seruma/plazmas, kas nereaģē uz anti-hd antivielām; tā atšķaidīta ar PBS buferi, liellopu seruma albumīnu, stabilizatoriem, konservantiem un inerto zilo krāsvielu. Reaģents ir gatavs lietošanai, un tas jāuzglabā 2-8 C temperatūrā. 4.4. Pozitīvā kontrole Flakons satur 3,3 ml cilvēka himērisko anti-hd IgM; tas atšķaidīts ar PBS buferi, liellopu seruma albumīnu, stabilizatoriem, konservantiem un inerto zilo krāsvielu. Reaģents ir gatavs lietošanai, un tas jāuzglabā 2-8 C temperatūrā. 136
4.5. rhdag Flakons satur 15 ml rekombinantā hepatīta D antigēna, liellopu embriju serumu, fosfātacitrāta buferi un konservantus. Reaģents ir gatavs lietošanai, un tas jāuzglabā 2-8 C temperatūrā. 4.6. Iezīmētāja atšķaidītājs Flakons satur 14,7 ml cilvēka seruma/plazmas, PSB buferi, teļu serumu un konservantus. Reaģents ir gatavs lietošanai, un tas jāuzglabā 2-8 C temperatūrā. Šķīdumu izmanto fermentu iezīmētāja atšķaidīšanai (4.2). 4.7. Parauga atšķaidītājs Katra pudele satur 70 ml PBS bufera, nespecifisku cilvēka IgG, nespecifisku IgG (peles monoklonālo), liellopu seruma albumīnu, stabilizatorus, konservantus un inerto zilo krāsvielu. Reaģents ir gatavs lietošanai, un tas jāuzglabā 2-8 C temperatūrā. Šķīdumu izmanto parauga atšķaidīšanai pirms analīzes. b) REAĢENTI, KAS PARASTI TIEK IEKĻAUTI CITOS ETI KOMPLEKTOS 4.8. Mazgāšanas buferis (25x) Flakons satur 40 ml PBS bufera, Tween 20 un konservantus. Pirms lietošanas atšķaidiet flakona saturu ar vienu litru destilēta ūdens. Sagatavotais mazgāšanas buferis ir stabils vienu nedēļu 2-8 C temperatūrā, un to izmanto iedobju skalošanai. Ja 2-8 C temperatūrā parādās kristalizācija, uzsildiet mazgāšanas buferi līdz 37 C un pirms atšķaidīšanas labi samaisiet. 4.9. Hromogēns Flakons satur 9 ml tetrametilbenzidīna atvasinājuma citrāta buferī. Pirms lietošanas samaisiet šķīdumu attiecībā 1:1 ar substrātu (4.10). 4.10. Substrāts Flakons satur 9 ml ūdeņraža pārskābi un citrāta buferi. Pirms lietošanas samaisiet šķīdumu attiecībā 1:1 ar hromogēnu (4.9) (piem., 1 ml hromogēna + 1 ml substrāta). Sagatavojiet tikai tik daudz hromogēna/substrāta, cik nepieciešams cikla veikšanai un uzglabājiet reaģentus 2-8 C temperatūrā. Pēc atšķaidīšanas hromogēna/substrāta darba šķīdumu var uzglabāt 8 stundas istabas temperatūrā, sargājot no gaismas. Darba šķīdumam jābūt bezkrāsainam vai viegli iezilganam. 4.11. Apturēšanas šķīdums Flakons satur 30 ml 1 N sērskābes šķīduma (R 36/38, S 26). Reaģents ir gatavs lietošanai, un tas jāuzglabā 2-8 C temperatūrā. 5. PARAUGA PAŅEMŠANA UN SAGATAVOŠANA Var izmantot cilvēka serumu vai plazmu. Ir pārbaudīti šādi antikoagulanti: citrāts, EDTA un heparīns, un tos var izmantot šai analīzei. Asinis jāpaņem aseptiski, izmantojot vēnas punkciju, tām jāļauj sarecēt, un pēc iespējas ātrāk serums jāatdala no recekļa. Paraugus, kuros redzamas daļiņas, kas ir duļķaini, lipēmiski vai satur eritrocītu atliekas, pirms testēšanas var būt nepieciešams dzidrināt, izmantojot filtrēšanu vai centrifugēšanu. Stipri hemolizētus vai lipēmiskus paraugus, kā arī paraugus, kas satur daļiņas, vai arī tos, kuriem ir acīmredzama mikrobu kontaminācija, nedrīkst testēt. Ja analīzi veic 48 stundu laikā pēc parauga paņemšanas brīža, paraugus jāuzglabā 2-8 C temperatūrā; pretējā gadījumā tie ir jāsadala un jāuzglabā, sasaldējot zemā temperatūrā ( 20 C vai zemākā). 137
Ja paraugus uzglabā sasaldētā veidā, pirms testēšanas atkausētie paraugi labi jāsajauc. Izvairieties no atkārtotas paraugu sasaldēšanas-atkausēšanas. Nedrīkst testēt paraugus, kas inaktivēti augstā temperatūrā. Parauga atšķaidīšana Visi paraugi pirms analīzes veikšanas jāatšķaida ar parauga atšķaidītāju (4.7) attiecībā 1:100. Iepildiet polistirēna stobriņos 10 μl parauga un 1 ml parauga atšķaidītāja, un, izmantojot Vortex maisītāju, rūpīgi samaisiet. Negatīvo un pozitīvo kontroli nedrīkst atšķaidīt. 6. ANALĪZES PROCEDŪRA Pirms analīzes veikšanas novietojiet visus reaģentus istabas temperatūrā (20-25 C). Veiciet visus analīzes soļus norādītajā secībā, un starp soļiem neieturiet pārāk lielas pauzes. Izvēlieties pietiekamu slokšņu skaitu, lai katrā paraugu ciklā singlikātā analizētu 3. negatīvās kontroles kopijas un 2. pozitīvās kontroles kopijas. Negatīvajām un pozitīvajām kontrolēm jābūt iekļautām katras pacientu paraugu plates analīzē. Kontrolēm un paraugiem jāveic viens un tas pats process, un to inkubācijas laikam jābūt vienādam. Sagatavojiet vienu iedobi, kas nesatur substrātu, bet satur tikai hromogēnu/substrātu. Katras kontroles un parauga iedalīšanai jāizmanto tīrs, vienreizējās lietošanas uzgalis. Izmantojot datu lapu, identificējiet iedobes, kas paredzētas kontroļu un paraugu testēšanai. Iepildiet kontroles un paraugus, kā attēlots šajā plānā. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A BLK S3 A B NC S4 B C NC C D NC D E PC E F PC F G S1 G Atšifrējums: = iedobe NC = negatīvā kontrole BLK = tukšs/nulle PC = pozitīvā kontrole S = paraugi. Noregulējiet termostatiski kontrolētajā mitruma nodalījumā temperatūru 37 ± 1 C. 1. Attiecīgajās iedobēs iepildiet 100 μl negatīvās kontroles un pozitīvās kontroles. Attiecīgajās iedobēs iepildiet 100 μl paraugus, kas atšķaidīti attiecībā 1:100. 2. Uzlieciet kartona noslēgu, lai aizkavētu izgarošanu. Viegli uzsitiet pa reakciju iedobēm, lai atbrīvotos no gaisa burbuļiem šķidrumā. 3. Inkubējiet vienu stundu ± 5 minūtes 37 ± 1 C temperatūrā. 138 H S2 O H
4. Kad inkubācija pabeigta, noņemiet un izmetiet kartona noslēgu. Aspirējiet šķidrumu un piecas reizes izskalojiet katru iedobi ar mazgāšanas buferi, kura tilpums ir diapazonā no 0,30 līdz 0,37 ml. Uzmanieties, lai šķidrums nepārplūst pāri reakciju iedobēm. Neskatoties uz to, vai tiek izmantots automātiskais vai pusautomātiskais mazgātājs, starp mazgāšanas cikliem jābūt 30 sekunžu ilgam mērcēšanas laikam. Pēc skalošanas apgrieziet sloksnes ar iedobēm uz leju uz susināmā papīra un viegli pasitiet pa tām, lai atbrīvotos no šķidruma atliekām. Atstājiet sloksnes apgrieztā veidā uz susināmā papīra, kamēr tiek pipetēts nākamais reaģents, lai izvairītos no izgarošanas. 5. Visās iedobēs, izņemot tukšo/nulles iedobi, iepildiet 100 μl HDAg šķīduma. Atkārtojiet 2. soli. 6. Inkubējiet vienu stundu ± 5 minūtes 37 ± 1 C temperatūrā. 7. Otrās inkubācijas beigās sagatavojiet fermentu iezīmētāja darba šķīdumu (4.2 un 4.6). 8. Atkārtojiet 4. soli. 9. Visās iedobēs, izņemot tukšo/nulles iedobi, iepildiet 100 μl fermentu iezīmētāja darba šķīdumu. Atkārtojiet 2. soli. 10. Inkubējiet vienu stundu ± 5 minūtes 37 ± 1 C temperatūrā. 11. Trešās inkubācijas beigās sagatavojiet hromogēna/substrāta darba šķīdumu (4.9 un 4.10). 12. Atkārtojiet 4. soli. 13. Visās iedobēs iepildiet 100 μl hromogēna/substrāta. 14. Inkubējiet 30 ± 2 minūtes istabas temperatūrā, sargājot no tiešas vai spilgtas gaismas. 15. Tādā pašā secībā un ātrumā kā iepildījāt hromogēnu/substrātu visās iedobēs iepildiet 100 μl apturēšanas šķīdumu. 16. Vienas stundas laikā pēc apturēšanas šķīduma pievienošanas, izmantojot fotometru, nosakiet paraugu absorbciju pie 450/630 nm. Tomēr paraugiem, kuriem ir ļoti augsta analizējamās vielas koncentrācija, rezultātus ieteicams nolasīt neilgi pēc apturēšanas šķīduma pievienošanas, jo iespējama precipitātu veidošanās, kas samazina sākotnējās absorbcijas vērtības. Šis fenomens tomēr neizraisa nepareizu paraugu klasifikāciju. Ja tiek izmantots specializēts aprīkojums, absorbcijas vērtības tiek aprēķinātas automātiski pēc vajadzīgā protokola izvēles. Ja tiek izmantots cits fotometrs, kas veic vertikālus lasījumus, atiestatiet instrumentu uz tukšās/nulles iedobes vērtību, pierakstiet katra parauga absorbciju pie 450/630 nm un no 450 nm absorbcijas vērtības atņemiet 630 nm absorbcijas vērtību. Automātiskai testa apstrādei var izmantot ETI-LAB vai ETI-MAX 3000 aprīkojumu. 7. REZULTĀTU APRĒĶINĀŠANA 7.1. Robežvērtības aprēķināšana Robežvērtību aprēķina, pieskaitot 0,100 negatīvās kontroles vidējai absorbcijas vērtībai (NC x ). Robežvērtība = NC x + 0,100. 139
7.2. Cikla validācijas kritēriji Novērtējot rezultātus, kvalitātes kontroles validācijai jāizmanto turpmāk minētie kritēriji. Vienmēr aprēķiniet un novērtējiet vidējās kontroļu vērtības katrai platei, arī tad, ja vienu partiju veido vairākas plates. Absorbcijas vērtībai tukšajai/nulles iedobei jābūt diapazonā no 0,000 līdz 0,150: 0,000 BLK 0,150. Starpībai starp pozitīvās kontroles vidējo absorbcijas vērtību un negatīvās kontroles vidējo absorbcijas vērtību jābūt 0,300 vai lielākai. PC x NC x 0,300. Ja netiek iegūts šāds rezultāts, iespējams, nav izmantota pareiza tehnika, un cikls jāatkārto. 7.3. Rezultātu interpretācija To, vai paraugā atrodas vai neatrodas anti-hd IgM, nosaka, salīdzinot nezināmo paraugu absorbcijas vērtības ar robežvērtības absorbcijas vērtību. Nezināmie paraugi, kuru absorbcijas vērtības ir lielākas vai vienādas ar robežvērtību, jāuzskata par reaktīviem attiecībā uz anti-hd IgM. Nezināmie paraugi, kuru absorbcijas vērtības ir mazākas nekā robežvērtība, jāuzskata par nereaktīviem. Paraugiem, kuru absorbcijas vērtības ir robežvērtības līmenī ± 10%, tests jāatkārto, lai apstiprinātu sākotnējo rezultātu. Paraugi, kuri, atkārtojot testu, ir reaktīvi, jāuzskata par pozitīviem. Paraugi, kuri, veicot otro testu, ir nereaktīvi, jāuzskata par negatīviem. 7.4. Aprēķina piemērs Dotie dati ir tikai piemērs un tos nevajadzētu izmantot lietotāja iegūto datu vietā. Negatīvās kontroles absorbcijas vērtības Negatīvās kontroles parauga nr. Tīrā absorbcija pie 450/630 nm 1 0,038 2 0,027 3 0,032 Vidējā absorbcijas vērtība, NC x = 0,032. Pozitīvās kontroles absorbcijas vērtības Pozitīvās kontroles parauga nr. Tīrā absorbcija pie 450/630 nm 1 1,092 2 1,048 Vidējā absorbcijas vērtība, PC x = 1,070. Robežvērtība (NC x + 0,100) = 0,032 + 0,100 = 0,132. Starpība starp pozitīvo un negatīvo kontroli (P N) = 1,070 0,032 = 1,038. Dotajā piemērā P N starpība atbilst cikla validācijas kritērijiem, jo tā ir lielāka nekā 0,300; tādējādi izmantotā tehnika ir pieņemama un dati jāuzskata par derīgiem. Nezināmo paraugu skrīnings Paraugs nr. 1 = absorbcijas vērtība 0,834 Paraugs nr. 2 = absorbcijas vērtība 0,061. Paraugs nr. 1 jāuzskata par reaktīvu attiecībā uz anti-hd IgM un paraugs nr. 2 par nereaktīvu, jo robežvērtība ir 0,132. 140
8. SPECIFISKS VEIKTSPĒJAS RAKSTUROJUMS 8.1. Analītiskais specifiskums Analītisko specifiskumu var definēt kā analīzes spēju precīzi noteikt specifisko analizējamo vielu, ja parauga matricā atrodas potenciāli traucējoši faktori (piem., antikoagulanti, hemolīze, parauga apstrādes ietekme) vai arī antivielas, ar kurām iespējamas krusteniskās reakcijas. Kontrolētos pētījumos par traucējošām vielām vai stāvokļiem tika noteikts, ka analīzes veiktspēju neietekmē antikoagulanti (EDTA, heparīns, citrāts), lipēmija (triglicerīdi līdz 3000 mg/dl), bilirubinēmija (bilirubīns līdz 100 mg/dl) vai antivielas pret citiem infekciju izraisītājiem. Absorbcijas vērtības paraugiem ar hemoglobīna koncentrāciju 1000 mg/dl bija par aptuveni 18% augstākas nekā vērtības, kas noteiktas neizmainītiem paraugiem. 8.2. Precizitāte Lai noteiktu analīzes atkārtojamību un reproducējamību (t.i., variabilitāti vienas vai vairāku analīžu ietvaros), tika analizētas dažādas paraugu grupas (A-C grupas) ar dažādām specifiskās analizējamās vielas koncentrācijām. Tabulās attēlotā variabilitāte neizraisīja paraugu nepareizu novērtēšanu. Atkārtojamība A grupa B grupa C grupa Noteikšanu skaits 22 22 22 Vidējā absorbcijas vērtība 0,139 0,440 1,076 Standarta novirze 0,012 0,020 0,058 Variācijas koeficients, % 8,3 4,5 5,4 Reproducējamība A grupa B grupa C grupa Noteikšanu skaits 66 66 66 Vidējā absorbcijas vērtība 0,151 0,421 1,023 Standarta novirze 0,021 0,040 0,076 Variācijas koeficients, % 13,7 9,5 7,4 8.3. Diagnostiskais specifiskums Diagnostiskais specifiskums ir negatīvas analīzes varbūtība, iztrūkstot specifiskajai analizējamai vielai. Diagnostiskais specifiskums tika noteikts, testējot 603 paraugus, kas atlasīti no populācijas ar paredzamu negatīvu anti-hd IgM rezultātu (asins donori; dialīzes pacienti; pacienti, kuri slimo ar dažādām infekcijas slimībām ar līdzīgiem simptomiem, piemēram, akūtu vai hronisku HBV infekciju un HDV infekciju anamnēzē; pacienti, kuri slimo ar dažādām akūtām infekciju slimībām; pacienti ar autoimūnām slimībām; subjekti, kuriem ir pozitīvs reimatoīdā faktora, heterofīlo antivielu vai anti-hrp antivielu testa rezultāts). Pētītajā populācijā tika iegūti seši pozitīvi rezultāti - diagnostiskais specifiskums: 99,00% (95% ticamības intervāls: 97,85-99,64%). 8.4. Diagnostiskā jutība Diagnostiskā jutība ir pozitīvas analīzes varbūtība specifiskās analizējamās vielas klātbūtnē. Diagnostiskā jutība tika noteikta, testējot 210 paraugus no populācijas ar paredzamu pozitīvu anti-hd IgM rezultātu (asimptomātiski HBsAg nēsātāji un pacienti ar akūtu vai hronisku HBV un HDV infekciju). Pētītajā populācijā tika iegūts viens negatīvs rezultāts - diagnostiskā jutība: 99,52% (95% ticamības intervāls: 97,38-99,99%). 141
8.5. Piesātinājuma efekts augstas koncentrācijas gadījumā Ja paraugos ir ļoti augsta antivielu koncentrācija, piesātinājuma efekta dēļ noteiktā koncentrācija var būt zemāka nekā patiesā. Tomēr, izmantojot optimizēto divu soļu sviestmaizes metodi, tiek izslēgtas būtiskas rezultātu kļūdas, jo analītiskais signāls saglabājas nemainīgi augsts (piesātinājuma līkne). Prozonas efekta (prozone effect) iespējamība tika analizēta, testējot četrus paraugus ar augstu anti-hd IgM koncentrāciju. Visiem paraugiem tika iegūtas ļoti augstas absorbcijas vērtības, kādas varētu būt serumam ar augstu koncentrāciju, liecinot, ka nepastāv prozonas efekts un tādējādi paraugu nepareiza novērtēšana. 9. PROCEDŪRAS IEROBEŽOJUMI Paraugu bakteriāla kontaminācija, atkārtoti sasaldēšanas-atkausēšanas cikli vai inaktivācija karstuma ietekmē var ietekmēt absorbcijas vērības un tādējādi arī anti-hd IgM koncentrācijas. Infekcijas slimības diagnozi nedrīkst uzstādīt, tikai pamatojoties uz viena testa rezultātiem. Lai uzstādītu precīzu diagnozi, jāņem vērā pacienta slimības vēsture, simptomi, kā arī seroloģiskie dati. 10. BRĪDINĀJUMI UN PIESARDZĪBAS PASĀKUMI Lai iegūtu precīzus rezultātus, jālieto pareiza tehnika un stingri jāievēro instrukcijas. Īpaši svarīga ir precīza pipetēšana, aspirācija un mazgāšana. Rezultātu atkārtojamība reaktīviem paraugiem var netikt nodrošināta dažādu metodoloģisko faktoru dēļ, piemēram: flakonu vāciņu savstarpēja samainīšana viena un tā paša uzgaļa lietošana, atvelkot šķidrumus no dažādiem flakoniem vai iepildot dažādus paraugus reaģentu vai paraugu pakļaušana lielam karstumam vai spēcīgai bakteriālai kontaminācijai nepareiza iedobju skalošana iedobju balstgredzenu kontaminācija ar iezīmētāju vai paraugiem dažādu sēriju reaģentu lietošana. Turklāt nepieciešams ievērot šādus piesardzības pasākumus: lai nepieļautu kontamināciju, izmantojiet tīru, šai darbībai paredzētu fermentu iezīmētāja šķīduma iepildītāju mazgāšanas buferis jāuzglabā tīros konteineros, lai nepieļautu kontamināciju ar fermentus inaktivējošām vielām hromogēna/substrāta sagatavošanai ļoti būtiski ir izmantot tīrus laboratorijas traukus. 142
11. DROŠĪBAS PIESARDZĪBAS PASĀKUMI Ar hromogēnu, substrātu un apturēšanas šķīdumu rīkojieties piesardzīgi. Nepieļaujiet hromogēna, substrāta un apturēšanas šķīduma saskari ar oksidējošiem līdzekļiem vai metāla virsmām. Neēdiet, nesmēķējiet un nelietojiet kosmētiku laboratorijā, kurā tiek veiktas analīzes. Nepipetējiet šķīdumus ar muti. Izvairieties no tieša kontakta ar visiem potenciāli infekcioziem materiāliem, lietojot aizsargājošu apģērbu, piemēram, laboratorijas halātus, aizsargbrilles un vienreizējos cimdus. Rūpīgi mazgājiet rokas pēc katras analīzes. Izvairieties no šķidrumu izliešanas vai aerosolu veidošanās. Visi izlietie reaģenti jānomazgā ar 5% nātrija hipohlorīta šķīdumu un jāiznīcina kā potenciāli infekciozi. Visus paraugus, bioloģiskos reaģentus un materiālus, kas tiek lietoti analīzei, jāuzskata par tādiem, kas potenciāli var pārnest infekciju izraisītājus. Līdz ar to, tie jāiznīcina saskaņā ar laboratoriju regulējošo institūciju noteikumiem un vadlīnijām, kā arī atbilstoši attiecīgās valsts likumdošanai. Vienreiz lietojamie materiāli ir jāsadedzina; šķidriem atkritumiem vismaz pusstundu jāveic dekontaminācija ar nātrija hipohlorīta šķīdumu, kura galīgā koncentrācija ir 5%. Skābi saturošie šķidrie atkritumi pirms apstrādes jāneitralizē. Jebkurš materiāls, kas paredzēts atkārtotai lietošanai, ir jāautoklavē, izmantojot dubultiznīcināšanas (overkill) pieeju (USP 24, 2000, 2143. lpp.). Tiek uzskatīts, ka parasti pietiekama ir vismaz viena stunda 121 C temperatūrā, tomēr lietotājiem jāpārbauda izmantotā dekontaminācijas cikla efektivitāte, sākotnēji veicot tā validāciju un regulāri izmantojot bioloģiskos indikatorus. Apturēšanas šķīdums (Padomes Direktīva 99/45/EK): R 36/38 S 26 Kairina acis un ādu. Ja nokļūst acīs, nekavējoties tās skalot ar lielu daudzumu ūdens un meklēt medicīnisku palīdzību. 143
ANALĪZES PLĀNS 1 - IZMANTOJOT PARAUGA ATŠĶAIDĪTĀJU, ATŠĶAIDIET PARAUGUS ATTIECĪBĀ 1:100. 2 - IEPILDIET REAĢENTUS IEDOBJU SLOKSNĒS ATBILSTOŠI ŠĀDAI SHĒMAI, ATSTĀJOT TUKŠU NULLES IEDOBI: REAĢENTI IEDOBES NEGATĪVĀ KONTROLE (3x) POZITĪVĀ KONTROLE (2x) PARAUGI (1x) NEGATĪVĀ KONTROLE 100 μl POZITĪVĀ KONTROLE 100 μl ATŠĶAIDĪTIE PARAUGI 100 μl 3 - INKUBĒJIET VIENU STUNDU 37 C TEMPERATŪRĀ. 4 - ASPIRĒJIET ŠĶIDRUMU. ATKĀRTOTI MAZGĀJIET AR MAZGĀŠANAS BUFERI. 5 - VISĀS IEDOBĒS IEPILDIET 100 μl HDAg, IZŅEMOT TUKŠAJĀ/NULLES IEDOBĒ. 6 - INKUBĒJIET VIENU STUNDU 37 C TEMPERATŪRĀ. 7 - ASPIRĒJIET ŠĶIDRUMU. ATKĀRTOTI MAZGĀJIET AR MAZGĀŠANAS BUFERI. 8 - VISĀS IEDOBĒS IEPILDIET 100 μl FERMENTU IEZĪMĒTĀJA DARBA ŠĶĪDUMU, IZŅEMOT TUKŠAJĀ/NULLES IEDOBĒ. 9 - INKUBĒJIET VIENU STUNDU 37 C TEMPERATŪRĀ. 10 - ASPIRĒJIET ŠĶIDRUMU. ATKĀRTOTI MAZGĀJIET AR MAZGĀŠANAS BUFERI. 11 - VISĀS IEDOBĒS IEPILDIET 100 μl HROMOGĒNA/SUBSTRĀTA. 12 - INKUBĒJIET 30 MINŪTES ISTABAS TEMPERATŪRĀ, TUMSĀ. 13 - VISĀS IEDOBĒS IEPILDIET 100 μl APTURĒŠANAS ŠĶĪDUMA. 14 - IZMANTOJOT FOTOMETRU, NOLASIET ABSORBCIJAS VĒRTĪBAS PIE 450/630 nm. 144
ETI-DELTA-IGMK-2 / JULY 2006 200/007-630 Rev. G DiaSorin S.p.A. 13040 SALUGGIA (VERCELLI) - ITALY Tel. 39.0161.487093 - Fax 39.0161.487628