Ethanol fermentation of glucose - xylose using genetically engineered yeast

NHA TRANG UNIVERSITY Faculty of Food Technology Ethanol fermentation of glucose - xylose using genetically engineered yeast Lecturer: Dr. Van Tang Nguyen Nha Trang - 2017 9/7/2017 1

Overview Introduction Genetically engineered yeast 424A strain Metabolism in engineering yeasts Batch ethanol fermentation using genetically engineered xylose-fermenting yeast Continuous ethanol fermentation of glucose xylose using genetically engineered Saccharomyces cerevisiae 424A Summary 9/7/2017 CN rượu, bia, nước giải khát 2

Introduction 9/7/2017 CN rượu, bia, nước giải khát 3

Why is ethanol fermentation from glucose-xylose? Waste crop residues Cellulose (31 50 %) Liglocellulosic biomass Hydrolysis Forest industry wastes Hemicellulose (9 22 %) Ethanol fermentation Hexose (glucose) Hexose (glucose) and pentose (xylose, arabinose) (Govindaswamy and Vane, 2007, 2010)

Genetically engineered yeast 424A strain Pentose sugars are not all fermented with existing wild-type strains used in ethanol fermentation. (Hector et al., 2008; Hettenhaus, 1998) Saccharomyces cerevisiae 424A (LNH-ST) is one such genetically engineered strain of the wild-type yeast S. cerevisiae 1400 by recombinant plasmids. (Ho et al., 1998) 9/7/2017 5

Fig. 1. The E. coli plasmids, pkrd- 2 and pkrd-3, containing the three xylose-metabolizing gene cassette, KK-AR (or A*R)-KD. (Ho et al., 1999) BamHI, XhoI, : Restriction enzymes plnh, puck: Plasmids Fig. 2. The yeast-e. coli shuttle plasmids containing the three xylose-metabolizing gene cassette, KK-AR (or A*R)-KD. The XhoI DNA fragment containing KK-AR (or A*R)-KD was inserted into puckm10 at its SalI site. (Ho et al., 1998)

(PPP) Yeast genes: Italic caps Bacterial genes: Lower case italics 9/7/2017 CN rượu, bia, nước giải khát 7 Fig. 3. Metabolism in engineering yeasts (Jeffries, 2006)

Expression analysis by Microarray More than 600 transcripts 165 genes Fig. 4. Changes in transcript levels of S. cerevisiae YSX3 grown on glucose or xylose under aerobic or oxygen-limited conditions 9/7/2017 CN rượu, bia, nước giải khát (Jeffries, 2006)

Batch ethanol fermentation using genetically engineered xylose-fermenting yeast (Carried out in 250 ml Erlenmeyer flasks on the incubator shaker) 9/7/2017 CN rượu, bia, nước giải khát 9

Table 1. Composition of different media used for fermentation YPD: Yeast extract 10 g/l Peptone 20 g/l Dextrose 20 g/l. YPX: Yeast extract 10 g/l Peptone 20 g/l Xylose 20 g/l. (Govindaswamy and Vane, 2007) 9/7/2017 CN rượu, bia, nước giải khát 10

Absorbance was measured at 660 nm using a Spectronic 2001 spectrophotometer. 2 % seed culture Log phase growth ( ) 20 g/l glucose ( ) 16 g/l glucose, 4 g/l xylose ( ) 12 g/l glucose, 8 g/l xylose ( ) 8 g/l glucose, 12 g/l xylose ( ) 4 g/l glucose, 16 g/l xylose ( ) 20 g/l xylose Fig. 5. Growth of 424A (LNH-ST) on YP (Yeast extract 10 g/l-peptone 20 g/l) media containing single sugar or mixed glucose xylose substrates 9/7/2017 (Govindaswamy and Vane, 2007)

Stationary phase Log phase Death phase ( ) 20 g/l glucose ( ) 16 g/l glucose, 4 g/l xylose ( ) 12 g/l glucose, 8 g/l xylose ( ) 8 g/l glucose, 12 g/l xylose ( ) 4 g/l glucose, 16 g/l xylose ( ) 20 g/l xylose Lag phase Fig. 6. Growth rate of 424A (LNH-ST) on YP (Yeast extract 10 g/l-peptone 20 g/l) media containing single sugar or mixed glucose xylose substrates (Govindaswamy and Vane, 2007)

( ) 20 g/l glucose ( ) 16 g/l glucose, 4 g/l xylose ( ) 12 g/l glucose, 8 g/l xylose ( ) 8 g/l glucose, 12 g/l xylose ( ) 4 g/l glucose, 16 g/l xylose ( ) 20 g/l xylose Glucose and xylose were measured by HPLC (P-4000 pump, AS 3000 auto sampler, RI-150 detector, Luna 5 m NH2 column: 250 x 4.6 mm, column temperature: 40 C) Fig. 7. Sugar utilization in YP (Yeast extract 10 g/l-peptone 20 g/l) media containing single sugar or mixed glucose xylose substrates (Govindaswamy and Vane, 2007)

Ethanol was measured by gas chromatography (DB-624 column, flame ionization detector, direct injection liquid autosampler, sample temp. of 4 C) Log phase 1 g glucose 0.51 g EtOH 1 g xylose 0.31 g EtOH ( ) 20 g/l glucose ( ) 16 g/l glucose, 4 g/l xylose ( ) 12 g/l glucose, 8 g/l xylose ( ) 8 g/l glucose, 12 g/l xylose ( ) 4 g/l glucose, 16 g/l xylose ( ) 20 g/l xylose Fig. 8. Ethanol production in single sugar and mixed sugar fermentations (Govindaswamy and Vane, 2007)

( ) YPX + (20X) ( ) YPX + (10X + 10G) ( ) YPX + (20X + 20G) YPX 0.59 g/l Fig. 9. Effect of glucose addition on xylose fermentation (Govindaswamy and Vane, 2007)

31.3 g/l 26.1 g/l 29.6 g/l YPX 17.9 g/l Fig. 10. Xylose consumption in fermentations 9/7/2017 (Govindaswamy and Vane, 2007)

Continuous ethanol fermentation of glucose xylose using genetically engineered S. cerevisiae 424A 9/7/2017 CN rượu, bia, nước giải khát 17

100 ml of seed culture + 33 g/l dextrose monohydrate + 16 g/l xylose 9/7/2017 A, B and C: Reactors X1, X2: Magnetic stirrers P1, P2, P3 and P4: Pumps S0, S1, S2 and S3: Ports H1, H2 and H3: Harvesting ports Fig. 11. Continuous fermentation set-up (Govindaswamy and Vane, 2010)

Glucose and xylose were measured by HPLC (P-4000 pump, AS 3000 auto sampler, RI-150 detector, Shodex-Sugars RZ993 column: 150 x 4.6 mm, column temperature: 50 C) 24.4 g/l 50.1 g/l 0.49 g EtOH/g glucose 8.8 g/l Centrifuged Washed by DI water Dried at 90 C for 16 h Fig. 12. Pilot-scale batch fermentation results using initial glucose concentration of 50.1 g/l 1 % seed culture (Govindaswamy and Vane, 2010)

39 g/l Dilution rate of 0.37 /h 14.6 g/l/h 17.8 g/l Dilution rate of 0.5 /h 9 g/l/h Fig. 13. Glucose consumption, ethanol production and the corresponding rates of consumption and production 9/7/2017 (Govindaswamy and Vane, 2010)

91.3% + 30 g/l glucose + 15 g/l xylose Fig. 14. Time course of sugar utilization at different flow rates in the three stages of MCCF (Govindaswamy and Vane, 2010)

69% 37% 3% Fig. 15. Effect of flow rate on the cumulative consumption of xylose 9/7/2017 (Govindaswamy and Vane, 2010)

0.49 g EtOH/g glucose Fig. 16. Summary of ethanol production at different stages of the MCCF system (Govindaswamy and Vane, 2010)

V A = V c = 1L V B =3L Volumetric productivity, defined as the rate of ethanol production divided by the reactor volume Fig. 17. Effect of flow rate on the volumetric ethanol productivity (Govindaswamy and Vane, 2010)

Summary 9/7/2017 CN rượu, bia, nước giải khát 25

Growth rates of 424A (LNH-ST) were higher in glucose-based media as compared to pure xylose -based medium. Growth and substrate utilization was not substrate limited at the initial concentrations. Ethanol production rates were highest for media containing glucose. The addition of glucose dramatically increased the rate of ethanol production. Glucose (cosubstrate) inhibited xylose fermentation. 9/7/2017 CN rượu, bia, nước giải khát 26

The preference of the yeast for glucose, xylose consumption was markedly lower than glucose consumption. Xylose consumption dropped as flow rate increased. Ethanol concentration increased as flow rate decreased Ethanol productivity in MCCF was dominated by glucose consumption. Volumetric productivity increased as flow rate increased. 9/7/2017 CN rượu, bia, nước giải khát 27

9/7/2017

Lignocellulose 9/7/2017 29

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG Khoa Công nghệ Thực phẩm PHƯƠNG PHÁP SẢN XUẤT BIA KHÔNG CỒN VÀ BIA NỒNG ĐỘ CỒN THẤP Giảng viên: TS. Nguyễn Văn Tặng Nha Trang - 2017 9/7/2017 30

Nội dung Phát triển bia không cồn và bia nồng độ cồn thấp Sản xuất bia không cồn và bia nồng độ cồn thấp sử dụng enzyme xellulase chịu nhiệt cao Sản xuất bia không cồn và bia nồng độ cồn thấp sử dụng khí để đuổi cồn Sản xuất bia không cồn và bia nồng độ cồn thấp sử dụng nấm men đột biến ADH-âm Kết luận 9/7/2017 CN rượu, bia, nước giải khát 31

Phát triển bia không cồn và bia nồng độ cồn thấp 9/7/2017 CN rượu, bia, nước giải khát 32

Bia không cồn và bia nồng độ cồn thấp? Theo qui định của Đức Bia truyền thống: Nồng độ cồn 3,2 4,2% khối lượng Bia không cồn: Nồng độ cồn dưới 0,5% khối lượng Bia nồng độ cồn thấp: Nồng độ cồn 0,5 1,5% khối lượng 9/7/2017 (Witt and Iowa, 1988; Driondziak and Fed, 1989)

Tại sao lại phát triển và sử dụng bia không cồn và bia nồng độ cồn thấp? Bia truyền thống Bia không cồn và bia nồng độ cồn thấp Nồng độ cồn cho phép là 0,4mg/1L khí thở. 9/7/2017 CN rượu, bia, nước giải khát 34

Tại sao lại phát triển và sử dụng bia không cồn và bia nồng độ cồn thấp? Bia truyền thống Bia không cồn và bia nồng độ cồn thấp 9/7/2017 CN rượu, bia, nước giải khát 35

Tại sao lại phát triển và sử dụng bia không cồn và bia nồng độ cồn thấp? Bia truyền thống Bia không cồn và bia nồng độ cồn thấp 9/7/2017 CN rượu, bia, nước giải khát 36

Tại sao lại phát triển và sử dụng bia không cồn và bia nồng độ cồn thấp? Bia truyền thống Bia không cồn và bia nồng độ cồn thấp 9/7/2017 CN rượu, bia, nước giải khát 37

Sản xuất bia không cồn và bia nồng độ cồn thấp sử dụng enzyme xellulase chịu nhiệt cao 9/7/2017 CN rượu, bia, nước giải khát 38

Enzyme xellulase Enzyme xellulase hoạt động ở điều kiện: + Nhiệt độ: 40-60 C (t otp : 50-55 C). + ph: 4,2-5,8 (ph otp : 4,8) Enzyme xellulase chịu nhiệt cao là loại không bị vô hoạt hoàn toàn ở nhiệt độ 80 C. 9/7/2017 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10327458 )

Cơ chế thủy phân xelluloza bởi xellulase 9/7/2017 (http://en.wikipedia.org/wiki/cellulase)

QTSX bia không cồn và bia nồng độ cồn thấp sử dụng enzyme xellulase Malt đại mạch -amylaza: BAN 120, TENASE, CANALPHA 600 Nấu lần 1 Nấu lần 2 -amylaza (0,05 0,5% malt) xellulase (LAMINEX) T : 78-80 C ph: 5,5-7,0 1 : 30 phút 2 : 30 phút Lọc, đun sôi và làm nguội (T : 10-16 C, 2 : 2-8 ngày) Lên men Nấm men Pha trộn, lọc Tinh bột thủy phân, DE < 25 Houblon, chất màu Pha loãng Nước đã tách khí và axit hóa 9/7/2017 Đóng chai, thanh trùng Bia thành phẩm (Witt and Iowa, 1988)

So sánh hiệu quả sử dụng enzyme xellulase Mẫu đối chứng 80g malt bia xay thô (5% độ ẩm) được nấu trong 320 ml nước cất ở 78-79 C trong 60 phút, không bổ sung thêm enzyme α-amylaza. Chỉ tiêu Mẫu đối chứng Mẫu sử dụng xellulase ml dịch lọc từ 100g dịch nấu Tốc độ lọc Dịch chiết (% chất khô DE) % chất rắn hòa tan Khối lượng (dextrose) trong 100mL dịch nha Nitơ formol, g/100 ml Nitơ α-amino, ppm Độ nhớt dịch nha, cp, 20 C ph 24 Chậm 63,48 26,46 3,44 0,0434 283 1,83 5,2 Mẫu thí nghiệm Tến hành như nồi nấu đối chứng trong 30 phút đầu. Sau đó, bổ sung 0,2% xellulase (Laminex) (so với malt) và tiếp tục nấu ở 78 C trong 30 phút nữa. Cả hai nồi nấu được pha loãng đến 400 g bằng nước cất 75 C, trộn đều và đem lọc nóng qua giấy lọc Whatman số 1. 68 Bình thường 72,46 24,95 3,55 0,0414 269 1,89 5,2 (Witt and Iowa, 1988)

Sản xuất bia không cồn và bia nồng độ cồn thấp sử dụng khí để đuổi cồn 9/7/2017 CN rượu, bia, nước giải khát 43

Cồn được loại bỏ ra khỏi bia có cồn bằng việc sử dụng một trong các khí để đuổi cồn sau: + Không khí. + Khí trơ (CO 2, N 2, ). Phương pháp + Hơi bão hòa: Hấp thu chọn lọc cồn từ bia. + Không khí bão hòa hơi nước: Cồn được thu hồi khỏi khí tuần hoàn bằng sấy lạnh. (Driondziak and Fed, 1989) 9/7/2017 CN rượu, bia, nước giải khát 44

Việc loại bỏ cồn là nguyên nhân chính của sự tổn thất mùi vị trong bia. Cần bổ sung các chất (Krausen, là một dịch nha được lên men nhẹ, mức độ lên men 6-8%) vào bia để nâng cao chất lượng cảm quan (hương vị và mùi) cho bia. (Driondziak and Fed, 1989) 9/7/2017 CN rượu, bia, nước giải khát 45

Thử nghiệm Thiết bị được đổ đầy 21,25 lít bia/mẻ, trộn với nấm men (S.rouxii, DSM 253), gia nhiệt tới 35 C và thổi không khí 30m 3 /giờ. Sau 15 phút thổi khí, thêm 3,75 lít dịch nha ban đầu nồng độ 12% đã được gia nhiệt trước tới 35 C và tiếp tục thổi khí cho đến khi bia có độ cồn 0% (khoảng 75 phút). Các chỉ tiêu thu được (% khối lượng) như sau Chỉ tiêu Bia ban đầu Bia thành phẩm Ghi chú Dịch nha ban đầu 12 12 Chất chiết thực 4 5 Chất chiết có thể lên men: 1% Chất chiết biểu kiến 2 5 Hàm lượng cồn 4 0 Sự khác nhau về cảm quan giữa bia ban đầu và bia cuối rất ít. (Driondziak and Fed, 1989) 9/7/2017 CN rượu, bia, nước giải khát 46

Sản xuất bia không cồn và bia nồng độ cồn thấp sử dụng nấm men đột biến ADH-âm 9/7/2017 CN rượu, bia, nước giải khát 47

Các phương pháp chưng cất, bốc hơi cồn có nhược điểm là vị của bia không cồn hoặc bia nồng độ cồn thấp thu được không tốt bằng bia có độ cồn thông thường. (Driondziak and Fed, 1989) 9/7/2017 CN rượu, bia, nước giải khát 48

Sản xuất bia không cồn và bia nồng độ cồn thấp sử dụng nấm men Saccharomyces cerevisiae đột biến gen ADHâm không có enzyme alcoholdehydrogenase nên không thể tạo ethanol, từ đó thu được bia không cồn hoặc bia nồng độ cồn thấp bằng cách phối trộn với bia có độ cồn thông thường. (Driondziak and Fed, 1989) 9/7/2017 CN rượu, bia, nước giải khát 49

Thử nghiệm Giống nấm men S. cerevisiae đột biến ADH-âm được thêm vào tank lên men cùng với dịch nha (hàm lượng chất chiết ban đầu 11%), lên men ở 21 C. Tank lên men được nạp khí CO 2 24h một lần trong vòng 30 phút để loại bỏ acetaldehyt. Kết thúc lên men, bia đạt các chỉ tiêu (% khối lượng) sau: Dịch nha ban đầu (%): 11 Dịch chiết thực (%): 3,7 Hàm lượng glycerol (%): 1,5 Ethanol (%): 0,0 (Driondziak and Fed, 1989) 9/7/2017 CN rượu, bia, nước giải khát 50

Kết luận 9/7/2017 CN rượu, bia, nước giải khát 51

Sản xuất bia không cồn và bia nồng độ cồn thấp sử dụng enzyme xellulase chịu nhiệt cao có thể làm tăng nồng độ chất khô của dịch chiết lên tới 15%, quá trình lọc dịch nha sau nấu dễ dàng hơn và lượng dịch nha thu được nhiều gấp 3 lần. Sử dụng khí để đuổi cồn làm cho bia bị tổn thất về mùi vị nên cần phải bổ sung các chất để bù lại sự tổn thất về mùi vị cho bia. Sử dụng nấm men đột biến ADH-âm làm tăng hàm lượng glycerol lên đáng kể, do đó góp phần làm tăng mùi vị cho bia. 9/7/2017 CN rượu, bia, nước giải khát 52

Vấn đề khi sử dụng bia không cồn và bia nồng độ cồn thấp? 9/7/2017 CN rượu, bia, nước giải khát 53

Thanks for your attention! 9/7/2017 CN rượu, bia, nước giải khát 54