Biološke karakteristike izolata Botrytis cinerea Pers. različite osetljivosti na dikarboksimide

Pestic. fitomed. (Beograd), 22 (2007) 37-54 UDC: 632.4:632.952) Pestic. Phytomed. (Belgrade), 22 (2007) 37-54 Naučni rad * Scientific Paper Biološke karakteristike izolata Botrytis cinerea Pers. različite osetljivosti na dikarboksimide Brankica Tanović Institut za pesticide i zaštitu životne sredine, Beograd, Srbija REZIME U radu su proučavane biološke karakteristike izolata B. cinerea različite osetljivosti na dikarboksimide. Utvrđeno je da se visokorezistentni izolati morfološki razlikuju od izolata normalne osetljivosti. Oni su uglavnom slabije patogeni i formiraju manji broj sklerocija od izolata normalne osetljivosti. Zabeležena je visoka negativna korelacija između osetljivosti na povećan osmotski pritisak i rezistentnosti na dikarboksimide, kao i brzine rasta izolata i rezistentnosti na dikarboksimide. Uticaj temperature, vrste i kiselosti hranljive podloge na porast micelije visoko rezistentnih izolata B. cinerea slabije je izražen u odnosu na porast osetljivih izolata. Ključne reči: Botrytis cinerea; dikarboksimidi; rezistentnost; osmoosetljivost; iprodion; vinklozolin UVOD Botrytis cinerea pripada rodu Botrytis (red Moniliales, familija Botrytidaceae) koji je prvi put opisan 729. godine i jedan je od najstarijih rodova fitopatogenih gljiva (Jarvis, 977; loc. cit. Van der Vlugt-Bergmans, 996). B. cinerea je patogen za 235 vrsta biljaka, koje se prostiru od hladnih zona Aljaske i Kanade do suptropskih oblasti. Značajno ugrožava proizvodnju voća, vinove loze, povrća, ukrasnog bilja (Van der Vlugt-Bergmans, 996). Čest je prouzrokovač bolesti biljaka gajenih u zaštićenom prostoru (Coley-Smith, 980; loc. cit. Chardonnet i sar., 2000; Giraud i sar., 999). Gljiva parazitira skoro sve delove biljke u svim fazama razvoja, kao i plodove tokom skladištenja. Simptomi se najčešće opisuju kao siva trulež, siva plesan, palež, mrka trulež, a zapaženo je i poleganje klijanaca. U završnoj fazi, oboleli biljni delovi potpuno su prekriveni sivom navlakom reproduktivnih tvorevina parazita (Verhoeff, 970; Ribereau- Gayon i sar., 980, loc. cit. Van der Vlugt-Bergmans, 996; Charabany i Shtienberg, 999). Kao pleomorfna vrsta, B. cinerea stvara konidiofore i konidije, fijalokonidiofore sa mikrokonidijama, sklerocije i apresorije. B. cinerea je opisana kao visokovarijabilna vrsta. Razlike između izolata u pogledu brzine porasta, formiranja konidija i sklerocija, produkcije enzima i patogenosti, zabeležili su Grindle (979), Di Lena i saradnici (98), Leone (990), Movahedi i Heale (990) i drugi. Za suzbijanje B. cinerea u početku su primenjivani fungicidi nespecifičnog preventivnog dejstva (dihloran, dihlofluanid, hlortalonil i tiram) koji, i pored visokih doza, nisu obezbedili odgovarajuću zaštitu od patogena sa tako visokim infekcionim potencijalom (Stehmann, 37

B. Tanović 995). Od šezdesetih godina, za suzbijanje B. cinerea se koriste benzimidazoli, od sedamdesetih dikarboksimidi, a devedesetih anilinopirimidini i fenilpiroli (Knight i sar., 997; Rosslenbroich i Stuebler, 2000). Eksperimentalno je dokazano da je umanjena efikasnost dikarboksimida posledica povećanja učestalosti rezistentnih jedinki u populaciji patogena (Lorenz i Eichhorn, 980; Murakoshi i Hosaya, 982; Wang i sar., 986; Elad i sar., 992; Steel i Nair, 993). U stranoj literaturi za ove jedinke, odnosno delove prirodnih populacija patogena koji ispoljavaju različitu osetljivost na fungicide, brojni autori koriste termin strains odnosno sojevi (Wang i sar., 986; Elad i sar., 992; Steel i Nair, 993, Latorre i sar., 2002). S obzirom da se i u radovima koji se odnose na proučavanje rezistentnosti u laboratorijskim uslovima za rezistentne jedinke najčešće ravnopravno koriste dva termina rezistentni izolati ili rezistentni sojevi (Elad i sar., 992; Gouot, 994; Lorenz, 994; Stehmann, 995; Latorre i sar., 2002), opredelili smo se da slično postupimo i u ovom radu. Kada se govori o delovima prirodnih populacija koji ispoljavaju različitu osetljivost na fungicide biće upotrebljavan termin osetljivi/rezistentni sojevi, dok će za jedinke u laboratorijskim uslovima biti ravnopravno upotrebljavan jedan od termina sojevi ili izolati. Prvi soj B. cinerea rezistentan na dikarboksimide pronađen je u vinogradu u Mosel-u 978. godine, tri godine nakon registracije prvog fungicida iz ove hemijske grupe. Godinu dana kasnije, rezistentni sojevi su prisutni u vinogradarskim regionima zapadne Nemačke, Švajcarske, Italije, Novog Zelanda i Kanade (Lorenz, 994; Raposo i sar., 2000). Rezistentni sojevi su pronađeni i u populacijama B. cinerea na jagodi, povrtarskim vrstama i biljkama gajenim u zaštićenom prostoru (LaMondia i Douglas, 997; Yourman i Jeffers, 999; Yourman i sar., 2000), kao i na vinovoj lozi u Srbiji (Rajković, 992). Ipak, trebalo bi napomenuti da Lorenz i Eichhorn (978), Sprengler i saradnici (979), kao ni Hisada i saradnici (979) nisu uspeli da izoluju rezistentne sojeve B. cinerea ni posle višegodišnje intenzivne primene dikarboksimida u polju. Svi izolati B. cinerea iz jagode, maline, vinove loze i salate poreklom sa različitih lokaliteta u Srbiji, izolovani tokom 200. i 2002. godine bili su, takođe, osetljivi i na iprodion i na vinklozolin (Tanović, 2003). Prema navodima mnogih autora nije teško dobiti laboratorijske sojeve gljiva rezistentne na dikarboksimide (Beever i Brien, 983; Grindle, 984; Littley i Rahe, 984, loc. cit. Pommer i Lorenz, 995; Tanović, 2004). Proučavanja većine autora su pokazala da sojevi gljiva, rezistentni na dikarboksimide, sporije rastu na hranljivoj podlozi nego osetljivi sojevi (Hisada i sar., 979; Davis i Dennis, 98), posebno ako se uporede laboratorijski adaptirani sojevi sa prirodno osetljivim (Lorenz i Pommer, 985, loc. cit. Pommer i Lorenz, 995). Međutim, dobijeni su i sojevi B. cinerea rezistentni na dikarboksimide, čija micelija ne zaostaje u porastu za micelijom osetljivih sojeva (Pommer i Lorenz, 995). Summers i saradnici (984) navode da rezistentni sojevi B. cinerea mogu da rastu brže na hranljivoj podlozi bez fungicida nego sojevi normalne osetljivosti. Ovakve pojave se objašnjavaju izrazitom prirodnom varijabilnošću vrste B. cinerea (Pommer i Lorenz, 995), kao i različitim eksperimentalnim uslovima (Gouot, 994). Poznato je da je osetljivost fitopatogenih gljiva na povećanje osmotskog pritiska u negativnoj korelaciji sa patogenošću (Beever, 983; loc. cit. Faretra i Pollastro, 993; Beever i Brien, 983; Leroux i Fritz, 983; loc. cit. Pommer i Lorenz, 995). Kad je reč o sojevima B. cinerea rezistentnim na dikarboksimide, rezultati su protivrečni. U najvećem broju slučajeva rezistentni sojevi su osetljiviji na povećan osmotski pritisak, pa samim tim i slabije patogeni od sojeva normalno osetljivih na dikarboksimide (Beever i Brien, 983). Međutim, Pommer i Lorenz (995) smatraju da rezistentnost na dikarboksimide i osetljivost na povećan osmotski pritisak nisu uvek u korelaciji. Imajući u vidu raznolike literaturne podatke koji se odnose na karakteristike rezistentnih sojeva B. cinerea, kao i izraženu visoku varijabilnost ove fitopatogene vrste, cilj ovog rada bilo je uporedno proučavanje bioloških odlika izolata B. cinerea različite osetljivosti na dikarboksimide. MATERIJAL I METODE Test supstance Iprodion [3-(3,5-dichlorophenyl)-N-isopropyl-2,4- dioxoimidazolidine--carboxamide], preparat Kidan EC, proizvod kompanije Aventis. Vinklozolin [(RS) - 3 - (3,5 - dichlorophenyl - 5-methyl- 5-vinyl-,3-oxazolidine -2,4-dione], preparat Ronilan WG, proizvod kompanije BASF. Benomil [Methyl -(butylcarbamoyl)benzimidazol- 2-ylcarbamate], preparat Benfungin WP, proizvod kompanije Galenika-Fitofarmacija. Prohloraz [N-propyl-N-[2-(2,4,6-trichlorophenoxy) ethyl]imidazole--carboxamide], preparat Octave WP, proizvod kompanije Aventis CropScience. 38

Pestic. fitomed. (Beograd), 22 (2007) 37-54 i B. cinerea i iz prirodnih populacija Patogen je izolovan iz obolelih delova jagode, maline, vinove loze i salate, prethodno inkubiranih u vlažnoj komori na sobnoj temperaturi kako bi se izazvala sporulacija (Locher i Lorenz, 99). Podaci o lokalitetima, vremenu izolacije i broju izolata prikazani su u Тabeli. Dobijeni izolati su prečišćeni do monosporijalnih kultura i, nakon provere patogenosti, čuvani na zakošenoj KDA podlozi u frižideru na temperaturi od 4 o C (Dhingra i Sinclair, 995). Postupak dobijanja monosporijalnih izolata i provere patogenosti detaljno je opisan u jednom od prethodnih radova (Tanović, 2003). Laboratorijski rezistentni izolati Laboratorijski rezistentni izolati B. cinerea dobijeni su delimično modifikovanom Crossed-Paper metodom koju su De Waard i Nistelrooy (982) uveli u primenu za testiranje toksičnosti fungicida u prisustvu drugih supstanci, a koja je opisana u radu Tanović (2004). Podaci o ovim izolatima prikazani su u Тabeli 2. Provera osetljivosti laboratorijskih izolata B. cinerea na fungicide Radi provere osetljivosti praćen je porast micelije laboratorijski dobijenih izolata na podlogama u koje su dodati fungicidi u sledećim koncentracijama: Iprodion ili vinklozolin (dikarboksimidi) 0 mg/l (Locher i Lorenz, 99); Benomil (benzimidazoli) 5 mg/l (Stehmann, 995); Prohloraz (imidazoli) 0 mg/l; arbitrarno određena koncentracija na osnovu rezultata ogleda Pappas-a i Fisher-a (979) i Leroux-a i Gredt-a (984). Porast na podlozi koja sadrži fungicid poređen je sa kontrolom (podloga bez fungicida). Kao dopunska kontrola, korišćeni su i odgovarajući osetljivi izolati. Ogled je izveden u četiri ponavljanja, a izolati su smatrani rezistentnim ako posle inkubacije od 48 h rastu na podlozi sa diskriminativnom koncentracijom fungicida (Faretra i Pollastro, 99). Patogenost rezistentnih izolata B. cinerea Patogenost dobijenih rezistentnih izolata ispitana je na kriškama jabuke. Plodovi jabuke su oprani u blagom rastvoru deterdženta, isprani destilovanom vodom i osušeni papirnom vatom. Sterilnim skalperom su isečene kriške i na njih nanet fragment KDA pod- Tabela. Poreklo izolata B. cinerea iz prirodnih populacija Table. Origine of isolates of B. cinerea from natural population Domaćin Host Lokalitet Datum izolacije Oznaka izolata Broj izolata Locality Isolation date Code of isolates No. of isolates Jagoda Strawberry Preljina 28. maj 200. J 5; J 20; J 32 Surčin 8. jun 200. J 3 4 Malina Raspberry Uzići 8. jul 200. M 47; M 49; M 50 3 Vinova loza Vine Niš. oktobar 200. V 66; V 68; V 7; V 75 4 Salata Lettuce Zvezd 3. april 2002. S 02; S 08; S 25 4 Tabela 2. Poreklo rezistentnih izolata B. cinerea Table 2. Origin of resistant isolates of B. cinerea Domaćin Host iz prirodne populacije from natural population Odgovarajući rezistentan izolat Corresponding resistant isolate Jagoda Strawberry J 3 J 3f Jagoda Strawberry J 5 J 5f Malina Raspberry M 47 M 47f Malina Raspberry M 49 M 49f Salata Lettuce S 25 S 25f 39

B. Tanović loge, prečnika cm, sa micelijom čiste kulture ispitivanog izolata. Na plod u kontroli nanet je fragment sterilne KDA podloge. Inokulisane kriške su postavljene na vlažan filter-papir u petri-kutije i inkubirane na temperaturi od 20 o C. Nakon tri dana inkubacije, meren je prečnik površine natrulog tkiva oko mesta inokulacije rezistentnim i osetljivim izolatom. Ogled je izveden u tri ponavljanja sa po dve kriške po ponavljanju. Analizom varijanse i LSD testom utvrđena je statistička značajnost razlike aritmetičkih sredina prečnika natrulog tkiva. Reizolacijom je potvrđeno da su simptomi posledica patogene aktivnosti proučavanih izolata. Morfološke odlike izolata B. cinerea Nakon inkubacije od 0 dana na KDA podlozi na temperaturi od 20 o C, posmatran je izgled kolonije, odlike ruba kolonije, boja, prisustvo sklerocija i konidija, i pigmentacija podloge. Pravljeni su privremeni mikroskopski preparati od micelije stare deset dana i posmatran izgled hifa, oblik i veličina konidija, kao i prisustvo i izgled sklerocija i drugih tvorevina parazita (Muntanjola-Cvetković, 987). Odgajivačke odlike izolata B. cinerea Od odgajivačkih odlika proučen je uticaj različitih hranljivih podloga i uticaj kiselosti KDA podloge na porast izolata. Isečci podloge prečnika 0 mm sa micelijom parazita, uzeti sa ivice kolonije gljive gajene na KDA podlozi tokom četiri dana, nanošeni su na različite hranljive podloge i inkubirani tri dana na temperaturi od 20 o C. Prečnik kolonije je meren u dva pravca pod pravim uglom. Ogled je izveden u četiri ponavljanja a podaci su obrađeni analizom varijanse. Značajnost razlika u prosečnom porastu testirana je LSD testom. Uticaj hranljive podloge na porast izolata B. cinerea Porast micelije ispitivanog izolata praćen je na sledećim podlogama: krompir-dekstroznom agaru (KDA), malt agaru, Čapekovoj podlozi (Muntanjola- Cvetković, 987), vodenom agaru i podlozi od zrna pšenice (Dhingra i Sinclair, 995). Uticaj kiselosti podloge na porast izolata B. cinerea Uticaj kiselosti KDA podloge na porast micelije je praćen u intervalu od 5 do 9 ph jedinica na temperaturi od 20 o C (Dhingra i Sinclair, 995). Ekološke odlike izolata B. cinerea Uticaj temperature na porast izolata B. cinerea i B. cinerea su gajeni na KDA podlozi na temperaturama od: 0, 5, 20, 25 i 30 o C. Prečnik micelije je meren posle tri dana od zasejavanja. Ogled je izveden u četiri ponavljanja a podaci obrađeni analizom varijanse (Dhingra i Sinclair, 995). Uticaj svetlosti na porast izolata B. cinerea Uticaj svetlosti na porast izolata B. cinerea proučen je gajenjem gljive u prisustvu stalnog neonskog svetla i u mraku na KDA podlozi na sobnoj temperaturi. Prečnik kolonije je meren nakon tri dana od zasejavanja. Osetljivost izolata B. cinerea na povećan osmotski pritisak Osetljivost izolata B. cinerea na povećan osmotski pritisak proučena je po metodi Beever i Brien (983). U otopljenu KDA podlogu je dodavan rastvor NaCl do finalne koncentracije od 0.68 mol/dm 3 NaCl, a u kontrolu sterilna destilovana voda. Podloga je zasejana isečcima micelije izolata prečnika 0 mm. Prečnik micelije izmeren je posle tri dana inkubacije na temperaturi od 20 o C i izračunat procenat inhibicije porasta micelije u odnosu na kontrolu. Ogled je izveden u četiri ponavljanja. Provera rezistentnosti laboratorijskih izolata B. cinerea na dikarboksimide in vivo Kriterijum za rezistentnost bila je mogućnost izolata da ostvare infekciju u prisustvu 0 mg/l iprodiona. Za ova ispitivanja korišćeni su nepovređeni primarni listovi suncokreta, sa biljaka starih 0 dana, gajenih u uslovima dugog dana (6 časova veštačkog osvetljenja dnevno, t = 25-27 o C). Odsečeni listovi su, licem okrenutim na dole, postavljeni na filter-papir u petri-kutije. Filter-papir je natopljen emulzijom iprodiona (5 ml) koncentracije 0 mg/l. Na listove je zatim postavljen isečak filter-pa- 40

Pestic. fitomed. (Beograd), 22 (2007) 37-54 pira, prečnika 5 mm (prethodno potopljen u emulziju fungicida koncentracije 0 mg/l) preko koga je nanesen fragment KDA podloge sa micelijom ispitivanih izolata. Ovim postupkom je obezbeđeno stalno prisustvo fungicida na mestu kontakta micelije i lista suncokreta. Ogled je izveden u tri ponavljanja sa po tri do četiri lista po ponavljanju uz uključene dve kontrole; u prvoj je umesto fungicida bila sterilisana destilovana voda a u drugoj je, umesto ispitivanim, potencijalno rezistentnim izolatom, inokulacija vršena osetljivim izolatom. Posle inkubacije od tri dana posmatrana je pojava truleži tkiva listova suncokreta ispod filter-papira. REZULTATI Osetljivost rezistentnih izolata B. cinerea na fungicide Svi rezistentni (f) izolati su se razvijali na KDA podlozi koja sadrži 0 mg/l iprodiona ili vinklozolina, dok su benomil i prohloraz u podlozi potpuno inhibirali rast ovih izolata (Tabela 3). Patogenost rezistentnih izolata B. cinerea Svi dobijeni rezistentni izolati su se razvijali na kriškama inokulisanih plodova jabuke, prouzrokujući trulež tkiva svetlo smeđe boje, karakterističnu za B. cinerea. Od mesta inokulacije trulež se širila zahvatajući kako mezokarp tako i pokožicu ploda (Slika ). Analiza varijanse i LSD test su pokazali da je patogenost rezistentnih izolata statistički značajno slabije izražena u odnosu na patogenost odgovarajućih osetljivih izolata (F = 32.2*; LSD 0,05;50 = 3.4). Izuzetak je izolat M 49f koji se po patogenosti ne razlikuje od odgovarajućeg izolata M 49 na nivou p = 0.05 (Slike 2 i 3). Morfološke odlike izolata B. cinerea Svi izolati B. cinerea iz prirodnih populacija formiraju belu, uniformnu, rastresitu, vazdušnu miceliju ravnog oboda koja na temperaturi od 20 o C pokriva KDA podlogu u petri-kutiji (9 cm) za najviše četiri dana. Posle šestog dana razvoja primećuju se zrakasto raspoređene zone supstratne micelije koje se smenjuju sa delimično vaz- Tabela 3. Osetljivost rezistentnih (f ) izolata B. cinerea i izolata od kojih su dobijeni na različite fungicide u KDA podlozi Table 3. Sensitivity of resistant isolates of B. cinerea and original isolates sensitive to different fungicides incorporated in PDA medium Iprodion Iprodione (0 mg/l) Vinklozolin Vinclozolin (0 mg/l) Porast izolata Mycelial growth (mm) Benomil Benomyl (5 mg/l) Prohloraz Prochloraz (0 mg/l) Kontrola Control (H 2 O) J 3 - - - - +++ J 3f ++ ++ - - ++ J 5 - - - - +++ J 5f ++ ++ - - ++ M 47 - - - - +++ M 47f ++ ++ - - + M 49 - - - - +++ M 49f + + - - ++ S 25 - - - - +++ S 25f + + - - ++ J = Jagoda; M = Malina; S = Salata; f = Laboratorijski dobijeni rezistentni izolati +++ = Prečnik porasta >5 mm ++ = Prečnik porasta 0-5 mm + = Prečnik porasta < 0 mm - = Nema porasta J = Strawberry; M = Raspberry; S = Lattuce; f = Resistant isolate obtained in the laboratory +++ = Diameter of the mycelial growth > 5 mm ++ = Diameter of the mycelial growth 0-5 mm s + = Diameter of the mycelial growth < 0 mm - = Mycelial growth not observed 4

B. Tanović Slika. Patogenost rezistentnog izolata J 3f B. cinerea u poređenju sa izolatom J 3 od koga je dobijen Figure. Patogenicity of resistant isolates J 3f of B. cinerea compared to original sensitive isolate J 3 dušnom kompaktnom micelijom. Nakon sedam dana se formiraju konidije, a sklerocije su potpuno formirane desetog dana (Slika 4). Lučenje pigmenata u podlogu nije zabeleženo. Na osnovu morfoloških osobina nije bilo moguće podeliti izolate u jasno definisane grupe. Micelija laboratorijski dobijenih izolata B. cinerea, rezistentnih na dikarboksimide, je bela, uniformna i supstratna, ravnog oboda. Petri-kutiju ispunjava za najviše sedam dana na temperaturi od 20 o C. Posle 0-2 dana razvoja na podlozi koja sadrži iprodion, rezistentni izolati počinju da luče smeđi pigment u podlogu. Ovaj pigment se pojavljuje i tokom nekoliko presejavanja na Slika 3. Patogenost rezistentnog izolata M 49f of B. cinerea u poređenju sa izolatom M 49 od koga je dobijen Figure 3. Patogenicity of resistant isolates M 49f of B. cinerea compared to original sensitive isolate M 49 podlogu bez fungicida; posle petog presejavanja ovu osobinu zadržava samo izolat M 47f (Slika 5). Ostali izolati presejavanjem na podlogu bez fungicida postaju morfološki slični izolatima B. cinerea od kojih su dobijeni. Hife su septirane, hijalinske i razgranate, sa često prisutnim anastomozama. Konidiofore su duge, smeđe, pri vrhu razgranate (karakteristično grananje tipa botrytis ) (Slika 6). Konidije su sivo smeđe, elipsoidne, hidrofobne, prosečne veličine 9.0 μm (8.5-0.03 μm) x 7.43 μm (6.46-8.42 μm). i B. cinerea počinju da sporulišu od sedmog dana na KDA podlozi i temperaturi od 20 o C, pri čemu 40 35 Prečnik zahvaćene površine Diameter of diseased area (mm) 30 25 20 5 0 5 0 J 3 J 5 M 47 M49 S 25 i - s Rezistentni izolati - Resistant isolates Osetljivi izolati - Sensitive isolates Slika 2. Patogenost laboratorijskih rezistentnih izolata B. cinerea u poređenju sa osetljivim izolatima od kojih su dobijeni; J = Jagoda; M = Malina; S = Salata Figure 2. Patogenicity of resistant isolates of B. cinerea obtained in the laboratory compared to original sensitive isolates; J = Strawberry; M = Raspberry; S = Lettuce Slika 4. B. cinerea poreklom iz prirodne populacije posle deset dana razvoja na KDA podlozi Figure 4. B. cinerea isolate originating from natural population after 0-day incubation on PDA medium 42

Pestic. fitomed. (Beograd), 22 (2007) 37-54 Slika 5. Laboratorijski rezistentni izolati B. cinerea posle sedam presejavanja na KDA podlogu bez fungicida Figure 5. Resistant isolates of B. cinerea after seven successive transfers on fungicide-free PDA medium je intenzitet sporulacije veoma slab. Samo izolat S 25 obilno sporuliše pri čemu konidiofore i konidije prekrivaju celu površinu kolonije. Crne sklerocije nepravilnog oblika prisutne su kod svih izolata B. cinerea posle inkubacije od deset dana na 20 o C, osim kod izolata S 25. Gornja površina sklerocije (plektenhim) je konveksna a donja konkavna (Slika 7). Pseudoparenhim je beo, izgrađen od labavo isprepletanih tankih hifa, uronjenih u želatinoznu hijalinsku masu. Sklerocije osetljivih i rezistentnih izolata se ne razlikuju ni po obliku ni po strukturi. Fijalokonidiofore i fijalokonidije u nizovima prisutne su u kulturama svih proučavanih izolata. U kulturama re zi stentnih izolata primećene su i velike grupe fijalokonidija u zaštitnom omotaču i spermadohije u praznim ćelijama hifa. Savršen stadijum gljive (Botriotinia fuckeliana) u ovom radu nije dobijen. Slika 7. Presek sklerocije izolata M 47f B. cinerea (uvećanje 3 x) Figure 7. Section of sclerotium of the isolate M 47f B. cinerea (x 3) Odgajivačke odlike izolata B. cinerea Uticaj hranljive podloge na porast micelije izolata B. cinerea Osetljivi izolati su prosečno najbolje rasli na malt i KDA podlozi (76. mm i 7. mm), a najslabije na vodenom agaru (26.2 mm). Rezultati testa najmanje značajne razlike (LSD test) pokazuju da, na nivou verovatnoće 0.05, nema statistički značajne razlike u porastu izolata na KDA i malt podlozi, kao i da Čapekova podloga i podloga od zrna pšenice jednako utiču na porast micelije. Porast osetljivih izolata na vodenom agaru se statistički značajno razlikuje od porasta na ostalim podlogama (Tabela 4). Najbolji prosečan porast visokorezistentnih izolata zabeležen je na KDA podlozi (52. mm), a najslabiji na vodenom agaru (23.9 mm). Na nivou verovatnoće 0.05 nema statistički značajne razlike u porastu na KDA, malt podlozi, podlozi od zrna pšenice i Čapek podlozi. Porast na vodenom agaru se ne razlikuje značajno od porasta na Čapek podlozi (Tabela 5). Uticaj kiselosti podloge na porast micelije izolata B. cinerea Slika 6. Konidiofore i konidije B. cinerea na KDA podlozi (uvećanje 3 x) Figure 6. Conidiophores and conidia of B. cinerea on PDA medium (x 3) Kiselost KDA podloge statistički značajno utiče na porast i osetljivih i rezistentnih izolata (Tabele 6 i 7). Osetljivi izolati imaju najbolji prosečan porast pri ph 5 (60.2 mm), pri čemu LSD test pokazuje da nema statistički značajne razlike u porastu izolata pri ph 5, ph 6 i ph 7 na nivou verovatnoće 0.05. Zabeležen je i statistički značajno slabiji porast osetljivih izolata pri ph 9 (45.6 mm prosečno) (Tabela 6). 43

B. Tanović Tabela 4. Uticaj različitih hranljivih podloga na porast micelije izolata B. cinerea osetljivih na dikarboksimide Table 4. Influence of different media on the growth rate of B. cinerea isolates that are sensitive to dicarboximides Prosečan prečnik micelije Diameter of mycelial growth (mm) Čapek agar Vodeni agar Agar od pšenice KDA Malt agars Czapek agar Water agar Wheat agar PDA J 3 56.8 27.4 79.0 60.2 70.4 J 5 46.8 27.2 72.4 68.6 88.0 J 20 7.2 3.8 86.0 68.6 88.0 J 32 56.0 26.8 73.2 60.2 76.8 M 47 69.0 27.2 84.4 59.4 80.4 M 49 55.0 35.4 65.8 50.8 68.0 M 50 44.8 9.6 68.2 44.3 56.0 V 66 57.2 25.0 75.0 57.8 73.0 V 68 47.2 26.0 69.2 59.2 72.4 V 7 75.8 2.2 73.8 6.0 78.2 V 75 44.8 25.2 84.2 56.2 57.8 S 02 55.2 20.4 73.3 57.4 60.4 S 08 44.8 24.8 80.4 56.2 75.2 S 25 66.0 29.0 80.2 58.4 7.2 Ms ± Sd 56.5 ± 0.5 b* 26.2 ± 4.2 c 76. ± 6.4 a 57.2 ± 5.7 b 7. ± 8.8 a J = Jagoda; M = Malina; V = Vinova loza; S = Salata Prečnik kolonije nakon inkubacije od tri dana *Ista slova označavaju da nema statistički značajne razlike na nivou p = 0.05 Ms ± Sd = Srednja vrednost i standardna devijacija (F = 94.49*; LSD 0,05; 65 = 8.96) J = Strawberry; M = Raspberry; V= Vine; S = Lattuce Diameter of the mycelial growth after three-day incubation *Mean values followed by the same letters are not significantly different (p = 0.05) Ms ± Sd = Mean Value ± Standard Deviation Tabela 5. Uticaj različitih hranljivih podloga na porast micelije izolata B. cinerea visokorezistentnih na dikarboksimide Table 5. Influence of different media on the growth rate of B. cinerea isolates highly resistant to dicarboximides Prosečan prečnik micelije Diameter of mycelial growth (mm) Čapek agar Vodeni agar Agar od pšenice KDA Malt agar Czapek agar Water agar Wheat agar PDA J 3f 35.8 33.0 35.4 45.2 48.2 J 5f 46.2 2.2 66.4 48.8 55.0 M 47f 33.4 20.5 3.2 40.4 39.4 M 49f 47.4 3.0 66.2 59.4 74.2 S 25f 36.2 4.0 28.2 35.4 43.8 Ms ± Sd 39.8 ± 6.5 ab* 23.9 ± 7.9 b 45.5 ± 9.2 a 45.8 ± 9. a 52. ± 9.8 a J = Jagoda; M = Malina; S = Salata; f = Laboratorijski dobijeni rezistentni izolati Prečnik kolonije nakon inkubacije od tri dana *Ista slova označavaju da nema statistički značajne razlike na nivou p = 0.05 Ms ± Sd = Srednja vrednost i standardna devijacija (F = 3,87*; LSD 0,05; 20 6.04) J = Strawberry; M = Raspberry; S = Lettuce; f = Resistant isolate obtained in the laboratory Diameter of the mycelial growth after three-day incubation *Mean values followed by the same letters are not significantly different (p = 0.05) Ms ± Sd = Mean Value ± Standard Deviation 44

Pestic. fitomed. (Beograd), 22 (2007) 37-54 Nema statistički značajne razlike u prosečnom porastu visokorezistentnih izolata na podlogama ph 5, ph 6 i ph 7. Najslabiji porast je bio na podlozi ph 9 (37.8 mm). Međutim, prema LSD testu, on se statistički značajno ne razlikuje od porasta na podlogama ph 7 i ph 8 (Tabela 7). Ekološke odlike izolata B. cinerea Uticaj temperature na porast micelije izolata B. cinerea Analiza varijanse je pokazala da temperatura statistički značajno utiče na porast kako osetljivih tako i rezistentnih izolata. Utvrđeno je da osetljivi izolati prosečno najbolje rastu na temperaturi od 20 o C (7. mm) a najslabije na temperaturi od 0 o C (25.3 mm). Ove vrednosti se statistički značajno razlikuju od rezultata dobijenih za porast micelije na ostalim ispitivanim temperaturama. Porast micelije osetljivih izolata se ne razlikuje značajno na temperaturama 5 i 25 o C (Tabela 8). Nije registrovana statistički značajna razlika u prosečnom porastu rezistentnih izolata B. cinerea na temperaturama od 20 o C i 5 o C (52.2 mm i 46.5 mm). Statistički značajno slabiji prosečan porast rezistentnih izolata zabeležen je na temperaturi od 0 o C (Tabela 9). Uticaj osvetljenja na porast micelije izolata B. cinerea Nakon inkubacije od tri dana osetljivi izolati prosečno rastu 70.4 mm na svetlu a 68.0 mm u mraku, dok su odgovarajuće vrednosti za rezistentne izolate 50.7 mm i 46.0 mm. Analiza varijanse je pokazala da uslovi osvetljenja ne utiču na porast ispitivanih izolata na nivou verovatnoće 0.05 (Tabele 0 i ). Tabela 6. Uticaj kiselosti podloge na porast izolata B. cinerea osetljivih na dikarboksimide Table 6. Influence of ph value of PDA medium on the growth rate of B. cinerea isolates that are sensitive to dicarboximides Prosečan prečnik micelije Diameter of mycelial growth (mm) ph 5 ph 6 ph 7 ph 8 ph 9 J 3 60.8 64.4 6.8 5.8 44.2 J 5 6.4 54.0 47.8 43.8 39.4 J 20 67.6 65.8 64.2 64.0 52.8 J 32 58.2 55.0 60.0 54.2 49.8 M 47 69.4 67.4 8.6 57.2 48.2 M 49 58.6 59.8 44.2 47.8 3.4 M 50 4.8 40.2 4.8 38.6 36.2 V 66 5.8 50.4 52.4 52.4 4.2 V 68 6.0 64.2 56.8 59.8 52.4 V 7 65.8 62.4 66.4 57.0 54.2 V 75 53.8 57.4 55.0 5.8 46.8 S 02 64.2 5.2 52.0 50.2 40.2 S 08 65.8 64.0 60.8 63.8 52.8 S 25 63.0 55.4 58.8 5.0 49.4 Ms ± Sd 60.2 ± 7.2 a* 58.0 ± 7.5 ab 57.4 ± 0.ab 53. ± 7. b 45.6 ± 7.0 c J = Jagoda; M = Malina; V = Vinova loza; S = Salata Prečnik kolonije nakon inkubacije od tri dana *Ista slova označavaju da nema statistički značajne razlike na nivou p = 0.05 Ms ± Sd = srednja vrednost i standardna devijacija (F = 7,47*; LSD 0,05;65 = 5.96) J = Strawberry; M = Raspberry; V = Vine; S = Lettuce Diameter of the mycelial growth after three-day incubation *Mean values followed by the same letters are not significantly different (p = 0.05) Ms ± Sd = Mean Value ± Standard Deviation 45

B. Tanović Tabela 7. Uticaj kiselosti podloge na porast izolata B. cinerea visokorezistentnih na dikarboksimide Table 7. Influence of ph value of PDA medium on the growth rate of B. cinerea isolates highly resistant to dicarboximides Prosečan prečnik micelije Diameter of mycelial growth (mm) ph 5 ph 6 ph 7 ph 8 ph 9 J 3f 48.4 47.0 44.2 47.0 45.2 J 5f 48.8 48.2 4.2 42.0 33.6 M 47f 46.2 46.2 47.2 29.4 40.4 M 49f 58.2 46.4 45.4 46.2 34.4 S 25f 44.8 36.0 4.2 36.8 35.4 Ms ± Sd 49.3 ± 5.2 a* 44.8 ± 4.9 a 43.8 ± 2.6 ab 40.3 ± 7.3 b 37.8 ± 4.9 b J = Jagoda; M = Malina; S = Salata; f = Laboratorijski dobijeni rezistentni izolati Prečnik kolonije nakon inkubacije od tri dana. *Ista slova označavaju da nema statistički značajne razlike na nivou p = 0.05 Ms ± Sd = Srednja vrednost i standardna devijacija (F = 3.53*; LSD 0,05;20 = 6.90) J = Strawberry; M = Raspberry; S = Lettuce; f = Resistant isolate obtained in the laboratory Diameter of the mycelial growth after three-day incubation *Mean values followed by the same letters are not significantly different (p = 0.05) Ms ± Sd = Mean Value ± Standard Deviation Tabela 8. Uticaj temperature na porast micelije izolata B. cinerea osetljivih na dikarboksimide Table 8. Influence of temperature on the growth rate of B. cinerea isolates that are sensitive to dicarboximides Prosečan prečnik micelije Diameter of mycelial growth (mm) 0 o C 5 o C 20 o C 25 o C 30 0 C J 3 23.0 67.8 70.4 62.4 37.6 J 5 23.6 68.8 67.6 68.2 38.2 J 32 29.2 65.6 76.8 52.2 27.6 J 20 33.2 67.8 88.0 46.2 9.2 M 47 23.0 6.2 80.4 75.2 35.2 M 49 2.6 53.2 68.0 65.0 27.0 M 50 27.0 66.4 56.0 48.2 25.8 V 66 23.2 58.2 73.0 69.6 30.4 V 68 22.8 64.2 72.4 58.0 28.2 V 7 27.2 66.0 78.2 75.6 33.2 V 75 6.0 54.2 57.8 75.8 27.8 S 02 32.0 64.4 60.4 65.2 39.4 S08 30.8 64.8 75.2 72.2 40.2 S 25 2.0 64.2 7.2 60.4 3.6 Ms ± Sd 25.3 ± 4.8 d* 63.3 ± 4.9 b 7. ± 8.8 a 63.9 ± 9.9 b 3.5 ± 6.0 c J = Jagoda; M = Malina; V = Vinova loza; S = Salata Prečnik kolonije nakon inkubacije od tri dana *Ista slova označavaju da nema statistički značajne razlike na nivou p = 0.05 Ms ± Sd = Srednja vrednost i standardna devijacija (F = 8.34; LSD 0,05; 65 = 5.46) J = Strawberry; M = Raspberry; V = Vine; S = Lettuce Diameter of the mycelial growth after three-day incubation *Mean values followed by the same letters are not significantly different (p = 0.05) Ms ± Sd = Mean Value ± Standard Deviation 46

Pestic. fitomed. (Beograd), 22 (2007) 37-54 Tabela 9. Uticaj temperature na porast micelije izolata B. cinerea visokorezistentnih na dikarboksimide Table 9. Influence of temperature on the growth rate of B. cinerea isolates highly resistant to dicarboximides Prosečan prečnik micelije Diameter of mycelial growth (mm) 0 o C 5 o C 20 o C 25 o C 30 o C J 3f 9.6 37.0 48.2 4.0 26.4 J 5f 25.2 63.0 55.0 59.4 38.6 M 47f 9.6 38.4 39.6 40.4 25.0 M 49f 20.4 54.0 74.2 45.0 28.0 S 25f 9.8 40.0 43.8 39.8 23.8 Ms ± Sd 20.9 ± 2.4 d* 46.5 ±.5ab 52.2 ± 3.5 a 38.4 ± 8.2 bc 28.4 ± 5.9 cd J = Jagoda; M = Malina; S = Salata; f = Laboratorijski dobijeni rezistentni izolati Prečnik kolonije nakon inkubacije od tri dana *Ista slova označavaju da nema statistički značajne razlike na nivou p = 0.05 Ms ± Sd = Srednja vrednost i standardna devijacija (F = 0.38; LSD 0s,05;20 = 2.6) J = Strawberry; M = Raspberry; S = Lattuce; f = Resistant isolate obtained in the laboratory Diameter of the mycelial growth after three-day incubation *Mean values followed by the same letters are not significantly different (p = 0.05) Ms ± Sd = Mean Value ± Standard Deviation Tabela 0. Uticaj uslova osvetljenja na porast micelije izolata B. cinerea osetljivih na dikarboksimide Table 0. Influence of light on the growth rate of B. cinerea isolates that are sensitive to dicarboximides Prosečan prečnik micelije Diameter of mycelial growth (mm) Svetlo Light Tama Darkness J 3 80.0 79.8 J 5 78.0 78.8 J 20 70.2 64.8 J 32 56.0 47.8 M 47 7.8 74.0 M 49 40.0 48.2 M 50 62.0 52.5 V 66 7.8 64.0 V 68 73.8 69.5 V 7 8.8 77.5 V 75 76.0 74.8 S 02 79.4 78.5 S 08 78.5 78.8 S 25 66.2 63.2 Ms ± Sd 70.4 ±.4 a* 68.0 ±.6 a J = Jagoda; M = Malina; V = Vinova loza; S = Salata Prečnik kolonije nakon inkubacije od tri dana *Ista slova označavaju da nema statistički značajne razlike na nivou p = 0.05 Ms ± Sd = Srednja vrednost i standardna devijacija (F = 0.30) J = Strawberry; M = Raspberry; V = Vine; S = Lettuce Diameter of the mycelial growth after three-day incubation *Mean values followed by the same letters are not significantly different (p = 0.05) Ms ± Sd = Mean Value ± Standard Deviation 47

B. Tanović Tabela. Uticaj uslova osvetljenja na porast micelije izolata B. cinerea visokorezistentnih na dikarboksimide Table. Influence of light on the growth rate of B. cinerea isolates highly resistant to dicarboximides Prosečan prečnik micelije Diameter of mycelial growth (mm) Svetlo Light Tama Darkness J 3f 39.0 37.5 J 5f 73.0 68.0 M 47f 3.0 3.0 M 49f 69.0 57.2 S 25f 4.5 38.2 Ms ± Sd 50.7 ± 9.0 a* 46.4 ± 5.5 a J = Jagoda; M = Malina; S = Salata; f = Laboratorijski dobijeni rezistentni izolati Prečnik kolonije nakon inkubacije od tri dana *Ista slova označavaju da nema statistički značajne razlike na nivou p = 0.05 Ms ± Sd = Srednja vrednost i standardna devijacija (F = 0.5) J = Strawberry; M = Raspberry; V = Vine; S = Lettuce; f = Resistant isolate obtained in the laboratory Diameter of the mycelial growth after three-day incubation *Mean values followed by the same letters are not significantly different (p = 0.05) Ms ± Sd = Mean Value ± Standard Deviation Rast izolata B. cinerea, broj formiranih sklerocija i osetljivost na dikarboksimide Od osetljivih izolata prosečno najbrže raste izolat J 20 (29.3 mm/dan) a najsporije izolat M 50 (8.7 mm/dan); od rezistentnih izolata najbrži porast micelije ima izolat M 49f (24.7 mm/dan) a najsporije raste izolat M 47f (3. mm/dan) (Tabela 6). Osetljivi izolati prosečno brže rastu od rezistentnih. Izuzetak je rezistentan izolat M 49f koji se u porastu ne razlikuje od osetljivog izolata S 08. Nema razlike ni u porastu osetljivih izolata V 75 i M 50 i rezistentnog izolata J 5f (Tabela 2). Prosečno najviše sklerocija formira izolat V 68 (86.0) a najmanje izolat S 25 (0). Broj sklerocija koje su formirali f izolati se kretao od 4.0 (izolat M 47f) do 24.7 (izolat M 49f). Razlike između izolata, kako u brzini rasta tako i u broju formiranih sklerocija bile su statistički značajne na nivou verovatnoće 0.05 (Tabela 2). Nije utvrđena statistički značajna korelacija između brzine rasta izolata B. cinerea i broja formiranih sklerocija (r = 0.43; t =.96). Korelacija između broja sklerocija i osetljivosti na iprodion i vinklozolin je, takođe, bila veoma slaba odgovarajući koeficijenti korelacije r ip. = - 0.36 (t =.59) i r vk. = - 0.3 (t =.34) nisu bili statistički značajni. Četiri od pet proučavanih rezistentnih izolata B. cinerea formira statistički značajno manji broj sklerocija nego osetljivi izolati (Tabela 2). Rezistentni izolat S 25f formira više sklerocija od odgovarajućeg osetljivog izolata S 25. Sa promenom osetljivosti na dikarboksimide izolat S 25 izgubio je sposobnost obilne sporulacije tako da dobijeni izolat S 25f sporuliše slabo, kao i ostali izolati proučavani u ovom radu. Koeficijent korelacije između brzine rasta izolata i EC 50 vrednosti za iprodion je bio r = - 0.70** (t = 4.04), a za vinklozolin r = - 0.74** (t = 4.27). Oba koeficijenta su statistički vrlo značajna (nivo verovatnoće 0.0). To znači da postoji visoka negativna korelacija između brzine rasta izolata i rezistentnosti na dikarboksimide. Osetljivost izolata B. cinerea na povećan osmotski pritisak i rezistentnost na dikarboksimide Koeficijenti korelacije između osetljivosti izolata B. cinerea na povećan osmotski pritisak i rezistentnosti na iprodion i vinklozolin su iznosili r = - 0.90** (t = 8.5) i r = - 0.73** (t = 4.40). Prema tome, postoji visoka negativna korelacija između osetljivosti na povećan osmotski pritisak i rezistentnosti na dikarboksimide. Provera rezistentnosti laboratorijskih izolata B. cinerea na dikarboksimide in vivo Svi laboratorijski f izolati su se razvijali na listovima suncokreta kako u prisustvu iprodiona tako i u kontro- 48

Pestic. fitomed. (Beograd), 22 (2007) 37-54 Tabela 2. Brzina rasta i broj formiranih sklerocija izolata B. cinerea Table 2. Growth rate of B. cinerea isolates and number of sclerotia produced Dnevni porast Daily growth (mm/dan ± Sd) Broj sklerocija ± Sd No. of sclerotia ± Sd J 3 23.5 ± 0.6 efg* 0.3 ± 5.5 gh J 5 22.5 ± 3.4 g 3.3 ± 2.3 gh J 20 29.3 ± 0.5 a 40.3 ± 4.2 c J 32 25.6 ± 2.5 bcd 7.3 ±.3 b M 47 26.8 ±.0 b.3 ± 3.8 gh M 49 22.7 ±. fg 36.0 ± 3.5 cd M 50 8.7 ±.3 hi 29.3 ± 5.3 def V 66 24.3 ±.5 def 82.7 ±.5 a V 68 24. ±.6 defg 86.0 ± 5.6 a V 7 26. ±.9 bc 7.3 ± 2.3 b V 75 9.3 ±.3 hi 36.3 ± 0.8 cd S 02 20. ±.4 h 7.7 ± 6.4 hi S 08 25. ±.3 bcde 9.7 ± 3.5 fgh S 25 23.7 ± 2.3 efg 0.0 ± 0.0 i J 3f 6. ± 0.7 j 8.6 ±.7 hi J 5f 8.3 ± 2.3 i 3.0 ± 8.9 gh M 47f 3. ± 2.2 k 4.0 ± 2.0 hi M 49f 24.7 ±.9 cde 30.3 ± 3.5 cde S 25f 4.6 ± 0.6 jk 24.7 ± 5.5 ef J = Jagoda; M = Malina; V = Vinova loza; S = Salata; f = Laboratorijski dobijeni rezistentni izolati Sd = Standardna devijacija; *Ista slova označavaju da se vrednosti ne razlikuju na nivou p = 0.05 (F za porast = 48,6*; LSD 0,05;33 =.7; F za sklerocije = 55.2*; LSD 0,05;38 = 0.6) J = Strawberry; M = Raspberry; V = Vine; S = Lettuce; f = Resistant isolate obtained in the laboratory Sd = Standard Deviation, *Mean values followed by the same sletters are not significantly different (p = 0.05) (F for growth rate = 48.6*; LSD 0,05;33 =.7; F for sclerotial production = 55.2*; LSD 0,05;38 = 0.6) li (Tabela 3). i normalne osetljivosti nisu ostvarili infekciju na listovima suncokreta u prisustvu iprodiona. Intenzitet oboljenja koje su prouzrokovali izolati J 3f i J 5f u prisustvu fungicida bio je isti kao u kontroli (Tabela 3). i M 49f i S 25f su prouzrokovali simptome slabijeg intenziteta u prisustvu fungicida u odnosu na kontrolu. Suprotno, izolat M 47f je bio infektivniji u prisustvu fungicida nego u kontroli (Tabela 3). DISKUSIJA Svi laboratorijski dobijeni sojevi B. cinerea, rezistentni na iprodion, bili su rezistentni i na vinklozolin, dok su diskriminativne koncentracije benomila i prohloraza u podlozi potpuno inhibirale rast ovih izolata. U poređenju sa sojevima normalne osetljivosti, svi rezistentni sojevi rasli su sporije na KDA podlozi bez fungicida (Tabela 3). Ovi rezultati su u saglasnosti sa rezultatima drugih autora. Tako, Hisada i saradnici (979) navode da rezistentni sojevi rastu sporije od osetljivih, bez obzira da li je u hranljivu podlogu dodat fungicid ili ne. Naši laboratorijski rezistentni sojevi M 49f i S 25f, kao i sojevi koje su dobili Summers i saradnici (984) rastu brže na podlozi bez fungicida. Davis i Dennis (979; loc cit. Gouot, 994), Gullino i Garibaldi (98) i Katan (982; loc cit. Gouot, 994) su čak zabeležili stimulativno delovanje fungicida u podlozi na porast rezistentnih izolata. Niko od navedenih autora nije pokušao da objasni prirodu ove pojave. Rezistentni sojevi B. cinerea su bili slabije patogeni za plod jabuke od sojeva normalne osetljivosti. Izuzetak je bio soj M 49f koji se po patogenosti nije razlikovao od izvornog soja M 49 (Slike -3). U literaturi postoje različiti rezultati ispitivanja patogenosti laboratorijski dobi- 49

B. Tanović Tabela 3. Provera rezistentnosti f izolata B. cinerea in vivo inokulacijom primarnih listova suncokreta u prisustvu iprodiona Table 3. Assessment of resistance of the f isolates of B. cinerea in vivo by inoculation of sunflower leaves in the presence of iprodione Vizuelna ocena intenziteta oboljenja Visual assessment of disease intensity Iprodion Iprodione Kontrola Control (0 mg/l ) (destilovana voda destiled water) J 3 - +++ J 3f ++ ++ J 5 - +++ J 5f ++ ++ M 47 - ++ M 47f ++ + M 49 - +++ M 49f ++ +++ S 25 - ++ S 25f ++ +++ J = Jagoda; M = Malina; S = Salata; f = Laboratorijski dobijeni rezistentni izolati +++ = Visok intenzitet oboljenja trulež zahvata više od 60% površine listova ++ = Srednji intenzitet oboljenja trulež zahvata od 20% do 60% površine listova + = Nizak intenzitet oboljenja trulež zahvata do 20% površine listova - = Potpuno zdravi listovi J = Strawberry; M = Raspberry; S = Lettuce; f = Resistant isolate obtained in the laboratory +++ = High disease severity more than 60% of leaf area diseased ++ = Moderate disease severity 20-60% of leaf area diseased + = Low disease severity less than 20% of leaf area diseased - = No infection healthy leaves jenih rezistentnih sojeva. Po Gouot-u (994), rezistentni sojevi su, po pravilu, slabije patogeni od odgovarajućih sojeva normalne osetljivosti. Slično zaključuju i Lorenz i Pommer (985; loc. cit. Pommer i Lorenz, 995) nakon proučavanja patogenosti 43 laboratorijski dobijena soja B. cinerea visoke rezistentnosti na dikarboksimide. U 20 slučajeva sojevi su izgubili patogenost kada su postali rezistentni, a u 23 slučaja je patogenost na kotiledonima krastavca bila značajno slabija u odnosu na sojeve normalne osetljivosti. Međutim, slično izolatu M 49f proučavanom u ovom radu, uočeno je da rezistentni sojevi mogu da budu patogeni kao i osetljivi (Slika 5) (Lorenz i Eichhorn, 978). Uočene su razlike u izgledu i brzini rasta micelije osetljivih izolata iz prirodnih populacija i laboratorijski dobijenih rezistentnih sojeva B. cinerea. Rezistentni sojevi, za razliku od osetljivih, posle deset do dvanaest dana razvoja na podlozi koja sadrži iprodion, počinju da luče smeđi pigment. Ovaj pigment se pojavljuje i tokom nekoliko presejavanja ovih izolata na podlogu bez fungicida. Slične razlike u morfološkim karakteristikama osetljivih i visokorezistentnih izolata B. cinerea primetili su Grindle (979), Di Lena i saradnici (98), Leone (990), Movahedi i Heale (990) i Gouot (994), dok Faretra i Pollastro (993) navode da rezistentni izolati mogu da luče smeđi pigment u podlogu. Razlike između osetljivih i rezistentnih izolata u izgledu hifa, konidija i sklerocija nisu uočene. Građa i oblik ovih tvorevina su u potpunosti odgovarali opisu Ellis-a i Waller-a (974, loc. cit. Anonymous, 200) i Cooley-Smith-a (980, loc. cit. Anonymous, 200). Fijalokonidiofore i fijalokonidije u nizovima su bile prisutne u kulturama svih proučavanih izolata. U kulturama rezistentnih sojeva primećene su velike grupe fijalokonidija u zaštitnom omotaču, kao i spermadohije u praznim ćelijama hifa. Prema Urbasch-u (984, loc. cit. Anonymous, 200) loptaste, smeđe tvorevine sa 000 do 3000 fijalokonidija nastaju posle dugog perioda rasta u nepovoljnim uslovima. I osetljivi i rezistentni izolati su najbolje rasli na malt i KDA podlozi a najslabije na vodenom agaru (Tabela 4). Prema rezultatima Faretra-e i Grindle-a (992, loc. cit Anonymous, 200) micelija B. cinerea raste dobro na različitim prirodnim i veštačkim podlogama. Oni smatraju da su KDA podloga i podloga od malta veoma pogodne za rast izolata i formiranje sklerocija. Pollastro i saradnici (996) navode da je KDA podloga pogodnija za rast izolata od malt podloge. Prema našim rezul- 50

Pestic. fitomed. (Beograd), 22 (2007) 37-54 tatima, porast izolata na ove dve podloge se ne razlikuje statistički značajno na nivou verovatnoće 0.05 (Tabele 4 i 5). Nije zabeležena razlika između osetljivih i rezistentnih izolata u pogledu optimalnih vrednosti za kiselost podloge i temperaturu. Statistička analiza je, međutim, pokazala da variranje temperature i kiselosti podloge ima izraženiji uticaj na porast osetljivih izolata (Tabele 6-9) u odnosu na rezistentne. Naime, i osetljivi i rezistentni izolati najsporije rastu pri ph 9, pri čemu se porast rezistentnih izolata na ovoj podlozi ne razlikuje od porasta na podlogama ph 7 i ph 8 (Tabele 6 i 7). Slična pojava je zabeležena i za temperaturu. Utvrđeno je da svi proučavani izolati najbolje rastu na temperaturi od 20 o C, što je u skladu sa navodima Jarvis-a (962, loc. cit. Anonymous, 200), a da je porast najslabiji na temperaturi od 0 o C. Međutim, porast rezistentnih izolata na ovoj temperaturi se ne razlikuje statistički značajno od porasta na temperaturi od 30 o C (Tabele 8 i 9), dok je ova razlika u slučaju osetljivih izolata značajna. Osetljivi izolati B. cinerea prosečno brže rastu nego rezistentni izolati, mada postoje izuzeci. Tako se prosečan porast micelije osetljivog soja S 08 značajno ne razlikuje od porasta micelije rezistentnog soja M 49f. Nema razlike ni u porastu osetljivih sojeva V 75 i M 50 i rezistentnog soja J 5f (Tabela 2). Brži porast osetljivih izolata kao pravilo konstatuju i Pollastro i saradnici (996) i Chardonnet i saradnici (2000). Razlike između izolata, kako u brzini rasta tako i u broju formiranih sklerocija, bile su statistički značajne na nivou verovatnoće 0,05. Međutim, korelacija između broja formiranih sklerocija i parametara osetljivosti izolata na iprodion i vinklozolin nije utvrđena (Tabela 2). Latorre i saradnici (2002) su konstatovali da se izolati B. cinerea značajno razlikuju u brzini rasta i broju stvorenih sklerocija. Mišljenja o broju sklerocija koje formiraju izolati rezistentni na dikarboksimide su podeljena. Gouot (994) smatra da rezistentni izolati B cinerea formiraju više sklerocija in vitro nego osetljivi. Međutim, broj formiranih sklerocija rezistentnih izolata, proučavanih u radu Pollastro-a i saradnika (996), bio je manji u odnosu na broj sklerocija koje su formirali osetljivi izolati. Naši rezultati se delimično slažu sa navodima Pollastro-a i saradnika (996). Četiri od pet proučavanih rezistentnih izolata B. cinerea obrazuju statistički značajno manji broj sklerocija nego osetljivi izolati od kojih su dobijeni (Tabela 2). Samo rezistentni soj S 25f formira više sklerocija od odgovarajućeg osetljivog izolata S 25. Utvrđena je visoka negativna korelacija između brzine rasta izolata i rezistentnosti na dikarboksimide što potvrđuje navode Hisada-e i saradnika (979), Gouot-a (994) i Lorenz-a i Pommer-a (985; loc. cit. Pommer i Lorenz, 995) da postoji veza između brzine rasta izolata B. cinerea i osetljivosti na dikarboksimide. Koeficijenti korelacije između osetljivosti izolata B. cinerea na povećan osmotski pritisak i rezistentnosti na iprodion i vinklozolin bili su takođe visokoznačajni i negativni. Beever i Brien (983), Lorenz i Pommer (985; loc. cit. Pommer i Lorenz, 995) smatraju da su izolati, rezistentni na dikarboksimide, osetljiviji na osmotski stres od izolata normalne osetljivosti. Faretra i Pollastro (99) su utvrdili da veza između osmoosetljivosti i rezistentnosti na dikarboksimide postoji ali korelacija nije uvek jasno uočljiva zbog visoke varijabilnosti vrste B. cinerea. Ipak, Fujimura i saradnici (2000) su pronašli korelaciju između rezistentnosti na iprodion i osetljivosti na povećanje osmotskog pritiska. Svi rezistentni laboratorijski sojevi B. cinerea ostvaruju infekciju listova suncokreta u prisustvu iprodiona dok je zaraza osetljivim sojevima potpuno sprečena (Tabela 3). Naši rezultati se ne slažu sa rezultatima sličnog ogleda koji su izveli Elad i saradnici (992). Oni su rezistentnim i osetljivim izolatima B. cinerea inokulisali kotiledone listove krastavca, prethodno tretirane iprodionom koncentracije 5 mg/l. Pored očekivane zaraze rezistentnim izolatima u prisustvu fungicida, simptomi su se pojavili i na listovima inokulisanim nekim od osetljivih izolata u prisustvu fungicida. Autori ovakav ishod pripisuju heterokarionskoj prirodi vrste B. cinerea bez detaljnijeg objašnjenja. Naš eksperiment pokazuje da homogena koncentracija iprodiona na površini listova suncokreta sprečava infekciju osetljivim izolatima. Prema našim rezultatima (Tanović i sar., neobjavljeni podaci) koncentracija iprodiona od 5 mg/l dovoljna je da potpuno inhibira porast osetljivih izolata B. cinerea, in vitro. Pretpostavljamo da je način primene iprodiona (prskanje) u ogledu Elad-a i saradnika (992) izazvao efekat koji smo mi dobili kada smo obezbedili rastuću koncentraciju fungicida u hranljivoj podlozi difuzijom sa trake filter-papira. Moguće je da bi uporedni ogled sa oba opisana načina primene fungicida iste koncentracije pokazao da li je način primene fungicida izazvao ove razlike, što ostaje zadatak za buduća istraživanja. Proučavanje bioloških karakteristika izolata različite osetljivosti na dikarboksimide pokazuje da ova vrsta ima veoma izraženu varijabilost i visok genetički potencijal za prilagođavanje selektivnom pritisku fungicida. 5

B. Tanović Naime, utvrđeno je da rezistentni izolati mogu da rastu brzo kao osetljivi, mogu da budu patogeni kao i osetljivi, kao i da mogu da ostvare infekciju u prisustvu fungicida, što potvrđuje zahtev za obaveznu primenu mera upravljanja rezistentnošću. ZAHVALNOST Autor zahvaljuje prof. dr Mirku Ivanoviću, prof. dr Branki Krstić i doc. dr Aleksandri Bulajić na korisnim sugestijama pri pisanju rada. LITERATURA Anonymous: Crop Protection Compendium. CABI Publishing, CAB International, Wallingford, UK, 200. Beever, R.E. and Brien, H.M.R.: A survey of resistance to the dicarboximide fungicides in Botrytis cinerea. N.Z.J. Agric. Res., 26: 39-400, 983. Chardonnet, C.O., Sams, C.E., Trigiano, R.N. and Conway, W.S.: Variability of Three s of Botrytis cinerea Affects the Inhibitory Effects of Calcium on this Fungus. Phytopathology, 90: 769-774, 2000. Charabany, G. and Shtienberg, D.: Epidemiology of Botrytis cinerea in Sweet Basil and Implications for Disease Management. Plant Dis., 83: 554-560, 999. Davis, R.P. and Dennis, C.: Properties of dicarboximide resistant strains of Botrytis cinerea. Pesticide Sci., 2: 52-535, 98. De Waard, M.A. and Nistelrooy, J.G.M.: Antagonistic and Synergistic Activities of Various Chemicals on the Toxicity of Fenarimol to Aspergillus nidulans. Pestic. Sci., 3: 279-286, 982. Dhingra, O.D. and Sinclair, J.B.: Basic Plant Pathology Methods. CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, USA, 995, p. 359. Di Lena, P., Marciano, P. and Magro, P.: Comparative investigation on morfological and physiological features of three isolates of Botrytis cinerea. Phitopathol. Z., 00: 203-2, 98. Elad, Y., Yunis, H. and Katan, T.: Multiple fungicide resistance to benzimidazoles, dicarboximides and diethofencarb in field isolates of Botrytis cinerea in Israel. Plant Pathol., 4: 4-46, 992. Faretra, F. and Pollastro, S.: Genetic basis of resistance to benzimidazole and dicarboximide fungicides in Botryotinia fuckeliana (Botrytis cinerea). Mycol. Res., 95(8): 943-95, 99. Faretra, F. and Pollastro, S.: Genetics of sexual compatibility and resistance to benzimidazole and dicarboximide fungicides in isolates of Botryotinia fuckeliana (Botrytis cinerea) from nine countries. Plant Pathol., 4(): 48-57, 993. Fujimura, M., Ochiai, N., Ishiishi, A., Usami, R., Horikoshi, K. and Yamaguchi, I.: Fungicide Resistance and Osmotic Stress Sensitivity in os Mutants of Neurospora crassa. Pestic. Biochem. Physiol., 67: 25-33, 2000. Giraud, T., Fortini, D., Levis, C., Lamarque, C., Leroux, P., Lobuglio, K. and Brygoo,Y.: Two Sibling Species of the Botrytis cinerea Complex, transposa and vacuma, Are Found in Sympatry on Numerous Host Plants. Phytopathology, 89, 967-973, 999. Grindle, M.: Phenotypic differences between natural and induced variants of Botrytis cinerea. J. Gen. Microbiol., : 09-20, 979. Gouot, J.M.: Characteristics and Population Dynamics of Botrytis cinerea and Other Pathogens Resistant to Dicarboximides. In: Fungicide Resistance in North America (Delp, C.J. ed.). The American Phytopathological Society, St. Paul, MIN, USA, 994, pp. 53-55. Gullino, M.L. and Garibaldi, A.: Biological properties of dicarboximide resistant strains of Botrytis cinerea. Phytopathol. Mediterr., 20: 7-22, 98. Hisada, Y., Takaki, H., Kawase, Y. and Ozaki, T.: Difference in the potencial of Botrytis cinerea to develop resistance to prosymidone in vitro and in field. Ann. Phitopathol. Soc. Jpn., 45: 283-290, 979. Knight, S.C., Anthony, V.M., Brady, A.M., Greenland, A.J., Heaney, S.P., Murray, D.C., Powell, K.A., Schulz, M.A., Spinks, C.A., Worthington, P.A. and Youle, D.: Rationale and perspectives on the development of fungicides. Ann. Rev. Phytopathol., 35: 349-372, 997. LaMondia, J.A. and Douglas, S.M.: Sensitivity of Botrytis cinerea from Connecticut Greenhouses to Benzimidazole and Dicarboximide Fungicides. Plant Dis., 8(7): 729-732, 997. Latorre, B.A., Spadaro, I. and Rioja, M.E.: Occurrence of resistant strains of Botrytis cinerea to anilinopyrimidine fungicides in table grapes in Chile. Crop Protect., 2: 957-96, 2002. Leone, G.: In vivo and in vitro phosphate-dependent polygalacturonase production by different isolates of Botrytis cinerea. Mycol. Res., 94: 039-045, 990. Leroux, P. and Gredt, M.: Resistance to Fungicides which Inhibit Ergosterol Biosynthesis in Laboratory Strains of Botrytis cinerea and Ustilago maydis. Pestic. Sci., 5: 85-89, 984. Locher, F.J. and Lorenz, G.: Methods for monitoring the sensitivity of Botrytis cinerea to dicarboximide fungicides. 52