UNIVERZITET U SARAJEVU FARMACEUTSKI FAKULTET KATEDRA ZA PRIRODNO-MATEMATIČKE PREDMETE U FARMACIJI EKSTRAKCIJA I ODREĐIVANJE SADRŢAJA KOFEINA U MLJEVENOJ KAHVI DOSTUPNOJ NA DOMAĆEM TRŢIŠTU ZAVRŠNI RAD INTEGRISANOG STUDIJA I I II CIKLUSA Mentor: Doc. dr Hurija Dţudţević-Čančar Kandidat: Admir Kaloper Sarajevo, decembar 2017.
SADRŢAJ SAŢETAK... I ABSTRACT... II 1. UVOD... 1 1. 1. Botaničke vrste kahve... 2 1. 2. Alkaloidi... 4 1. 3. Kofein... 6 1. 3. 1. Hemijska struktura kofeina... 8 1. 3. 2. Metabolizam kofeina... 10 1. 3. 3. Mehanizam djelovanja kofeina... 12 1. 3. 4. Biološka aktivnost kofeina... 15 1. 3. 5. Regulacija unosa kofeina... 18 1. 3. 6. Biosinteza i sinteza kofeina... 18 1. 4. Ekstrakcija... 20 1. 4. 1. Tečno-tečna ekstrakcija... 21 1. 4. 2. Čvrsto-tečna ekstrakcija... 22 1. 4. 3. Ekstrakcija kofeina... 22 2. HIPOTEZE... 24 3. CILJEVI RADA... 25 4. MATERIJAL I METODE... 26 4. 1. Materijal... 26 4. 2. Metode korištene u radu... 27 5. REZULTATI... 38 5. 1. Rezultati ekstrakcije kofeina... 38 5. 2. Rezultati odreďivanja tačke topljenja... 38 5. 3. Rezultati tankoslojne hromatografije (TLC)... 39 5. 4. Rezultati FTIR analize... 42
6. DISKUSIJA... 47 7. ZAKLJUČCI... 51 8. LITERATURA... 53 9. DODACI... 57 9. 1. Popis slika... 57 9. 2. Popis tabela... 58
SAŢETAK Kofein (1,3,7- trimetilksantin) je alkaloid čija su fizička i hemijska svojstva dobro poznata. Kofein djeluje stimulativno na centralni nervni sistem, što se naziva analeptičkim djelovanjem. Pri konzumaciji kofeina dolazi do trenutnog povećanja budnosti i svjesnosti kod ljudi, kao i kod eksperimentalnih ţivotinja. Primarno biološko djelovanje kofeina je blokada adenozinskih receptora. U radu je vršena ekstrakcija kofeina iz različitih vrsta kahve dostupnih na domaćem trţištu dvjema metodama, od kojih je jedna hemijska, a druga obična metoda kuhanja, koja se koristi pri svakodnevnom pripremanju kahve. Izvršeno je ispitivanje uzoraka tankoslojnom hromatografijom, odreďivanje tačke topljenja, a zatim je dobijeni kofein prečišćen vakuumskom sublimacijom. Nakon prečišćavanja je ponovo izvršeno odreďivanje tačke topljenja, kao i tankoslojna hromatografija i uraďena je hemijska karakterizacija uzoraka kofeina FTIR analizom, usporedbom sa standardom kofeina. Procenat neprečišćenog ekstrahiranog kofeina je bio veći za uzorke kahve podvrgnute običnom kuhanju, dok je za refluksiranje taj procenat nešto manji, s izuzetkom Prima kahve, kod koje je više kofeina ekstrahirano refluksiranjem. Nakon provoďenja vakuumske sublimacije, iz svih refluksiranih uzoraka je dobijen veći prinos nego iz uzoraka pripremljenih običnim kuhanjem kahve. Na razvijenom TLC hromatogramu uočeno je da su mrlje nečistoća nakon metode refluksiranja manje izraţene nego nakon običnog kuhanja, dok su pri odreďivanju tačke topljenja svi refluksirani uzorci imali više talište od uzoraka dobijenih običnim kuhanjem, što ukazuje na to da imaju manje onečišćenja. Nakon prečišćavanja vakuumskom sublimacijom, odreďena tačka topljenja svih uzoraka je bila izmeďu 235 i 238 C, što odgovara literaturnim vrijednostima. Kljuĉne rijeĉi: kofein, kahva, ekstrakcija, vakuumska sublimacija, TLC, FTIR I
ABSTRACT Caffeine (1,3,7-Trimethylxanthine) is an alkaloid with well-known physical and chemical properties. Caffeine acts as a stimulus on central nervous system, which is known as analeptic effect. Caffeine consumption brings a momentarily increase in awareness and alertness in humans, as well as in experimental animals. Primary biological effect of caffeine is blockage of adenosine receptors. Extraction of caffeine was performed using different kinds of coffee available at local market with two extraction methods: chemical method and a usual, ordinary brewing method, which is used in every day coffee preparation. TLC and melting point analysis were performed on extracted, crude samples, and then the samples were purified using vacuum sublimation. After purification, TLC and melting point analysis were performed again. Finally, FTIR characterization of caffeine was performed. Spectra of individual samples were compared to standard spectrum. The percentage of extracted impure caffeine was higher in coffee samples which had undergone ordinary brewing method in comparison to reflux method, with the exception of one coffee sample in which the percentage of extracted crude caffeine was higher with reflux method. After performing vacuum sublimation, the yield was higher for all the refluxed samples compared to samples obtained by ordinary brewing method. In developed TLC chromatogram it can be seen that the impurity spots are less visible after reflux method than after ordinary brewing method, while the melting point determination has shown that all the refluxed samples had a higher melting point than samples obtained by ordinary brewing method, implying that refluxed samples are less impure. After vacuum sublimation purification, the melting point has been determined in 235 to 238 C temperature range for all the samples, which matches literary values for caffeine melting point. Key words: caffeine, coffee, extraction, vacuum sublimation, TLC, FTIR II
1. UVOD Kahva je još od davnina bila cijenjena zbog svog okusa i, što je još vaţnije, stimulativnog djelovanja. Iako je ljudi konzumiraju već stotinama godina, nikad nije utvrďeno gdje je kahva otkrivena, niti ko ju je prvi otkrio. Ipak, najprihvaćenija je priča koja kaţe da je kahvu otkrio pastir po imenu Kaldi, koji je čuvao koze na etiopijskim visoravnima. Kaldi je primijetio da njegove koze noću ne spavaju nakon konzumiranja bobica drveta koje je kasnije postalo poznato kao drvo kahve. On je svoje zanimljivo opaţanje prijavio opatu iz lokalnog manastira. Opat je postao prva osoba koja je skuhala kahvu i iskusila njen stimulativni efekat. Riječ o neobičnom piću se ubrzo proširila izvan manastira, a nedugo zatim na Arapski poluotok (tu je i započela industrija kahve, jer su Arapi prvi prepoznali njenu komercijalnu vrijednost) i konačno širom svijeta. Iako je priča o Kaldiju više legenda nego činjenica, ipak postoje neki historijski dokazi koji ukazuju na to da kahva zaista vodi porijeklo s visoravni Etiopije (Smith i sar., 2007). Najstariji pisani trag o kahvi se nalazi u djelu Ibn Sine zvanom Al-Ganum fit-tebb ( Kanon medicine ), u kojem se navodi recept za piće zvano Buncham, koje je toplo, dobro je za stomak, ojačava udove i daje cijelom tijelu ugodnu aromu (Sanda i sar., 2015). Na slici 1. je prikazana prţena kahva u zrnu i mljevena kahva. Slika 1. Kahva Goethe, poznati njemački pjesnik, je 1820. godine zatraţio od hemičara Friedrich Ferdinand Rungea da pronaďe uzrok nemogućnosti spavanja nakon konzumiranja kahve. Runge je uskoro identificirao kofein kao krivca i razvio grubu metodu dekafeinacije (Smith i sar., 2007). 1
1. 1. Botaniĉke vrste kahve Kahva kakvu mi poznajemo i cijenimo je piće koje se priprema iz prţenih sjemenki drveta iz familije Rubiaceae, rod Coffea. Postoji preko 90 vrsta kahve iz roda Coffea zabiljeţenih u Nacionalnom centru za biotehnološke informacije (National Center of Biotechnology Information), ali samo dvije od njih su značajne na svjetskom trţištu, a to su Coffea arabica i Coffea canephora (Farah i Ferreira dos Santos, 2015). Coffea canephora je poznata još i kao Coffea robusta, a u pripremi napitka od kahve se koristi još i vrsta Coffea liberica, koja je ipak mnogo manje zastupljena od prve dvije spomenute vrste. Naime, Coffea arabica čini 75,5 % svjetskog trţišta kahve, Coffea canephora 24 % svjetskog trţišta kahve, dok Coffea liberica čini svega 0,5 % svjetskog trţišta kahve i prisutna je uglavnom na regionalnom trţištu (Prance i Nesbitt, 2005). Iako naziv Coffea arabica upućuje na arapsko porijeklo, ova vrsta kahve ipak vodi porijeklo iz Etiopije, dok se najviše gaji u Juţnoj i Centralnoj Americi, Africi i ostrvima Okeanije. Coffea canephora, s druge strane, vodi porijeklo iz Demokratske Republike Kongo, dok Coffea liberica potiče takoďe iz Afrike, tačnije Liberije. Brazil i Kolumbija su najveći svjetski proizvoďači kahve sa 70 % ukupne svjetske proizvodnje, a slijede ih afričke zemlje s 20 %, te Meksiko s 10 %. (Kovačević, 2004). U današnjem vremenu se vrši hibridizacija vrsta Coffea arabica i Coffea robusta. Razlog tome je podloţnost Coffea arabica gljivičnom oboljenju lista kahve, koje izaziva Hemileia vastatrix, a karakteristično je za Etiopiju. Coffea robusta je mnogo otpornija na ovo oboljenje, te nastala hibridna kahva nasljeďuje ovu otpornost. Interesantno je spomenuti da je ova bolest upravo jedan od glavnih razloga što je u Velikoj Britaniji danas čaj popularnije piće od kahve. Naime, krajem 19. stoljeća je došlo do širenja ovog oboljenja u Cejlon. Zbog činjenice da nisu poduzete nikakve akcije kako bi se širenje bolesti dalje spriječilo, došlo je do epidemije na kolonijalnim plantaţama kahve i na kraju do totalnog kolapsa industrije kahve. Britanci su umjesto kahve zasadili čaj, koji je do današnjeg dana ostao najpopularnije piće u Velikoj Britaniji (Prance i Nesbitt, 2005). Biljke roda Coffea su ţbunovi ili nisko drveće, a njihovi listovi su krupni i koţasti, dok se u njihovom pazuhu nalaze bijeli cvijetovi, koji imaju ugodan miris. Plod je sočna košpa crvene boje s dva sjemena obavijena tankom srebrnastom opnom. Branje plodova se vrši tek nakon što postanu potpuno crveni i zreli. Oni se ostave da nabubre u vodi, a onda se mehanički skida 2
perikarp. Ostatak pulpe se odstranjuje nakon fermentacije, a sjeme se suši i tako se dobija sirova kahva (Kovačević, 2004). Coffeae semen sjeme kahve (Coffea spp., Rubiaceae) Drogu predstavlja zrelo, osušeno sjeme biljaka roda Coffea. Zrno sirove kahve je poluloptasto, glatko, te ima gorak okus (Kovačević, 2004). Na pljosnatoj strani se nalazi uzduţna brazda u kojoj je prisutan ostatak karakterističnog srebrnog sjemenog omotača. Ocjenjivanje kahve se vrši na osnovu mirisa, okusa, čistoće, homogenosti i starosti pri čemu se starija kahva više cijeni od nove. Kofein je u kahvi vezan za hlorogensku kiselinu u vidu dvosoli zajedno s kalijem, a u kahvi su još prisutni neaktivni alkaloid trigonelin, saponozidi, pektin, oksidaze i glikozidaze. Neprţena kahva sadrţi 10-11 % masti, 8-12 % vlage, 5-7 % šećera, do 40 % celuloze (Tucakov, 1964), te 0,6-3,2 % kofeina, ali sadrţaj kofeina je obično izmeďu 1,5 i 2,5 % (Prance i Nesbitt, 2005). Prije upotrebe se vrši prţenje kahve na temperaturi 200-250 C, pri čemu dolazi do raznih promjena u kahvi (Kovačević, 2004). Naime, prţenjem (torefakcijom) nastaje isparljivo, mrko, teško i vrlo aromatično ulje koje se naziva kofeon i u svom sastavu sadrţi aceton, furfural, furfurilni alkohol, sirćetnu kiselinu, piridin, furan i mnoga druga empireumatska jedinjenja (Tucakov, 1964). Procesom prţenja dolazi i do oslobaďanja kofeina iz kompleksa s taninima i hlorogenskom kiselinom, dok se dugim prţenjem dobija ugalj od kahve (Carbo Coffeae tostae). Ovaj ugalj kahve se koristi za zaustavljanje dijareje, kao antidot ili kao zamjena za ţivotinjski ugalj (Carbo animalis) (Kovačević, 2004). Sadrţaj kofeina u kahvi je nakon prţenja nešto manji nego kod sirove kahve i iznosi oko 1,5 % za vrstu Coffea arabica, te oko 2,7 % za vrstu Coffea robusta (Prance i Nesbitt, 2005). 3
1. 2. Alkaloidi Kofein je najviše korištena psihoaktivna supstanca na svijetu (Ogawa i sar., 2007). Spada u grupu jedinjenja poznatih pod imenom alkaloidi. To je jedna od najraznovrsnijih grupa sekundarnih metabolita koji se nalaze u ţivim organizmima i imaju širok spektar vrsta struktura, biosintetskih puteva i farmakoloških aktivnosti (Roberts, 2013). Alkaloidi su sloţena organska heterociklična i bazična jedinjenja koja u svojoj strukturi sadrţe nitrogen i nakon unošenja u organizam ispoljavaju specifično farmakološko i toksikološko djelovanje. Naziv alkaloidi je prvi upotrijebio K. F. Meissner, apotekar iz Halea, 1819. godine. Naime, riječ alkaloid je izvedenica od arapskih riječi al kali, što znači baza i grčke riječi eidos, što znači sličan (Lukić, 2001). U suštini, skoro svi sekundarni metaboliti koji sadrţe nitrogen se smatraju alkaloidima, osim ako nisu odmah klasificirani drugačije, npr. kao amini ili glukozinolati. Nitrogen, koji sadrţe alkaloidi, vodi porijeklo od odgovarajućih aminokiselina i on je odgovoran za bazične osobine ove grupe jedinjenja. (Cseke, 2006). Alkaloidi su prisutni u oko 20% biljnih vrsta i smatra se da oni imaju defanzivnu ulogu, dakle, učestvuju u odbrani organizma od biljojeda i patogena (Ziegler, 2008). Lokacija alkaloida unutar same biljke igra vaţnu ulogu u hemijskoj odbrani biljke od strane napasnika. Za adekvatnu zaštitu biljke, alkaloidi moraju biti prisutni na pravom mjestu i u dovoljnoj koncentraciji. Prije više od stotinu godina je primijećeno da se alkaloidi, kao i drugi sekundarni metaboliti, u biljkama obično nalaze na onim mjestima gdje bi napad biljojeda najviše utjecao na razvoj biljke. To su najčešće mladi, rastući dijelovi biljke, kao i periferni ćelijski sloj korijenja. U godinama koje su uslijedile, ova zapaţanja su više puta potvrďena. Naime, iako su alkaloidi u biljkama prisutni u malim količinama (0.1-2% suhe mase), oni su uglavnom koncentrirani u odreďenim dijelovima biljke i njihova koncentracija u datom dijelu je mnogo veća. Jako dobar primjer je morfin, čija koncentracija u čahurama maka iznosi 0,3-1,5% dok u sirovom opijumu, osušenom soku zasječenih, nedozrelih čahura maka, iznosi 25% pa čak i više (Roberts, 2013). Zahvaljujući svojoj potentnoj biološkoj aktivnosti, mnogi od oko 12 000 poznatih alkaloida se koriste kao farmaceutici, stimulansi, narkotici i otrovi (Ziegler, 2008). 4
Tradicionalno se alkaloidi izoluju iz biljaka, dok se odreďeni alkaloidi mogu izolovati i iz ţivotinja, insekata i morskih beskičmenjaka kao i nekih mikroorganizama. Ako govorimo o upotrebi alkaloida u medicini, treba napomenuti da su terapeutski aktivne supstance izolovane tek, relativno nedavno, početkom 19. stoljeća. (Prva hemijski ispitana sirova droga je opijum, osušeni sok iz nedozrelih čahura maka, Papaver somniferum. Iako je ova droga korištena zbog svojih analgetskih i narkotičkih svojstava već stoljećima, tek je 1803. godine Derosne izolovao polučisti alkaloid iz nje, dok je 1805. Seturner izolovao ovaj konstituent, prepoznao njegova bazična svojstva i nazvao ga morfin (Roberts, 2013).) U posljednjih 170 godina je izolovano nekoliko hiljada različitih alkaloida, dok je znatan broj dobijen sintetski ili polusintetski. TakoĎer, mnogim alkaloidima su utvrďeni hemijska graďa i djelovanje, te su oni uvršteni u materiju mediku. Prvi sintetski dobijeni alkaloid je koniin, koji je alkaloid kukute. Ova sintezu je izveo A. Ladenburg 1886. godine. Iako su, kako je već rečeno, mnogi alkaloidi dobijeni sintetski, veliki broj alkaloida je ekonomičnije, kao i pogodnije, dobijati ekstrakcijom iz prirodne sirovine, dok je za odreďeni broj alkaloida to i jedini način proizvodnje. Zbog toga se mnoge alkaloidne biljke gaje na plantaţama i tako se dobija prirodna sirovina koja će posluţiti za ekstrakciju alkaloida, koji će se konačno iskoristiti u farmaceutskoj industriji. Alkaloidi se mogu podijeliti u dvije osnovne grupe, a podjela se vrši na osnovu poloţaja atoma nitrogena u strukturi alkaloida, odnosno na osnovu toga da li se N atom nalazi unutar ili van heterociklusa. Za alkaloide s nitrogenom van heterociklusa razlikujemo tri strukturne varijacije, a to su: feniletilaminski (efedrin), amidni (kapsaicin) i tropolonski (kolhicin) alkaloidi. Kod alkaloida s nitrogenom unutar heterociklusa postoji nešto više strukturnih varijacija: kondenzovani pirolidin i piperidin tropanski (atropin) i ekgoninski (kokain) alkaloidi, piridin i piperidin alkaloidi koniin, nikotin, kinolizidin alkaloid spartein, kinolin alkaloid kinin, izokinolin benzizokinolinski (papaverin), bis-benzizokinolinski (tubokurarin) i morfinen-7 (morfin) alkaloidi, indol strihnin, brucin i ergolenski alkaloidi (ergometrin), imidazol alkaloid pilokarpin, 5
purin alkaloid kofein, fenantridin alkaloid galantamin. TakoĎer, u grupu alkaloida s nitrogenom unutar heterociklusa spadaju steroidni (protoveratrin), kao i terpenski (akonitin) alkaloidi (Lukić, 2001). Na slici 2. su prikazani samo neki heterociklusi koji ulaze u sastav alkaloida. Slika 2. Heterociklusi alkaloida (Cseke, 2006) 1. 3. Kofein Kofein je alkaloid čija su fizička i hemijska svojstva dobro poznata. To je čvrsta supstanca, bez mirisa, gorkog okusa, koja sublimira i kristalizira u obliku bijelih iglica. U otopini apsorbuje svjetlost talasne duţine koja odgovara ultravioletnom području, a razlika u topivosti potpomaţe analitičko razdvajanje i purifikaciju. Kofein je i hidrofilan i lipofilan, zahvaljujući čemu bez problema prolazi kroz biološke membrane, dok se njegova gorčina koristi kao standard za kalibraciju pri odreďivanju gorčine nekih drugih supstanci. Pri kristalizaciji iz vodene otopine, kofein formira nestehiometrijski stabilni hidrat. Anhidrirani kofein se javlja u dva oblika, odnosno dvije modifikacije. Naime, na niţim temperaturama se javlja β modifikacija kofeina. To je forma kofeina koja je stabilna na niskim temperaturama dok se na temperaturi od 141 C transformiše u α modifikaciju, koja ima viši stepen disolucije. Pri hlaďenju dolazi do prelaza α modifikacije u β modifikaciju i taj 6
proces se odigrava veoma sporo, što je vaţno za formulaciju farmaceutskih preparata koji sadrţe kofein (Oestreich-Janzen, 2016). Kofein djeluje stimulativno na centralni nervni sistem, što se naziva analeptičkim djelovanjem. Pri konzumaciji kofeina dolazi do trenutnog povećanja budnosti i svjesnosti kod ljudi, kao i kod eksperimentalnih ţivotinja. Primarno biološko djelovanje kofeina je blokada adenozinskih receptora (Pubchem, 2017). Neke od fizičko-hemijskih osobina kofeina date su u tabeli 1. Tabela 1. Fizičko-hemijske osobine kofeina (Pubchem, 2017). Molekulska formula C 8 H 10 N 4 O 2 Molekulska masa 194,19 g/mol Tačka topljenja 237 C Tačka ključanja (sublimacija) 178 C Gustina 1,05 g/cm 3 pka (na 40 C) 10,4 Kofein je prvi put izolovan 1820. godine, ali za odreďivanje njegove tačne strukture je bilo potrebno još neko vrijeme, te je struktura kofeina odreďena tek devedesetih godina devetnaestog stoljeća, dok njegovo djelovanje nije bilo razjašnjeno još skoro cijelih sto godina. Naime, 1981. godine je pronaďena veza izmeďu stimulativnog djelovanja kofeina i njegovih analoga s blokadom adenozinskih receptora. Kofein iskazuje djelovanje na razne psihološke strukture, što, izmeďu ostalog, uključuje, umor, humor, bol i spavanje. Pored toga što je kofein prisutan u pićima koja svakodnevno bivaju konzumirana od strane velikog broja ljudi; uključujući kahvu, čaj, kao i mnoge druge napitke; kofein često pronalazi svoje mjesto i u nekim lijekovima, većinom protiv glavobolje, u kombinaciji s nesteroidnim antiinflamatornim lijekovima (NSAIL) ili paracetamolom (Tavares i Sakata, 2012). 7
Lijekovi koji sadrže kofein Agencija za lijekove i medicinska sredstva BiH kao i Farmaceutska kompanija Bosnalijek dali su listu lijekova koji sadrţe kofein kao i prisutne količine kofeina u lijekovima. U tabeli 2. su navedeni lijekovi prisutni na našem trţištu koji u svom sastavu sadrţe kofein. Tabela 2. Lijekovi prisutni na domaćem tržištu koji u svom sastavu sadrže kofein Fabrički naziv Kofan instant Coldrex Caffetin Sastav propifenazon, aracetamol kofein (50 mg) fenilefrin, paracetamol, terpin hidrat,askorbinska kiselina, kofein (25 mg) paracetarnol,propifenazon, i kodeinfosfat seskvihidrat, kofein(50 mg) Djelovanje analgetik, kao i za kratkotrajno ublažavanje analgetik snižavanje povišene tjelesne temperature kod prehlade i gripe simptoma prehlade i gripe Farmaceutski oblik Tablete Tablete Tablete Način primjene Oralno Oralno Oralno Doziranje pojedinačna doza: 1 do 2 tablete. Maksimalna odrasli: 1 2 tablete; Po potrebi se ova doza može uzimati po 1-2 tablete do 3 puta na dan, po potrebi dnevna doza (u 24 sata) ne više od 6 tableta ponoviti do tri puta u toku 24 sata Izdavanje bez recepta (OTC) bez recepta (OTC) bez recepta (OTC) 1. 3. 1. Hemijska struktura kofeina Kofein je prisutan u više od 60 vrsta biljaka. Zajedno s teobrominom (prisutan u kakau) i teofilinom (prisutan u čaju), on pripada purinskoj grupi alkaloida. Ovi alkaloidi su hemijski slični ksantinima i mokraćnoj kiselini, koji su, kao i purini, jako vaţne komponente metabolizma (Sawynok, 2011). U nomenklaturi 21. stoljeća, molekula kofeina se označava kao 1,3,7-trimetilksantin ili 1,3,7- trimetil-2,6-dihidro-purin-2,6-dion ili u skraćenom obliku 1,3,7-trimetilpurin-2,6-dion, ali naziv kofein je prihvaćen kao sinonim. Kostur strukture kofeina čini purin, kondenzirani heterociklus, koji nastaje spajanjem pentakarbonskog imidazola i heksakarbonskog pirimidina. Prefiks trimetil označava supstituente, dok sufiks dion označava keto funkcionalne grupe koje sadrţi kofein. Na slici 3. je prikazana struktura purina i purinskih alkaloida. 8
Slika 3. Purin i purinski alkaloidi (Uwubetine, 2010) Naziv purin je osmislio Emil Fischer 1884. godine, dok je 1897. predloţio numerisanje prstena, što se vidi na slici 4. Ovo uobičajeno imenovanje i numerisanje je korišteno u standardnim radovima datog vremenskog perioda, kao što su njemački Beilstein Handbook of Organic Chemistry, te američki Chemical Abstracts, još od njihovih prvih izdanja. Slika 4. Struktura purina numerisana prema Fischeru (Oestreich-Janzen, 2016) Naziv purin je 1957. godine proglašen 'zadrţanim trivijalnim nazivom' u pravilima za nomenklaturu organske hemije, koja su bila ustanovljena od strane IUPAC-a (International Union of Pure and Applied Chemistry), čije sjedište je bilo u Oxfordu, Engleska. Prema istim pravilima, Fischerov sistem za numerisanje purina je prihvaćen kao izuzetak od sistematskog numerisanja propisanog spomenutim pravilima. U decembru 2013. godine, s novim pristupom u organskoj nomenklaturi, purin je unaprijeďen u 'preferirano ime po IUPAC-u', što je objavljeno u aktuelnoj IUPAC-ovoj Plavoj knjizi. Naziv 'kofein' je dozvoljen, bez izričitog pominjanja od strane IUPAC-a, kao alternativa za trimetilirani purin dion (Oestreich-Janzen, 2016). 9
1. 3. 2. Metabolizam kofeina Kofein biva u potpunosti apsorbovan iz gastrointestinalnog trakta ubrzo nakon konzumacije pri čemu se maksimalne plazmatske koncentracije kofeina obično dostiţu izmeďu 15 i 60 minuta nakon konzumacije, iako se moţe desiti da postizanje maksimalne plazmatske koncentracije potraje i do dva sata. Smatra se da je za ovu varijaciju u postizanju maksimalne plazmatske koncentracije odgovorno odloţeno gastrično praţnjenje (Grosso i sar., 2005). Pri primjeni kofeina se postiţu dosta različite koncentracije kod različitih osoba, a razlogom za to se smatraju varijacije u metabolizmu. Ove varijacije zavise od četiri faktora, a to su genetski polimorfizmi, indukcija i inhibicija citohrom P450 enzima, odreďene karakteristike (spol i masa), kao i bolesti jetre. Kofein se za proteine plazme (uglavnom albumin) veţe od 10% do 35%, dok njegov volumen distribucije iznosi izmeďu 0,6 i 0,7 Lkg -1. Kofein veoma brzo prolazi ćelijske membrane, kao i placentarnu i krvno-moţdanu barijeru, te tako dostiţe visoke koncentracije u cijelom tijelu, uključujući i mozak (Tavares i Sakata, 2012). Kofein i njegovi primarni metaboliti (paraksantin, teobromin i teofilin) se mogu detektovati u svim tjelesnim tečnostima, kao i u krvi pupčane vrpce. Preko noći dolazi do eliminacije kofeina iz organizma, no, neki njegovi metaboliti (teofilin, teobromin) ipak imaju duţe poluţivote. Kod ljudi poluţivot kofeina obično traje izmeďu 2 i 4,5 sati, iako moţe potrajati i do 12 sati (Grosso i sar., 2005). Metabolizam kofeina se odvija u jetri pod utjecajem hepatičkih mikrosomalnih enzimskih sistema, pri čemu nastaju dimetilksantini i glavni enzim uključen u metabolizam kofeina je citohrom P450 1A2 (CPY1A2), koji je odgovoran za oko 95% klirensa kofeina. Brzina klirensa je kontrolisana enzimom CYP1A2, te u manjoj mjeri ksantin oksidazom (XO) i N- acetiltransferazom 2 (NAT2) (Fenster i sar., 1998). Dva najvaţnija faktora koji imaju utjecaj na metabolizam kofeina su trudnoća, koja predstavlja endogeni faktor, i konzumiranje cigareta, što predstavlja egzogeni faktor. Naime, trudnoća usporava metabolizam kofeina, dok konzumiranje cigareta dovodi do ubrzanja istog. Za vrijeme prvog trimestra trudnoće ne dolazi do promjene poluţivota kofeina, ali u 17. sedmici gestacije se povećava na 10 sati, dok do kraja trudnoće varira izmeďu 11,5 i 18 sati, što dovodi do nakupljanja kofeina u organizmu. Smatra se da je ovo povećanje poluţivota kofeina u trudnoći povezano s redukcijom aktivnosti NAT2 enzima u ranoj trudnoći, te redukcijom aktivnosti CYP1A2 enzima tokom trudnoće. 10
Konzumiranje cigareta, s druge strane, je egzogeni faktor koji moţe skoro udvostručiti brzinu metabolizma kofeina. Razlog tome je prisustvo policikličkih aromatskih karbohidrogena u cigareti, koji dovode do povećane aktivnosti jetrenih enzima, što za posljedicu ima ubrzan metabolizam kofeina (Grosso i sar., 2005). TakoĎer, na poluţivot kofeina utječu i neki drugi faktori, kao što su bolesti jetre, upotreba nekih lijekova, dob, te konzumiranje odreďenih vrsta hrane. Kod ţena koje koriste oralne kontraceptive, poluţivot kofeina iznosi 5 do 10 sati. Djeca generalno imaju veći poluţivot kofeina nego odrasli, dok kod novoroďenčadi iznosi oko 30 sati. Kod bolesnika s ozbiljnim bolestima jetre poluţivot kofeina moţe iznositi čak i do 96 sati (Uwubetine, 2010). Od ukupno unesenog kofeina 0,5% do 2% biva izlučeno nepromijenjeno urinom zahvaljujući tubularnoj reapsorpciji koja iznosi oko 98%. Paraksantin, koji je primarni metabolit kofeina, se pri oralnoj primjeni izlučuje 60% u nepromijenjenom obliku (Grosso i sar., 2005). Plazmatske koncentracije paraksantina opadaju sporije nego koncentracije kofeina i nakon 8 do 10 sati od unosa postaju više od koncentracija kofeina (Arnaud, 1993). Metabolizam paraksantina se odvija putem dvije reakcije, od kojih je jedna 7-demetilacija paraksantina, kojom nastaju 3 metabolita: 1-metilksantin, 1-metilurat i 5-acetilamino-6-formilamino-3- metiluracil; dok drugom reakcijom nastaje 8-hidroksiparaksantin. U urinu se moţe lako detektirati 5-acetil-6-amino-3-metiluracil koji je nastao iz 5-acetilamino-6-formilamino-3- metiluracila. Svi ovi metaboliti paraksantina se veoma brzo po nastanku javljaju u urinu, zahvaljujući aktivnoj bubreţnoj tubularnoj sekreciji (Grosso i sar., 2005). Paraksantin djeluje stimulativno na lipolizu u organizmu i tako dovodi do povećanog nivoa glicerola i slobodnih masnih kiselina u plazmi (Uwubetine, 2010). Teobromin je metabolit kofeina koji se pri oralnom unosu jako brzo apsorbuje i ima poluţivot izmeďu 8 i 12 sati. Njegov metabolički klirens je posredovan prvenstveno enzimom CYP1A2, koji se smatra odgovornim za oko 86% demetilacije teobromina, dok manju ulogu igra i CYP2E1. Teobromin izaziva različite farmakološke efekte, u koje spadaju diureza, relaksacija glatke muskulature, povećana glandularna sekrecija, kao i stimulacija kardiovaskularnog sistema. Teofilin je takoďer metabolit kofeina, ima slično farmakološko djelovanje kao kofein i teobromin, ali i više izraţene toksikološke efekte. Teofilin ima dosta varijabilan poluţivot koji je duţi nego kod kofeina i iznosi izmeďu 3 i 9 sati. Do eliminacije teofilina dolazi putem bubrega u nepromijenjenoj formi ili u vidu metabolita, za čije nastajanje je odgovoran prvenstveno CYP1A2, koji vrši N-demetilaciju do monometilksantina, te 8-hidroksilaciju do 1,3-dimetil-mokraćne kiseline. Urinarna ekskrecija ovisi o protoku urina, te dozi, pri čemu 11
viša plazmatska koncentracija teofilina ukazuje na povećan renalni, a smanjen metabolički klirens. Na klirens teofilina utječu razni faktori, kao što su cigarete, virusne infekcije, bolesti jetre i srca, hrana, kao i upotreba lijekova (Grosso i sar., 2005). Na slici 5. su prikazani kofein i njegovi metaboliti, uz procentualnu zastupljenost metabolita. O CH 3 H 3 C N N O N N CH 3 Kofein O CH 3 O H H 3 C N N O CH 3 H 3 C N N O N N H N N O N N H Paraksantin (84%) O N N CH 3 Teofilin (4%) CH 3 Teobromin (12%) Slika 5. Kofein i njegovi metaboliti (Uwubetine, 2010) 1. 3. 3. Mehanizam djelovanja kofeina Smatra se da kofein svoje biološke efekte iskazuje djelujući na sljedeće strukture: adenozinske receptore, fosfodiesteraze, GABA A receptore, 12
kalcijeve kanale, druga mjesta (Tavares i Sakata, 2012). Pri koncentracijama od 1 30 µm u organizmu (nakon nekoliko šoljica kahve), primarni efekt kofeina je antagonističko djelovanje na adenozinske receptore. Tek pri koncentracijama višim od fizioloških (> 100 µm) kofein ispoljava djelovanje na fosfodiesteraze, GABA A receptore, te kalcijeve kanale (Yu i sar., 2017). Djelovanje na adenozinske receptore Adenozin se proizvodi ekstracelularno kao produkt razlaganja adeninskih nukleotida. npr. ATP-a. Različite ekto-nukleotidaze vrše defosforilaciju ATP-a do AMP-a, koji se zatim prevodi u adenozin. TakoĎe, sinteza adenozina se dešava i intracelularno, djelovanjem citoplazmatske 5'-nukleotidaze ili hidrolizom S-adenozil-homocisteina. Intracelularni adenozin se prevodi u AMP djelovanjem adenozin kinaze ili u inozin djelovanjem adenozin deaminaze. Adenozin se proizvodi svuda u organizmu i njegovo neuroaktivno djelovanje je definisano prisustvom specifičnih receptora u odreďenim regijama mozga. Do danas su otkrivena četiri G-protein vezana receptora za adenozin, koji se nazivaju A 1, A 2A, A 2B i A 3 receptori. Iako su u mozgu prisutne sve četiri vrste ovih receptora, afinitet A 2B i A 3 receptora za adenozin je nizak i njihov bazalni nivo aktivacije je zanemariv. To znači da u normalnim fiziološkim uslovima kofein ne moţe djelovati blokadom A 2B i A 3 receptora. S druge strane, A 1 i A 2A receptori bivaju aktivirani nanomolarnim koncentracijama adenozina, koji je normalno prisutan u mozgu, te pokazuju veliki afinitet za kofein. Na osnovu toga se moţe zaključiti da kofein svoje efekte ispoljava djelovanjem na A 1 i A 2A adenozinske receptore (Fisone i sar., 2004). Sposobnost inhibicije adenozinskih receptora od strane kofeina igra jako vaţnu ulogu u njegovim efektima na ponašanje i kognitivnu funkciju. Kofein (kao i paraksantin) se kompetitivno veţe na adenozinske receptore i tako ispoljava utjecaj na efekte na CNS, pogotovo one koji uključuju neuromodulatorno djelovanje adenozina (Institute of Medicine Staff, 2001). Pri nagomilavanju adenozina u mozgu, dolazi do progresivnog smanjenja neuronske aktivnosti vezivanjem istog za adenozinske receptore. Kofein blokira adenozinske receptore i na taj način dovodi do stimulacije neuronske aktivnosti (Yu i sar., 2017). Zahvaljujući zaustavljanju inhibitornih efekata adenozina blokadom njegovih receptora, kofein indirektno utječe na lučenje noradrenalina, dopamina, acetilholina, serotonina, gamaaminobuterne kiseline, glutamata i moţda neuropeptida (Institute of Medicine Staff, 2001). 13
Djelovanje na fosfodiesteraze Fosfodiesteraze hidroliziraju fosfodiestersku vezu sekundarnih glasnika 3',5'-cikličnog adenozin monofosfata (camp) i 3',5'-cikličnog gvanozin monofosfata (cgmp) i tako dovode do nastanka odgovarajućih nukleozid monofosfata, AMP i GMP. Na taj način, fosfodiesteraze, zajedno sa adenilat i gvanilat ciklazama, igraju bitnu ulogu u regulaciji signalnih puteva zavisnih od camp i cgmp. Inhibicija fosfodiesteraza je već uobičajen pristup u farmakologiji u liječenju hipertenzije, upala, te hronične opstruktivne plućne bolesti (HOPB). Kofein je poznat kao inhibitor fosfodiesteraza još od njihovog otkrića, iako je njegov primarni mehanizam djelovanja ipak antagonizam adenozinskih receptora (Röhrig i sar., 2017). Inhibicijom fosfodiesteraza, kofein pojačava trajanje i efekat camp, te na taj način potencira efekte kateholamina. Ipak, za ovaj efekat su potrebne više koncentracije kofeina od onih prisutnih u organizmu nakon konzumiranja kahve. Naime, inhibicijska konstanta za inhibiciju fosfodiesteraza od strane kofeina iznosi 480 µm (Tavares i Sakata, 2012). Djelovanje na kalcijeve kanale Najraniji predloţeni mehanizam djelovanja kofeina uključuje mobilizaciju intracelularnog kalcija (Institute of Medicine Staff, 2001). Kofein stimulira aktivnost rijanodinskih receptora u endoplazmatskom retikulumu endotela (Echeverri i sar., 2010). Rijanodinski receptori su locirani u endoplazmatskom, odnosno sarkoplazmatskom retikulumu i odgovorni su za oslobaďanje intracelularnog kalcija u stanju ekscitacije (Lanner i sar., 2010). Kofein djeluje direktno na endotelne ćelije, stimulirajući produkciju nitrogen (II) oksida (NO). NO se sintetizira iz L-arginina i kisika pod utjecajem NO sintaze i uslov za odvijanje ove sinteze je vezivanje kalmodulina za enzim, što će se desiti samo u prisustvu kalcija. Kofein dovodi do pojačanog oslobaďanja kalcijevih jona iz retikuluma, što dovodi do povećanja koncentracije Ca 2+ jona u plazmi, što dalje dovodi do formiranja kompleksa kalmodulina i konačno do aktivacije NO sintaze. Ovaj mehanizam je u skladu s generalnim principom kalcijinduciranog oslobaďanja kalcija, prema kojem je u plazmi potrebna minimalna koncentracija kalcijevih jona, nedovoljna da aktivira NO sintazu, ali dovoljna da stimulira oslobaďanje još Ca 2+ iz retikuluma i tako poveća koncentraciju jona kalcija u plazmi. Smatra se da kofein smanjuje graničnu koncentraciju Ca 2+ jona potrebnu za aktivaciju mehanizma kalcijinduciranog oslobaďanja kalcija (Echeverri i sar., 2010). 14
Djelovanje na benzodiazepinske receptore Kofein i teofilin dolaze u interakciju s GABA A receptorima i blokiraju iste. Ipak, koncentracije kofeina potrebne da bi došlo do ovog efekta su nekoliko stotina puta više od koncentracija koje bivaju dostignute u organizmu prilikom normalne konzumacije kofeina (Tavares i Sakata, 2012). Na slici 6. je prikazan mehanizam djelovanja kofeina. Slika 6. Mehanizam djelovanja kofeina na striatopalidalne i striatonigralne neurone; A potencijalne interakcije između A 2A i D 2 receptora u GABAergičnim neuronima koji čine tzv. indirektni put; B pojednostavljen dijagram nucleus accumbensa i nekih njegovih ulaznih i izlaznih struktura; C interakcije između A 1, D 1 i glutamatnih receptora u neuronima koji čine tzv. direktni put (Fredholm i sar., 1999) 1. 3. 4. Biološka aktivnost kofeina Kofein je najviše korišten stimulans centralnog nervnog sistema (CNS) na svijetu (Institute of Medicine Staff, 2001). Razlog popularnosti kofeina, koja prevazilazi dobne i kulturološke granice, leţi u njegovim izraţenim psihostimulativnim sposobnostima, uz odsustvo jasno dokumentiranih negativnih efekata. Kofein ispoljava svoje psihostimulirajuće efekte zahvaljujući sposobnosti da djeluje na neurotransmisiju u različitim regijama mozga. Na taj način on dovodi do poboljšanih bihevioralnih funkcija, kao što su svjesnost, paţnja, raspoloţenje i uzbuďenost (Fisone i sar., 2004). TakoĎer, kofein smanjuje mentalni umor, ubrzava reakcije, povećava preciznost reakcija, poboljšava sposobnost koncentracije i drţanja paţnje, te dovodi do poboljšanja kratkotrajne memorije (Glade, 2010). Ovi odgovori na 15
upotrebu kofeina su meďusobno povezani i zavisni jedni od drugih, a granice izmeďu različitih odgovora nekad nisu potpuno jasne što oteţava njihovo pojedinačno posmatranje. Poboljšanje motorne aktivnosti od strane kofeina je bihevioralni efekt koji dobija najviše paţnje. Razlog tome je kontrola motorne aktivnosti relativno dobro karakteriziranim moţdanim krugovima i stoga je lako pratiti njene promjene. Kofeinom posredovane promjene u motornoj aktivnosti se mogu pripisati sposobnosti istog da utječe na neurotransmisiju unutar bazalnih ganglija, koje su uključene u različite aspekte motorne kontrole (Fisone i sar., 2004). Pored djelovanja na CNS, kofein pokazuje brojne fiziološke i farmakološke efekte, koji uključuju i djelovanje na kardiovaskularni i respiratorni sistem, bubrege, te glatke mišićne strukture (Institute of Medicine Staff, 2001). Djelovanje na kardiovaskularni sistem Konzumacija kahve, jednog od najviše konzumiranih napitaka širom svijeta, se smatra riziko faktorom za razvoj kardiovaskularnih bolesti. Unos kahve ili bilo kojeg drugog pića s kofeinom dovodi do akutnog povećanja krvnog pritiska, kao i srčanog minutnog volumena i srčanog indeksa, te do aktivacije simpatičkog nervnog sistema kod neredovnih konzumanata, dok kod ljudi koji svakodnevno konzumiraju kahvu ovaj efekat izostaje. Ovi akutni efekti su povezani s plazmatskim koncentracijama kofeina i prestaju oko jednog sata nakon unošenja kahve, a najvjerovatnije se javljaju zbog antagonističkog djelovanja kofeina na adenozinske receptore, što dovodi do vazokonstrikcije i povećanja perifernog otpora. Ovaj odgovor moţe objasniti porast dijastolnog pritiska u odnosu na sistolni nakon konzumacije kahve. Pri jako niskim dozama, kofein moţe dovesti do usporenog rada srca, dok u velikim dozama moţe dovesti do tahikardije i čak aritmije, koje su češće kod neredovnih konzumanata kahve. S druge strane, u nekim stanjima, poput postprandijalne hipotenzije, kahva se preporučuje u terapeutske ili preventivne svrhe (Sudano i sar., 2005). Djelovanje na respiratorni sistem Stimulativno djelovanje ksantina na respiratorni sistem nastaje blokadom adenozinskih receptora u respiratornim centrima. Kofein povećava osjetljivost respiratornog centra na CO 2, dok periferno kofein ima inhibitorni efekt na disanje blokiranjem adenozinskih A 2A receptora u karotidnom tijelu. Upotreba kofeina je jako zastupljena u tretmanu apnee prerano roďenih beba s minimalnom incidencom neţeljenih efekata. TakoĎer, čini se da kofein poboljšava plućnu funkciju kod astmatičnih pacijenata i smatra se da se to postiţe pojačanim efektom bronhodilatatora. 16
Djelovanje na renalni sistem Poznato je da kofein i teofilin ispoljavaju diuretsko i natriuretsko djelovanje i zbog toga se oni koriste u tretmanu edema povezanih s kongestivnim srčanim zatajenjem. Ovaj efekat nastaje antagonizmom adenozinskih A 1 i A 2A receptora (Tavares i Sakata, 2012). Djelovanje na jetru Nekoliko novijih studija ukazuje na povezanost izmeďu unosa kofeina i smanjenog rizika za razvoj nealkoholne masne bolesti jetre, stanja povezanog s prekomjernom tjelesnom masom, koje je postalo jedan od glavnih uzroka bolesti jetre širom svijeta. Kofein smanjuje intrahepatički sadrţaj lipida i stimulira β-oksidaciju u jetrenim ćelijama autofago lizozomalnim putem. Kod miševa sa mastima bogatom ishranom, kofein značajno smanjuje hepatosteatozu, te istovremeno povećava autofagiju i preuzimanje lipida u lizozomima (Sinha i sar., 2014). Druga djelovanja kofeina Poznato je da se kofein koristi kao pomoćna supstanca u terapiji s nesteroidnim antiinflamatornim lijekovima i paracetamolom, obično u lijekovima za glavobolju, te pospješuje djelovanje ovih lijekova i do 40% i ubrzava njihov efekat (Ribeiro i Sebastião, 2010). S druge strane, postoji jako malo informacija o upotrebi kofeina uz terapiju opioidima. U studiji koju je 2017. proveo Scott JR sa saradnicima utvrďeno je da korištenje kofeina uz opioide ima umjeren, ali značajan utjecaj na bol pri liječenju fibromijalgije, jer su u grupama kojima je uz opiode apliciran i kofein u malim ili umjerenim dozama pacijenti izrazili manji osjećaj bola nego u grupama u kojima isti nije primijenjen, što ukazuje na to da bi se kofein mogao koristiti kao pomoćni lijek uz opiode pri liječenju pacijenata oboljelih od hroničnog bola sličnog fibromijalgiji (Scott i sar., 2017). Zadnjih godina je probuďen veliki interes vezan za antiinfektivno djelovanje kofeina. U studiji koju su 2016. godine proveli Omkar Hemant Lele i saradnici dokazano je da kofein posjeduje izraţenu antimikrobnu aktivnost na S. aureus i MRSA. TakoĎer, kofein je pokazao sinergističko djelovanje s antibioticima Mupirocinom, Amoksiklavom, Hloramfenikolom, Linezolidom i Rifampicinom. Uz to, antibiotici koji su inače neefikasni u djelovanju na biofilm, s kofeinom su pokazali aktivnost na isti (Lele i sar., 2016). Pored toga, kofein ispoljava djelovanje na još neka stanja kao što su depresija, anksioznost, Huntingtonova bolest, shizofrenija, epilepsija, a smatra se i da kofein poboljšava simptome Parkinsonove 17
bolesti. Kod epileptičnih bolesnika je potreban oprez pri korištenju kofeina. Naime, adenozin, prepoznat kao antikonvulziv, to djelovanje ostvaruje blokadom A 1 adenozinskih receptora, što dovodi do smanjenja pretjerane moţdane aktivnosti, dok kofein, s druge strane, dovodi do blokade ovih receptora i moţe povećati rizik za epileptični napad (Ribeiro i Sebastião, 2010). 1. 3. 5. Regulacija unosa kofeina Većina svjetske populacije unosi kofein u svoj organizam skoro svakodnevno i glavni izvori istog su kahva, čaj i gazirana pića. Masa kofeina u jednoj šolji kahve (volumena oko 240 ml) obično iznosi oko 80 mg, mada moţe varirati od 5 do 190 mg u zavisnosti od načina pripreme kao i u zavisnosti od same veličine šolje. Redovni konzumenti kahve dnevno obično unesu oko 256 mg kofeina u svoj organizam (u prosjeku 4,3 mg kofeina po 1 kg tjelesne mase za osobu koja ima 60 kg), iako taj broj za 90% potrošača kahve iznosi izmeďu 5 i 7 mg po 1 kg tjelesne mase. Najveći broj studija ukazuje na to da unos kofeina od 400 i manje mg dnevno nema negativan utjecaj na zdravlje za većinu konzumenata. Pošto se kofein prirodno javlja u čaju i kahvi, teško je odrediti maksimalne dozvoljene nivoe kofeina za njih. No, za proizvode u kojima kofein nije prirodno prisutan postoje neka ograničenja u većini zemalja. Zanimljivo, u Evropskoj Uniji ne postoji gornja granica kofeina za proizvode s istim, ali na proizvodima koji sadrţe više od 150 mg/l mora biti spomenuto da imaju visoki sadrţaj kofeina. Akutna toksična doza kofeina nije dobro definisana, ali smatra se da za odrasle iznosi više od 10 grama kofeina dnevno, dok se u većini drţava ne preporučuje unos više od 450 mg kofeina dnevno (GRAS, Heckman i sar., 2010). 1. 3. 6. Biosinteza i sinteza kofeina Biosinteza kofeina Purinski alkaloidi nastaju iz purinskih nukleozida, a najznačajniji predstavnici purinskih alkaloida su kofein i teobromin. Biosinteza purinskih alkaloida započinje N-metilacijom ksantozina na poziciji 7, djelovanjem enzima 7-metilksantozin sintaze (XRS), koji je moţda i poznatiji pod drugim nazivom, 7-N-metiltransferaza (XMT), za koji su izolovane srodne cdna iz kahve (Coffea Arabica). Naredni korak u sintezi purinskih alkaloida je prelazak 7- metilksantozina u 7-metilksantin hidrolizom, ali enzim koji katalizira ovu reakciju još uvijek 18
nije definisan. Ipak, detaljne strukturalne analize XMT ukazuju na to da postoji kuplovana reakcija 7-N-metilacije i cijepanja nukleozida, što je katalizirano istim enzimom. Sljedeće dvije N-metilacije su katalizirane od strane enzima kodiranih s nekoliko cdna s različitim supstratnim specifičnostima, koje su dobijene iz čaja, kahve ili kakaa. Kofein sintaza (CS) katalizira dvostruku metilaciju, prvo na mjestu 3, što dovodi do nastanka teobromina, a zatim na mjestu 1, što konačno daje kofein. TakoĎer, izolovano je nekoliko enzima kodiranih s cdna, koji kataliziraju samo jednu N-metilaciju. 7-metilksantin metiltransferaza (MXMT1 i MXMT2) i teobromin sintaza (TS) metiliraju samo poziciju N-3, dok 3,7-dimetilksantin metiltransferaza (DXMT) katalizira finalnu metilaciju na poziciji N-1, čime nastaje kofein. Ove aminokiseline posjeduju više od 80% aminokiselinske sličnosti i filogenetska analiza nagovještava da su one srodnije karboksil-metiltransferazama nego drugim N- metiltransferazama (Ziegler, 2008). Biosinteza kofeina je prikazana na slici 7. Slika 7. Biosinteza kofeina (Ziegler, 2008) Sinteza kofeina po Fischeru Totalnu sintezu kofeina je prvi izveo Emil Fischer 1898. godine u Berlinu. U ovom postupku prvo dolazi do reakcije izmeďu dimetiluree i malonske kiseline pri čemu nastaje pirimidinski prsten s adekvatno postavljenim metilnim i keto grupama, a zatim dolazi do nitrozilacije s nitritnom kiselinom, uz redukciju na platini, usljed čega dolazi do uvoďenja amino grupe na poziciji 5, gdje reakcija s kalij cijanatom obezbjeďuje nedostajuće atome za imidazolni dio, 19
nakon čega dolazi do zatvaranja prstena i formiranja dimetilmokraćne kiseline. Dalje se vrši hlorinacija sa fosfor pentahloridom na poziciji 8, kao i redukcija s pušljivom HI, čime dolazi do nastanka teofilina. Posljednji korak u sintezi je metilacija teofilina metil jodidom na poziciji 7, što dovodi do nastanka kofeina. Na slici broj 8 je prikazana sinteza kofeina po Fischeru (Oestreich-Janzen, 2016). Slika 8. Sinteza kofeina po Fischeru (Oestreich-Janzen, 2016) 1. 4. Ekstrakcija Ekstrakcija je separaciona metoda koja se koristi za razdvajanje smjese materija, kao i za prečišćavanje materija od raznih primjesa. Zasnovana je na različitoj topivosti materija u nekom otapalu ili u dva otapala koja se meďusobno ne miješaju (Dţudţević-Čančar i Salihović, 2016). 20
Tri široko korištene ekstraktivne tehnike su tečno-tečna ekstrakcija (LLE, eng. liquid-liquid extraction), ekstrakcija na čvrstoj fazi (SPE, eng. solid-phase extraction), te mikroekstrakcija na čvrstoj fazi (SPME, eng. solid-phase microextraction) (Wells, 2003). 1. 4. 1. Teĉno-teĉna ekstrakcija Ekstrakcija ili razdvajanje hemijske supstance X, koja je otopljena u tečnoj fazi A, se moţe uspješno izvesti ako se data otopina dovede u kontakt s drugom fazom (faza B). Vaţno je napomenuti da se faze A i B ne smiju miješati. Nakon kontakta faza koje se ne miješaju, analit će se raspodijeliti izmeďu njih, a zatim će se isti preuzeti iz faze B zbog obavljanja naredne ekstrakcije ili instrumentalne analize. Reverzibilna reakcija distribucije se moţe predstaviti kao X A X B, a konstanta distribucije se onda, prema Nernstovom zakonu distribucije, računa prema formuli K D = [X B ]/[X A ]. Srednje zagrade naglašavaju da se radi o koncentraciji hemijske komponente X u datoj fazi na odreďenoj temperaturi, odnosno aktivnosti za neidealne otopinae. Prema konvenciji, koncentracija u fazi B se piše u brojniku jednačine, a konstanta distribucije je nezavisna od brzine kojom ravnoteţa bude postignuta. Iz jednačine moţemo zaključiti da visoka vrijednost konstante distribucije ukazuje na jako veliki prelazak supstance X iz faze A u fazu B, dok, s druge strane, niska vrijednost K D ukazuje na slabu ekstrakciju iz faze A u fazu B. Ako je konstanta distribucije K D = 1, to znači da je koncentracija analita u fazama A i B jednaka (Wells, 2003). U laboratoriju organske hemije ekstrakciji najčešće bivaju podvrgnute vodene otopine, a jedna od najviše korištenih metoda je diskontinuirana ekstrakcija koja se izvodi uz pomoć lijevka za razdvajanje. Naime, u lijevak se sipa otopina iz koje će se vršiti ekstrakcija, a zatim se dodaje sredstvo kojim će se izvršiti ekstrakcija. Pri korištenju lijevka za ekstrakciju je jako vaţno da on ne bude napunjen do više od 2/3 svog volumena jer će pri mućkanju doći do povećanja pritiska unutar lijevka. Mućkanje se vrši tako što se gornji tubus lijevka zatvori čepom, dok se slavina zavrne i onda se, pridrţavajući čep i slavinu rukama, oprezno mućka. Nakon odreďenog perioda mućkanja, lijevak se okrene naopako (tako da je slavina okrenuta prema gore) i slavina se otvori da bi došlo do izjednačavanja pritiska. To se vrši sve dok se pritisak u lijevku ne prestane mijenjati, tj. dok se ne izjednači s atmosferskim pritiskom, a onda se lijevak energično mućka jednu do dvije minute. Nakon toga se lijevak ostavlja da stoji u uspravnom poloţaju pri čemu dolazi do razdvajanja faza. 21
Kod ove vrste ekstrakcije će donji sloj obično biti vodeni zbog veće gustine vode od gustine većine organskih otapala, no, postoje i odreďeni izuzeci, a to su dihlormetan, hloroform i karbonttrahlorid. Pri korištenju ovih otapala gornji sloj će biti vodeni, dok će donji biti organski, zahvaljujući njihovoj većoj gustini od gustine vode. Pri nesigurnosti u prirodu slojeva, tj. koji je sloj vodeni, a koji organski, potrebno je uzeti kap bilo kojeg sloja i dodati je u epruvetu s vodom. Ako se kap pomiješa s vodom, to znači da je uzeta kap vodenog sloja, dok u suprotnom slučaju znači da je to bio organski sloj. Jako čest problem pri ekstrakciji je i nastajanje emulzije, čiji se nastanak moţe pokušati spriječiti što blaţim mućkanjem, a nakon nastanka ista se moţe ukloniti dodatkom amilalkohola ili NaCl, dok je najbolji način ipak duţe stajanje, jer će emulzija u većini slučajeva nestati nakon odreďenog vremenskog perioda. Nekoliko kapi posljednje porcije ekstrakta se moţe upariti na sahatnom staklu do suha da bi se provjerilo je li ekstrakcija završena i ako ne ostane nikakav ostatak, to znači da je došlo do kraja ekstrakcije (Dţudţević-Čančar i Salihović, 2016). 1. 4. 2. Ĉvrsto-teĉna ekstrakcija Ako je potrebno izvršiti ekstrakciju neke supstance iz smjese čvrstih materija, potrebno je u tu smjesu dodati odgovarajuće otapalo, nakon čega se dobijena otopina filtrira i potom se iz nje izdvaja ţeljena supstanca. To se moţe izvršiti uparavanjem ili destilacijom. Ovakva ekstrakcija, provedena na sobnoj temperaturi, se naziva maceracija. Ipak, mnoge supstance nije moguće izolovati maceracijom i jako često se vrši ekstraktivni proces koji se obavlja na povišenoj temperaturi, zvani digestija. Ovaj proces se najčešće vrši u tikvici s povratnim hladilom. Bilo da se radi o maceraciji ili digestiji, usitnjenost smjese iz koje se vrši ekstrakcija ima veliki utjecaj na stepen ekstrakcije. Dakle, što je smjesa usitnjenija, ţeljena supstanca će biti bolje izolovana (Dţudţević-Čančar i Salihović, 2016). 1. 4. 3. Ekstrakcija kofeina Ekstrakciju kofeina tečno-tečnom metodom moguće je izvesti iz zrna zelene kahve kao i iz prţenog zrna. Na primjer metoda ekstrakcije iz zrna zelene kahve se odvija na način da se zrna smrve, stave u čašu s destilovanom vodom i tako kuhaju 10 minuta. Nakon toga se dobijena smjesa ohladi na sobnu temperaturu i filtrira, a dobijeni filtrat se alkalizira s Na 2 CO 3. Iz alkalizirane smjese kofein biva ekstrahiran tri puta s dihloroetanom, a nakon toga se kombinirani organski sloj suši preko bezvodnog Na 2 SO 4. Otapalo se destilira u vakuumu, dok 22
se nastali kristali kofeina otapaju u hloroformu, otopina razblaţuje i analizira tečnom hromatografijom visoke moći razdvajanja (HPLC). Čvrsto-tečna ekstrakcija kofeina se moţe provesti iz zrna zelene kahve koristeći Soxhlet aparaturu. Naime, zdrobljena i usitnjena zrna kahve se stave u ekstrakcijski tuljak, dok se u tikvicu stavi dihloroetan i ekstrakcija traje 30 minuta, a nakon toga se organska otopina hladi na sobnu temperaturu i filtrira. Filtrat se potom destilira u vakuumu pri temperaturi od 60 C kako bi se uklonilo otapalo korišteno u ekstrakciji. Destilacijski ostatak se otapa u hloroformu, a dobivena otopina se rablaţi i biva podvrgnuta HPLC analizi (Sanda i sar., 2015). Ove metode se primjenjuju i za ekstrakciju iz zrna prţene kahve. Dekafeinacija U ranom 19. stoljeću, naučnici su tragali za načinom odstranjivanja kofeina iz kahve. Prvi hemičar koji je razvio grubu metodu dekafeinacije je, kako je već ranije rečeno, Friedrich Ferdinand Runge. U dvadesetom stoljeću je proces dekafeinacije poboljšan, a značajnu ulogu u tome je imao Roselius, koji je uveo tretiranje zrna kahve vodenom parom, od čega ista nabubre i onda ih je lakše ekstrahirati otapalom benzenom. Danas se koriste tri metode dekafeinacije, jedna u kojoj se koriste hemijska otapala; druga, u kojoj se koriste superkritični fluidi i treća, tzv. Swiss water process. U procesu s hemijskim otapalima, zrna kahve su izloţena pari, a zatim se kuhaju pod pritiskom s otapalom koje ekstrahira kofein bez da izazove bilo kakve druge efekte na kahvi. Otapala odobrena od strane Američke agencije za hranu i lijekove (eng. Food and Drug Administration- FDA) za korištenje pri izvoďenju ove metode su dihlorometan i etil acetat. Metoda sa superkritičnim gasovima zahtijeva izlaganje zrna kahve superkritičnom CO 2. Tačka na kojoj se gas ponaša više kao tečnost nego gas se naziva kritična tačka Superkritični CO 2 se tako ponaša kao tečnost, ulazi u zrno kahve, ekstrahuje kofein i napušta zrno neoštećeno. Swiss water process je metoda razvijena i baš tako nazvana da bi ublaţila strahove javnosti o štetnosti hemikalija korištenih za dekafeinaciju, iako su odobrene od strane FDA, jer javnost bi se morala sloţiti da je dekafeinacija u kojoj se koristi samo voda zaista bezopasna. Pri izvoďenju ove metode zrna zelene kahve se potope u vruću vodu, što omogućava kofeinu prelazak iz zrna u vodu, a taj ekstrakt dalje prolazi kroz aktivni ugalj, koji uklanja kofein. Smjesa osloboďena od kofeina se zatim vraća djelomično osušenim zrnima kahve s početka (Oestreich-Janzen, 2016). 23
2. HIPOTEZE Nulta hipoteza: Sadrţaj ekstrahiranog kofeina je isti u svim uzorcima mljevene kahve. Radna hipoteza: Sadrţaj ekstrahiranog kofeina je različit u različitim uzorcima mljevene kahve. Alternativna hipoteza: Sadrţaj ekstrahiranog kofeina zavisi od vrste mljevene kahve kao i od metode ekstrakcije. 24
3. CILJEVI RADA S obzirom na tradiciju ispijanja kahve u našem društvu i veliki broj različitih vrsta kahve dostupnih na domaćem trţištu, odreďivanje količine unesenog kofeina je od velikog značaja. Tretirat će se sedam uzoraka najčešće korištene mljevene kahve (po preporuci trgovaca) upotrebom dvije metode. Stoga su postavljeni sljedeći ciljevi: ekstrakcija kofeina iz različitih vrsta mljevene kahve dostupnih na domaćem trţištu; ekstrakcija kofeina iz kahve u zrnu; uporeďivanje sadrţaja kofeina u nastalim ekstraktima svakog pojedinog uzorka različith vrsta kahve; uporeďivanje sadrţaja ekstrahovanog kofeina iz različitih vrsta mljevene kahve dostupnih na domaćem trţištu; uporeďivanje sadrţaja ekstrahovanog kofeina iz različitih vrsta mljevene kahve sa sadrţajem ekstrahovanog kofeina iz kahve u zrnu. ispitivanje utjecaja primjesa u pakovanoj mljevenoj kahvi na stepen ekstrakcije kofeina u odnosu na kahvu u zrnu, bez primjesa; ispitivanje neprečišćenog uzorka kofeina tankoslojnom hromatografijom (TLC); ispitivanje tačke topljenja neprečišćenog uzorka; ispitivanje uzorka kofeina tankoslojnom hromatografijom nakon prečišćavanja sublimacijom; ispitivanje tačke topljenja nakon prečišćavanja sublimacijom. dokazivanje kofeina analizom infracrvenom spektroskopijom s Fourierovom transformacijom (FTIR) u neprečišćenom i prečišćenom uzorku; Obrada i prikaz dobijenih rezultata 25
4. MATERIJAL I METODE 4. 1. Materijal Uzorci: 6 vrsta mljevene kahve dostupnih na domaćem trţištu: Uzorak 1. Tucaffe kahva 100 g, Uvozi, prţi, melje, pakuje: Tucaković Commerce d.o.o., Safeta Zajke br. 55, Sarajevo, Bosna i Hercegovina; Uzorak 2. Special kahva 100 g, Proizvodi: BRANCK-CAFFE d.o.o., 88243 Broćanac, Posušje, Bosna i Hercegovina; Uzorak 3. Grand kahva 100 g, Proizvodi: GRAND PROM D.o.o., Bijeljina, Glavičice bb 76318, Bijeljina, Bosna i Hercegovina; Uzorak 4. Prima kahva 100 g, Proizvodi: AM PRIMA Company d.o.o., Blaţujski drum 10, 71210 Ilidţa, Sarajevo, Bosna i Hercegovina; Uzorak 5. Brazil kahva 100 g, Prţi i pakuje: EUROVIP d.o.o., Industrijska zona bb, 88260 Čitluk, Bosna i Hercegovina; Uzorak 6. Franck kahva 100 g, Proizvodi i pakuje: Franck d.o.o. Sarajevo, Ul. dr Fetaha Bećirbegovića 45, 71000 Sarajevo, Bosna i Hercegovina. Uzorak 7. Minas kahva u zrnu 250 g, Prţi i pakuje: ŠEHAR d.o.o., Dţenetića Čikma bb, 71000 Sarajevo, Bosna i Hercegovina. Hemikalije: Dihlormetan, Tk = 39,6 o C, ρ = 1,3266 g/cm 3, (Sigma Aldrich, Njemačka), Olovo (II) acetat (w = 0,1), Natrij hidroksid (w = 0,05), Bezvodni natrijev sulfat (Na 2 SO 4 ), Etanol, Metanol, Tk = 64,7 o C, ρ = 0,792 g/cm 3, (Sigma Aldrich, Njemačka) Hloroform, Aceton, 26
Standard kofeina, (Merck, Identified uses: Pharmaceutical production, cosmetic raw material, Njemačka). Pribor: Električni rešo, Erlenmajer tikvica 300 ml, Laboratorijska čaša 200 ml, Lijevak za ekstrakciju 250 ml, Gumene rukavice, Büchnerov lijevak s vakuum bocom i vakuum pumpa, Menzura 50 ml, TLC ploča (Sigma Aldrich, Njemačka), Komora za izvršavanje tankoslojne hromatografije, UV lampa, 254 nm (Spectroline, SAD), Digitalna vaga, Analitička vaga (Mettler Toledo AX205DR/A (Švicarska)), Plamenik, Aparat za odreďivanje tačke topljenja (Kruss, Njemačka), Aparatura za cold finger sublimaciju, FTIR Spectrum BX, Perkin Elmer instrument za FTIR analizu. 4. 2. Metode korištene u radu Za potrebe ovog rada korištene su različite hemijske metode i protokoli za ekstrakciju, odvajanje i karakterizaciju kofeina. Provedena je ekstrakcija kofeina iz različitih vrsta kahve dostupnih na domaćem trţištu dvjema metodama, od kojih je jedna hemijska, a druga obična metoda kuhanja, koja se koristi pri svakodnevnom pripremanju kahve, primjenom čvrsto-tečne i tečno-tečne ekstrakcije. Analizirano je 6 vrsta kupovne mljevene kahve, te jedna kahva u zrnu, koju smo samljeli prije analize. Dalje je izvršeno ispitivanje uzoraka tankoslojnom hromatografijom, te odreďivanje tačke topljenja aparatom za odreďivanje iste, a zatim prečišćavanje dobijenog kofeina vakuumskom sublimacijom. Nakon prečišćavanja je ponovo izvršeno odreďivanje tačke 27
topljenja, kao i tankoslojna hromatografija. Na kraju, uraďena je hemijska karakterizacija uzoraka kofeina FTIR analizom, usporedbom sa standardom kofeina. Ekstrakcija kofeina Ekstrakcija je, kako je već rečeno, provedena koristeći dvije metode, obično kuhanje i refluksiranje (Nikolić, 2010). (Slika 9). Slika 9. Refluksiranje kahve U prvoj metodi je u Erlenmajer tikvicu od 300 ml s ravnim dnom stavljeno 40 g mljevene kahve i 150 ml vode. Smjesa se refluksirala uz povratno hladilo 20 minuta uz zagrijavanje preko grijaće ploče. Nakon refluksiranja vruća smjesa je bila profiltrirana preko Büchnerovog lijevka preko grubog filter papira (slika 10), te je talog bačen, a filtrat upotrijebljen za daljnje istraţivanje. 28
Slika 10. Filtriranje preko Büchnerovog lijevka Nakon filtriranja, filtrat je ponovo stavljen u Erlenmajer tikvicu od 300 ml, u koju je takoďer dodato 25 ml vodene otopine olovo (II) acetata. Smjesa je, uz povremeno miješanje, zagrijavana 5 minuta, pri čemu je došlo do stvaranja netopivog taloga, što se moţe vidjeti na slici 11. Slika 11. Zagrijavanje filtrata s olovo (II) acetatom 29
Vruća otopina je dalje profiltrirana preko Büchnerovog lijevka na koji je bio postavljen filter papir koji je prekriven silikagelom. Bilo je potrebno staviti silikagel iz razloga što su nastale soli ţelatinozne i mogle bi zatvoriti pore filter papira. Nakon toga se talog isprao s 20 ml vruće vode i filtrat je ohlaďen, a zatim stavljen u lijevak za ekstrakciju od 250 ml, te je izvršena ekstrakcija s 20 ml dihlormetana. Pošto dihlormetan ima veću gustinu od vode, organski sloj je donji sloj i on je otpušten u čašu, a vodeni sloj je još jednom ekstrahiran s 20 ml dihlormetana. Ekstrakcija je izvršena uz blago mućkanje jer bi prejako mućkanje dovelo do stvaranja emulzije. Potom su sastavljeni dihlormetanski slojevi iz dvije ekstrakcije, stavljeni u lijevak za ekstrakciju, te je dodato još 10 ml NaOH. Nakon razdvajanja slojeva, organski sloj se ponovo prenio u čašu, odstranio se vodeni sloj, dihlormetanski sloj se vratio u lijevak za razdvajanje i ispirao s još 10 ml vode. Ispiranje s NaOH je bilo potrebno da bi se odstranili tragovi preostalih kiselina dok je voda bila potrebna za ispiranje zaostalog NaOH. Ekstrakcija u lijevku za razdvajanje je prikazana na slici 12. Slika 12. Ekstrakcija kofeina s dihlormetanom (A); ispiranje dihlormetana s NaOH (B); ispiranje ostataka NaOH s vodom (C). Nakon ispiranja zaostalog NaOH vodom, korišten je lakmus papir da bi se provjerila ph neutralnost organskog sloja. Lakmus papir izvaďen iz neutralne otopine moţemo vidjeti na 30
slici 13. Naime, u kiseloj otopini bi lakmus papir poprimio crvenu boju, dok bi, s druge strane, u baznoj, poprimio plavu boju. Slika 13. Utvrđivanje neutralnosti organskog sloja upotrebom lakmus papira Dalje se u čašu s dihlormetanskim slojem dodao bezvodni natrijev sulfat, preko kojeg je vršeno sušenje 10 minuta, a nakon toga je organski sloj dekantiran te je izvršeno uparavanje dihlormetana do suha na rešou i u čaši je ostao neprečišćeni kofein (slika 14). Slika 14. Otparavanje dihlormetana 31
Čaša u kojoj se vršilo otparavanje otapala je prvo izvagana prazna na digitalnoj vagi, a zatim je nakon otparavanja otapala i hlaďenja izvagana sa zaostalim neprečišćenim kofeinom na digitalnoj vagi. Iz razlike je dobijena masa neprečišćenog kofeina, koja je podijeljena s početnom masom kahve i pomnoţena s brojem 100, čime je dobijen sadrţaj neprečišćenog kofeina. Sadrţaji neprečišćenog kofeina za različite vrste kahve su navedeni u tabeli 3. na 38. strani ovog rada. U drugoj korištenoj ekstraktivnoj metodi se razlikuje prvi dio postupka, jer kahva nije kuhana uz povratno hladilo već je samo prelivena vrelom vodom, na način na koji se kahva priprema pri svakodnevnoj upotrebi, i nije korišten olovo (II) acetat. Nakon što je zalivena vodom, kahva je profiltrirana kroz Büchnerov lijevak i filtrat je ostavljen da se ohladi. Dalje se filtrat prenio u lijevak za ekstrakciju od 250 ml i bio podvrgnut istom postupku kao i u prvoj metodi. Tankoslojna hromatografija (TLC) Hromatografija je metoda zasnovana na različitoj adsorpciji pojedinih supstanci iz otopine na neku površinu (adsorbens) Supstance koje su često jako slične kako hemijski, tako i fizički, imaju različitu moć adsorpciju i zahvaljujući hromatografiji je moguće bez problema izvršiti separaciju nekih supstanci, koja bi drugim metodama bila jako teška ili čak i nemoguća (Dţudţević-Čančar i Salihović, 2016). Tankoslojna hromatografija (TLC eng. Thin Layer Chromatography) je metoda razvijena 1951. godine od strane J. G. Kirchnera i saradnika, koju su kasnije standardizirali E. Stahl i saradnici. To je jeftina, jednostavna metoda za čije izvoďenje je potrebno malo instrumenata i malo vremena, a koristi se za separaciju smjesa i kvalitativnu identifikaciju ili semikvantitativnu, vizuelnu analizu uzoraka. Pri izvoďenju TLC prvo se izvrši priprema uzorka. Jako je vaţno odabrati adekvatno otapalo pri pripremi uzorka, koje će imati odgovarajuću viskoznost i isparljivost, te sposobnost da nakvasi stacionarnu fazu, ali da ne dovede do neţeljenog razvoja prilikom nanošenja uzorka. TakoĎer je vaţno da otopina bude dovoljno koncentrisana da bi se analit mogao detektovati. Uzorci se paţljivo kapilarama nanose na stacionarnu fazu (koju najčešće čini silika gel na aluminijskoj ploči) u obliku tačkica, pri čemu je potreban veliki oprez da ne bi došlo do oštećenja stacionarne faze. Nakon isparavanja otapala u kojem su bili otopljeni uzorci, ploča za TLC se stavlja u komoru u koju je već stavljena mobilna faza, gdje će se vršiti razvijanje 32
hromatograma. Izbor mobilne faze u tankoslojnoj hromatografiji ima ključni utjecaj na kvalitet separacije, a pošto mobilna faza isparava prije detekcije zona, za TLC se moţe koristiti veći broj otapala. Komora se onda zatvori i počne razvijanje hromatograma jer se mobilna faza kreće uz ploču i sa sobom nosi komponente smjese koje se kreću različitim brzinama i na kraju preďu različite udaljenosti, te tako dolazi do separacije. Nakon završetka razvijanja hromatograma (što obično traje izmeďu 3 i 60 minuta), ploča se izvadi iz komora, mobilna faza ispari, a zatim se vrši detekcija zona fizičkim ili hemijskim metodama (Sherma, 2006). Odnos udaljenosti koju je prešla odreďena supstanca i udaljenosti koju je prešla mobilna faza se naziva retencioni faktor: Rf = x / y x put koji je prešla odreďena supstanca pri razvoju, y put koji je prešla mobilna faza od startne linije. Pri izradi ovog rada za izvoďenje tankoslojne hromatografije je korištena ploča sa slika gelom na aluminijskoj potpori, dok je kao otapalo za uzorke korišten 96% etanol. Kao mobilna faza korištena je mješavina acetona, hloroforma i metanola u omjeru 1:1:1. Na slici 15. dat je prikaz komore za razvijanje hromatograma sa TLC pločom na početku i na kraju razvijanja hromatograma. Slika 15. TLC ploča u komori za razvijanje 33
Tačka topljenja Tačka topljenja je temperatura na kojoj čvrsta faza preďe u tečnu fazu. To je osobina čvrstog stanja i zbog toga na nju utjecaj imaju osobine čvrstih supstanci, kao što su amorfna ili kristalna priroda, alotropija, polimorfizam, molekularna simetrija. Empirijsko pravilo ustanovljeno od strane Carnelley-a 1882. godine, nakon odreďivanja tačke topljenja za preko 15 000 supstanci, kaţe da će supstanca imati veću tačku topljenja što je veća njena molekularna simetrija. Naime, molekularna simetrija odreďuje koeficijent pakiranja u kristalu, koji predstavlja odnos zauzetog i slobodnog prostora u kristalu. Veća vrijednost ovog koeficijenta znači veću zauzetost prostora, odnosno više molekula u jednoj ćelijskoj jedinici i stoga i višu tačku topljenja (Rao i Shravan, 2007). Moţe se reći da je talište temperatura na kojoj je čvrsta supstanca u ravnoteţi sa svojim rastopom. Čiste supstance uvijek imaju oštro talište, dok nečiste supstance u pravilu imaju niţe talište od čistih (Dţudţević-Čančar i Salihović, 2016). Tačka topljenja je odreďena za uzorke kofeina prije i nakon prečišćavanja, koristeći aparat za odreďivanje tačke topljenja (Kruss, Njemačka), koji je prikazan na slici 16. te je provjerena literaturna vrijednost tačke topljenja za standard kofeina, a zatim je izvršeno poreďenje dobijenih rezultata s literaturnom vrijednošću. Slika 16. Aparat za određivanje tačke topljenja 34
Vakuumska sublimacija Sublimacija je proces prelaska nekih supstanci direktno iz čvrstog u gasovito stanje pod utjecajem toplote, odnosno direktno iz gasovitog u čvrsto stanje hlaďenjem, pri čemu se tečno agregatno stanje potpuno zanemaruje. Ovaj postupak se obično primjenjuje pri prečišćavanju organskih supstanci i njime se mogu uspješno prečistiti veoma male količine supstanci, a pri tome ne dolazi do gubitaka koji su neizostavni kod nekih drugih proces, npr. prekristalizacije. Do prelaska iz čvrste faze direktno u gasovitu moţe doći ako se ne dozvoli da pritisak para supstance dostigne trojnu tačku, tj. stanje pri kojem su u ravnoteţi čvrsta, tečna i gasovita faza. Ako se upotrijebi vakuum onda sublimaciji mogu biti podvrgnute i supstance koje imaju trojnu tačku ispod pritiska od 760 mm Hg (Dţudţević-Čančar i Salihović, 2016). Prečišćavanje kofeina za potrebe ovog rada vršeno je vakuumskom, tzv. cold finger sublimacijom. Na dno velike svijeće je ubačen uzorak kofeina, a zatim montirana mala svijeća, u čije izvode je stavljena mješavina leda i vode za potrebe hlaďenja, dok je izvod velike svijeće povezan s vakuumom. Nakon aktiviranja vakuum pumpe dno velike svijeće se paţljivo zagrijavalo plamenikom da bi došlo do sublimacije kofeina (kofein sublimira na 178 C). Nakon što je kofein počeo sublimirati, u gasovitom stanju je došao u dodir s malom svijećom, koja se hladi i uhvatio se za njene zidove (slika 17), vraćajući se u čvrsto stanje (Dţudţević-Čančar i Salihović, 2016). Slika 17. Vakuumska sublimacija 35
Određivanje sadržaja kofeina Sadrţaj čistog kofeina je odreďivan gravimetrijski na analitičkoj vagi Mettler Toledo AX205DR/A. Prije provoďenja vakuumske sublimacije na analitičkoj vagi je izvagana aparatura za provoďenje iste. Nakon sublimacije je izvršeno hlaďenje aparature i uklanjanje zaostataka vode iz male svijeće. Pri povratku iz gasovitog u čvrsto stanje kofein se djelimično uhvatio i za zidove velike svijeće i zato nije bilo moguće odrediti masu kofeina samo razlikom u masi male svijeće prije i poslije sublimacije, dok su u velikoj svijeći bili prisutni i nekofeinski zaostaci. Stoga je masa kofeina zaostalog na maloj svijeći izračunata razlikom u masi male svijeće prije i nakon sublimacije, dok je kofein zaostao na velikoj svijeći paţljivo sastrugan i zasebno izvagan na analitičkoj vagi. Nakon toga su mase kofeina s velike i male svijeće sabrane, podijeljene s početnom masom kahve i pomnoţene sa 100 da bi se dobio sadrţaj kofeina u datoj vrsti kahve. Sadrţaji čistog kofeina iz različitih vrsta kahve su prikazani u tabeli 3. na 38. strani ovog rada. Infracrvena spektroskopija s Fourierovom transformacijom (FTIR) Fourier spektroskopija je generalni pojam kojim se opisuje analiza bilo kojeg promjenjivog signala u njegove sastavne komponente frekvencije. Matematičke metode nazvane po J. B. J. Fourieru imaju veliku moć u spektroskopiji i mogu se primijeniti za različite vrste spektroskopije uključujući i infracrvenu, što se naziva infracrvena spektroskopija s Fourierovom transformacijom (FTIR). FTIR spektroskopija uključuje apsorpciju, refleksiju, emisiju ili fotoakustički spektar, koji su dobijeni Fourierovom transformacijom optičkog interferograma. Iako se za analizu različitih uzoraka se koriste raznovrsne spektroskopske metode, FTIR spektrometri postaju sve popularniji zbog svoje brzine, preciznosti i osjetljivosti. Ova metoda omogućava jako brzu analizu mikro uzoraka, koja je u odreďenim slučajevima precizna i do nivoa nanograma, što FTIR čini neprocjenjivim oruďem za rješavanje problema u mnogim studijama. Različiti FTIR spektrometri koriste različite interferometre, od kojih je ipak najviše korišten Michelsonov interferometar, zbog svoje jednostavne konstrukcije i operabilnosti. Glavni problem za FTIR analizu je bio dobijanje interferograma, koji se u spektar morao prevesti Fourierovom transformacijom, što je zahtijevalo upotrebu kompjutera. Danas, s ogromnim napretkom kompjuterske tehnologije, je došlo do procvata FTIR metode jer ne postoji neki tehnički razlog koji bi spriječio numeričku transformaciju velikog broja podataka u kratkom 36
vremenskom periodu. Na slici broj 18 se vidi shematski prikaz Michelsonovog interferometra, koji je korišten u većini FTIR spektrometara. Slika 18. Shematski prikaz Michelsonovog interferometra Infracrveni izvor emituje svjetlost svih talasnih tuţina u infracrvenoj regiji spektra i obično je selektiran traţeni spektralni raspon. Posebno ogledalo pretvara zračenje iz izvora u paralelno i takva paralelna zraka dolazi na razlagač zračenja Michelsonovog interferometra, koji zraku razlaţe na dva dijela, od kojih jedan odlazi na pokretno ogledalo, a drugi na fiksno ogledalo. Povratne zrake se ponovo ujedine na razlagaču zraka, gdje dolazi do njihove interferencije, a zatim prolaze kroz uzorak; koji apsorbuje odreďene frekvencije, u zavisnosti od prisutnih funkcionalnih grupa u uzorku, i dolaze do detektora; koji mora biti sposoban za brzi odgovor, jer su promjene u intenzitetu veoma brze, zbog velike brzine pokretnog ogledala. U FTIR spektroskopiji se najčešće koriste piroelektrični detektori (Jaggi i Vij, 2006). Pri izradi ovog rada je korišten instrument FTIR Spectrum BX, Perkin Elmer. Uzorci kofeina su pripremljeni u vidu KBr pastila i zatim ispitani u spektrometru, a rezultirajući spektri su poreďeni sa spektrom standarda kofeina. 37
5. REZULTATI 5. 1. Rezultati ekstrakcije kofeina Ekstrakcija kofeina je vršena koristeći dvije metode, obično kuhanje i refluksiranje. Rezultati dobijeni ekstrakcijom su prikazani u tabeli 3. Tabela 3. Rezultati ekstrakcije kofeina iz kahve Vrsta kahve Masa kahve Masa neprečišćene kofeinske frakcije Procenat neprečišćene kofeinske frakcije Procenat kofeina nakon sublimacije Obično Refluks Obično Refluks Obično Refluks kuhanje kuhanje kuhanje Tucaffe 40,00 g 0,15 g 0,09 g 0,4 % 0,225 % 0,19 % 0,14 % Special 40,00 g 0,14 g 0,10 g 0,375 % 0,25 % 0,18 % 0,15 % Grand 40,00 g 0,12 g 0,06 g 0,3 % 0,15 % 0,15 % 0,1 % Prima 40,00 g 0,10 g 0,12 g 0,25 % 0,325% 0,13 % 0,19 % Brazil 40,00 g 0,11 g 0,06 g 0,225 % 0,15 % 0,14 % 0,1 % Franck 40,00 g 0,10 g 0,07 g 0,225 % 0,175 % 0,13 % 0,11 % Minas 40,00 g 0,08 g 0,06 g 0,2 % 0,15 % 0,11 % 0,11 % 5. 2. Rezultati odreċivanja taĉke topljenja Tačke topljenja su za sve uzorke neprečišćenog kofeina bile niţe od literaturne vrijednosti tačke topljenja za kofein, koja iznosi 235-238 C. Razlog tome je činjenica da supstance s prisutnim onečišćenjima uvijek imaju niţu tačku topljenja od čistih supstanci. U tabeli 4. su prikazane tačke topljenja odreďene za neprečišćene uzorke kofeina. Tabela 4. Rezultati određivanja tačke topljenja za neprečišćene i prečišćene uzorke kofeina Tačka topljenja za Tačka topljenja za Tačka topljenja nakon Vrsta kahve uzorak pripremljen refluksirani uzorak sublimacije običnim kuhanjem Obično kuhanje Refluks Tucaffe 195 C 210 C 237 C 237 C Special 188 C 209 C 235 C 236 C Grand 187 C 210 C 236 C 235 C Prima 190 C 216 C 237 C 237 C Brazil 204 C 209 C 236 C 235 C Franck 203 C 211 C 235 C 235 C Minas 197 C 207 C 237 C 236 C 38
Nakon prečišćavanja vakuumskom sublimacijom, odreďena tačka topljenja svih uzoraka je bila izmeďu 235 i 238 C, što odgovara literaturnim vrijednostima. 5. 3. Rezultati tankoslojne hromatografije (TLC) Na slici 19. su prikazani razvijeni TLC hromatogrami na koje su naneseni uzorci kofeina dobijeni ekstrakcijom običnim kuhanjem i refluksiranjem iz 6 vrsta mljevene kahve, kao i standard, s kojim su uzorci poreďeni. Posmatranje hromatograma je izvršeno pod UV lampom, na talasnoj duţini 254 nm. Uzorci kofeina su otopljeni u 96% etanolu, dok je kao mobilna faza za razvijanje hromatograma korištena mješavina acetona, hloroforma i metanola u odnosu 1:1:1. Na TLC ploču su redom naneseni standard (St), kofein iz kahve Tucaffe (T), kofein iz kahve Special (S), kofein iz kahve Grand (G), kofein iz kahve Prima (P), kofein iz kahve Brazil (B), te kofein iz kahve Franck (F). Slika 19. Mrlje kofeina na TLC ploči posmatrane pod UV lampom na talasnoj dužini 254 nm; A standard i uzorci kofeina iz 6 vrsta kahve dobijeni nakon običnog kuhanja; B standard i uzorci kofeina iz 6 vrsta kahve dobijeni nakon refluksiranja 39
U tabeli 5. su prikazane vrijednosti x i y, kao i vrijednosti retencionih faktora (Rf) za standard i uzorke kofeina sa slike 19. Tabela 5. Vrijednosti x, y i retencioni faktori za standard i uzorke kofeina iz 6 vrsta mljevene kahve Vrsta uzorka Obično kuhanje Refluksiranje X Y Rf x Y Rf Standard 5,9 cm 7,3 cm 0,808 5,9 cm 7,3 cm 0,808 Tucaffe 5,9 cm 7,3 cm 0,808 5,8 cm 7,3 cm 0,794 Special 5,9 cm 7,3 cm 0,808 5,8 cm 7,3 cm 0,794 Grand 5,9 cm 7,3 cm 0,808 5,9 cm 7,3 cm 0,808 Prima 5,9 cm 7,3 cm 0,808 5,9 cm 7,3 cm 0,808 Brazil 5,9 cm 7,3 cm 0,808 5,9 cm 7,3 cm 0,808 Franck 5,8 cm 7,3 cm 0,794 5,9 cm 7,3 cm 0,808 Na slici broj 20 je prikazan razvijeni TLC hromatogram uzoraka kofeina dobijenih iz Minas kahve u zrnu običnim kuhanjem i refluksiranjem. Na TLC ploču je nanesen i standard zbog poreďenja uzoraka kofeina, a ploča je nakon razvijanja posmatrana pod UV lampom na talasnoj duţini 254 nm. Slika 20. Mrlje kofeina na TLC ploči posmatrane pod UV lampom na talasnoj dužini 254 nm; (S) standard, (O) kofein ekstrahiran iz Minas kahve običnim kuhanjem, (R) kofein ekstrahiran iz Minas kahve refluksiranjem 40
U tabeli 6. su prikazane vrijednosti x i y, kao i vrijednosti retencionih faktora (Rf) za standard i uzorke kofeina iz Minas kahve. Tabela 6. Vrijednosti x, y i retencioni faktori za standard i uzorke kofeina iz Minas kahve u zrnu Vrsta uzorka Obično kuhanje Refluksiranje X Y Rf x y Rf Standard 5,9 cm 7,3 cm 0,808 5,9 cm 7,3 cm 0,808 Minas 5,9 cm 7,3 cm 0,808 5,9 cm 7,3 cm 0,808 Na slici 21. su prikazani razvijeni TLC hromatogrami kofeina prije i poslije vakuumske sublimacije. Na TLC ploču prikazanu na slici 21A su naneseni standard (St), uzorak kofeina dobijen refluksiranjem iz Prima kahve prije sublimacije (NP), te uzorak kofeina dobijen refluksiranjem iz Prima kahve nakon sublimacije (SP); dok su na TLC ploču prikazanu na slici 21B naneseni standard (St), uzorak kofeina dobijen običnim kuhanjem iz Special kahve prije sublimacije (NS), te uzorak kofeina dobijen običnim kuhanjem iz Special kahve nakon sublimacije (S). Slika 21. Mrlje kofeina na TLC ploči posmatrane pod UV lampom na talasnoj dužini 254 nm; A standard i uzorci kofeina dobijeni refluksiranjem iz Prima kahve prije i nakon sublimacije, B standard i uzorci kofeina dobijeni običnim kuhanjem iz Special kahve prije i nakon sublimacije 41
U tabeli 7. su prikazane vrijednosti x, y, te retencioni faktori za uzorke sa slike 21. Tabela 7. Vrijednosti x, y i retencioni faktori za standard i uzorke kofeina dobijene refluksiranjem iz Prima kahve prije i poslije sublimacije, te za uzorke kofeina dobijene običnim kuhanjem iz Special kahve prije i poslije sublimacije Vrsta uzorka Prije sublimacije Nakon sublimacije X Y Rf X y Rf Standard 5,9 cm 7,3 cm 0,808 5,9 cm 7,3 cm 0,808 Prima 5,8 cm 7,3 cm 0,794 5,9 cm 7,3 cm 0,808 Special 5,8 cm 7,3 cm 0,794 5,9 cm 7,3 cm 0,808 5. 4. Rezultati FTIR analize Na slici 22. je prikazan spektar dobijen FTIR analizom standarda kofeina, s kojim su poreďeni spektri dobijeni FTIR analizom uzoraka. Obiljeţeni su pikovi karakteristični za strukturu kofeina, na osnovu kojih se ona moţe potvrditi. Slika 22. Spektar standarda kofeina Karakteristični pikovi za odgovarajuće veze i funkcionalne grupe su sljedeći: Istezanje keto grupe na 1025 i 1250 cm -1, Istezanje C=N veze na 1550 cm -1, Aromatsko C=O istezanje, te isteţuća C=C, C=O i C=N vibracija izmeďu 1650 i 1700 cm -1, 42
Istezanje CH 3 grupe i C-H veze na 2950 cm -1 (Paradkar, 2006). Na slici 23. su prikazani spektri uzoraka podvrgnutih FTIR analizi. Iz tehničkih razloga analizi nisu mogli biti podvrgnuti svi uzorci, tako da su analizi podvrgnuta četiri uzorka kofeina dva uzorka kofeina iz Grand kahve (nakon refluksiranja i običnog kuhanja) i dva uzorka kofeina dobijena iz Minas kahve (nakon refluksiranja i običnog kuhanja). Slika 23. Spektri ekstrahiranih uzoraka kofeina Na slici 24 su prikazani spektri za kofein dobijen ekstrakcijom nakon refluksiranja i nakon običnog kuhanja Grand kahve. Slika 24. Spektri kofeina ekstrahiranog iz grand kahve dvjema metodama 43
Na slici 25. je prikazano područje spektara s prethodne slike izmeďu 700 i 1800 cm -1, u kojem se nalaze najznačajniji pikovi za karakterizaciju kofeina. Slika 25. Područje spektra između 700 i 1800 cm -1 za kofein ekstrahiran iz Grand kahve Pik na 853 cm -1 označava istezanje C-C veze. Na 1026, kao i na 1240 cm -1 su prisutni pikovi koji označavaju istezanje koje potiče od C=O i C-N veza kofeina. Pik na 1360 cm -1 označava istezanje C-N veze, dok pik na 1550 cm -1 pokazuje istezanje C=N veze. Pikovi izmeďu 1600 i 1700 cm -1 (u ovom slučaju na 1662 cm-1 i na 1700 cm-1 ) pokazuju isteţuće asimetrične vibracije C=C, C=O i C=N veza. Pikovi u području izmeďu 770 i 735 cm -1 ukazuju na postojanje orto poloţaja keto grupe. Signal u ovom području se moţe uočiti na 746 cm -1. U području izmeďu 815 i 780 cm -1 se javlja signal za meta supstituirane derivate, koji se uočava na 800 cm -1, dok se u području izmeďu 790 i 860 cm -1 javlja signal koji ukazuje na para supstituirane derivate. Pik u ovom području se kod naših uzoraka javlja na 853 cm -1. Na slici 26. je prikazano područje izmeďu 2600 i 3200 cm -1 za spektre kofeina iz Grand kahve. I u ovom području takoďe postoje karakteristični pikovi za kofein. Najvaţniji pikovi u ovom dijelu spektra su na 2850 i 2922 cm -1. Naime, oni označavaju istezanje C-H veza iz metilnih (-CH 3 ) grupa, a u kofeinu su prisutne tri metilne grupe. TakoĎe pik koji se javlja na 3114 cm -1 i sam najvjerovatnije potiče od istezanja C-H grupe. 44
Slika 26. Područje spektra između 2600 i 3200 cm -1 za kofein ekstrahiran iz Grand kahve Na slici 27 su prikazani spektri kofeina dobijenog refluksiranjem i običnim kuhanjem Minas kahve. Slika 27. Spektri kofeina ekstrahiranog iz Minas kahve dvjema metodama Na slici 28 je prikazano područje spektara s prethodne slike izmeďu 800 i 1700 cm -1. 45