NAUČNI RAD Original Paper EFEKTI HIPERTERMIJE NA KONCENTRACIJU GLUKOZE I HEMOGRAM ŠTAKORA (Rattus norvegicus) EFFECTS OF HYPERTHERMIA ON BLOOD SERUM GLUCOSE LEVEL AND HAEMOGRAM IN RATS (Rattus norvegicus) Mahmutović Lejla, Hasković E., Suljević D. 1 Abstract We investigated the impact of short-term experimental hyperthermia on glucose and haemogram in rats Rattus norvegicus (Wistar strain). The blood used for the analysis was obtained by the method of direct puncture of the heart. We analyzed the biochemical (glucose) and haematological parameters (RBC, WBC, hemoglobin, hematocrit, and haematological indices). The effect of short-term hyperthermia leads to a statistically significant increase of the number of erythrocytes, leukocytes and glucose concentration, whereas statistically significant reduction in hemoglobin concentration and hematological indices is evident. Key words: hyperthermia, haemogram, glucose concentration Kratak sadržaj Ispitivan je uticaj kratkotrajne eksperimentalne hipertermije na koncentraciju glukoze i hemogram štakora Rattus norvegicus (soj Wistar). Krv korištena za analizu dobijena je metodom direktne punkcije srca. Analizirani su biohemijski (glukoza) i hematološki parametri (RBC, WBC, hemoglobin, hematokrit i hematološki indeksi). Efekt kratkotrajne hipertermije dovodi do statistički signifikantnog povećanja broja eritrocita, leukocita i koncentracije glukoze, dok je evidentno statistički značajno smanjenje koncentracije hemoglobina i hematoloških indeksa. Ključne riječi: hipertermija, hemogram, koncentracija glukoze 1 Mr. sc. Lejla Mahmutović, biolog, Kantonalna bolnica Zenica, (lejla.mahmutovic @gmail.com), dr.sc. Edhem Hasković, biolog, vanredni profesor, Odsjek za biologiju, Prirodnomatematički fakultet, Univerzitet u Sarajevu, mr.sc. Damir Suljević, biolog, viši asistent, Odsjek za biologiju,prirodno -matematički fakultet, Univerzitet u Sarajevu Lejla Mahmutović, MSc, Biologist, Cantonal Hospital Zenica, (lejla.mahmutovic @gmail.com), Edhem Hasković, PhD, Biologist, Associate Professor, Department of Biology, Faculty of Science, University of Sarajevo, Damir Suljević, Msc, Biologist, Senior Assistant, Department of Biology, Faculty of Science, University of Sarajevo Veterinaria 61 (1-2), 35-42, Sarajevo 2012. 35
Uvod Proučavanja variranja biohemijskih i fizioloških procesa kod životinjskih organizama imaju veliki naučni i praktični značaj. Naime, podaci o veličini istraživanih parametara omogućavaju uvid u cijeli niz procesa u organizmu, a posredno u stanje životne sredine. Svaka promjena u životnoj sredini izaziva i određeni efekt, što prouzrokuje i fiziološki odgovor kojim se pokušava održati ravnoteža unutar određenih granica, odnosno prilagođavanje promjenjivim uslovima (12). Hematopoetski sistem spada u sisteme organizma vrlo osjetljive na promjene faktora vanjske sredine i istovremeno je pokazatelj općeg stanja organizma. Poznato je da opća krvna slika predstavlja jedan od osnovnih kriterija u dijagnostici općeg stanja organizma. Krv u širem smislu predstavlja izvanredan i pouzdan indikator fiziološkog stanja organizma, a samim tim i promjene koje se dešavaju u organizmu pod uticajem različitih faktora vanjske sredine (9). Preduslov za korištenje hematoloških podataka u svrhu procjene uticaja ekoloških promjena i patoloških stanja je dobro poznavanje normalne hematologije date vrste i granica fiziološkog variranja hematološkog statusa. Iz ovog proizlazi, da je potrebno razlikovati promjene u krvnoj slici koje nastupaju fiziološki (cirkanualne, cirkadijane, aklimacione) od onih koje su prouzrokovane patološkim stanjem organizma. Za shvatanje promjena koje nastaju u krvnoj slici od velikog su značaja eksperimentalna ispitivanja i istraživanja o reakciji hematološkog statusa kod djelovanja pojedinih patogenih agenasa (15). Kod životinjskih organizama dolazi do niza promjena koje su posljedica reakcije na stanje stresa, a koje se mogu adekvatno predstaviti na osnovu promjena u krvnoj slici. Odgovor organizma na stresne reakcije promjenom hematoloških parametara dobro je proučen kod stresa izazvanog povećanjem spoljašnje temperature. Kako su promjene temperature popratna pojava u okolišu, ovakva istraživanja omogućavaju određivanje praga tolerancije ove vrste u odnosu na ekološke promjene (17). Hipertermija se definira kao povećanje tjelesne temperature od najmanje 1,5 C iznad normalne tjelesne temperature. Mnogobrojni znanstveni radovi potvrđuju da hipertermija djeluje teratogeno kako kod životinja tako i kod ljudi (14). Stanje povišene tjelesne temperature (hipertermija) može biti posljedica: a) podešenosti termoregulacijskog centra na viši nivo, dakle iznutra, kao kod vrućice i b) poremećenog stvaranja i odavanja toplote, tj. povišenja temperature tijela zbog visoke temperature okoliša (16). Kako povišena temperatura uslovljava povećanje nivoa glukoze i promjene vrijednosti hemograma u organizmu, ovakav sistem uključuje složeni odbrambeni mehanizam koji integrira humoralni i nervni nivo. Zbog toga ovakav složeni odbrambeni sistem daje uvijek vidljive rezultate o fiziološkim procesima koji se dešavaju u organizmu pod uticajem stresnih faktora (17). 36
Tokom termalnog stresa kod štakora se dešavaju dva različita procesa: relativno kratko vrijeme otpušta se adrenalin, dok je lučenje kortikosteroida (kortizol) proces koji traje duže. Ova dva procesa se dešavaju istovremeno, ali imaju različite efekte na periferni sastav krvi. Kod štakora, najveće promjene usljed djelovanja adrenalina su povećanje koncentracije glukoze i broja limfocita, a tokom hroničnog stresa, dolazi do smanjenja broja limfocita i eozinofila djelovanjem kortikosteroida (2). Osnovni ciljevi ovog eksperimenta su utvrđivanje promjene hematoloških parametara (eritrocita i leukocita) kod štakora (Rattus norvegicus) u uslovima hipertermije, kao i efekt hipertermije na koncentraciju serumske glukoze. Materijal i metode Štakori (Rattus norvegicus, soj Wistar) korišteni u ovom eksperimentu uzgojeni su u vivariju Katedre za biohemiju i fiziologiju Odsjeka za biologiju Prirodnomatematičkog fakulteta u Sarajevu. Hranjeni su standardnom hranom koja se inače koristi pri uzgoju ove vrste, a uzgojeni su u specijalnim kavezima koji odgovaraju međunarodnim standardima. Eksperimentalne tehnike U eksperimentu je 10 jedinki korišteno kao kontrolna grupa (K), dok je 30 jedinki izloženo kratkotrajnoj hipertermiji, kao eksperimentalna grupa (E). Kod kontrolne grupe (K) izvršena je direktna punkcija srca radi uzimanja krvi za analizu. Sve jedinke su prije toga blago anestezirane hloroformom. Kod eksperimentalne grupe (E) povećanje tjelesne temperature izazvano je izlaganjem životinja povećanoj temperaturi sredine, tj. stavljanjem životinja u zagrijanu vodu pri 40 0 C u trajanju od 10 minuta. Nakon izlaganja povišenoj temperaturi, jedinke eksperimentalne grupe su također anestezirane te su uzeti uzorci krvi za analizu, na isti način kao i kod kontrolne. Uzorcima krvi dodavan je odgovarajući antikoagulans (EDTA), osim za krv koja je korištena za biohemijske analize. Koncentracija glukoze određivana je u serumu dobivenom centrifugiranjem krvi 10 minuta pri 3.500 rpm. Hematološko-biohemijske tehnike Određivanje koncentracije glukoze u serumu vršeno je metodom sa heksokinazom pomoću spektrofotometra, pri 340 nm talasne dužine (7). Za određivanje koncentracije hemoglobina korištena je cijanidmethemoglobin metoda na spektrofotometru pri talasnoj dužini od 546 nm. Metoda se zasniva na pretvaranju hemoglobina u cijanidmethemoglobin (HbCN) i poređenju boje s bojom standardnog rastvora poznate koncentracije (metoda po Drabkinu) (11). Veterinaria 61 (1-2), 35-42, Sarajevo 2012. 37
Određivanje hematokrita vršeno je mikrohematokrit metodom, koja podrazumijeva centrifugiranje krvi kojoj je dodat odgovarajući antikoagulans, korištenjem mikrohematokrit centrifuge (7). Broj eritrocita i leukocita određivan je standardnom metodom u hemocitometru (11). Vrijednosti hematoloških indeksa utvrđene su uvrštavanjem vrijednosti koncentracije hemoglobina, vrijednosti hematokrita i broja eritrocita u odgovarajuće formule (7). Svi rezultati ispitivanja su obrađeni metodama deskriptivne i analitičke statistike, uz primjenu statističkog programa Microsoft Excel 2010. Rezultati U tabeli 1 prikazane su vrijednosti ukupnog broja eritrocita (RBC), ukupnog broja leukocita (WBC), hematokrita (Hct), koncentracije glukoze, hemoglobina (Hb) i hematoloških indeksa (MCV, MCH, i MCHC). Tabela 1. Vrijednosti hematoloških i biohemijskih parametara kod kontrolne i eksperimentalne grupe štakora Table 1. The values of hematological and biochemical parameters in control and experimental groups of rats Parametar min max stdev V% RBC (10 12 /l) K 6,5 5,53 7,28 0,46 7,63 E 6,89 5,08 7,42 0,45 6,65 WBC (10 9 /l) K 3,76 3,25 4,35 0,42 11,3 E 5,13 4,15 6,5 0,71 13,8 Hct (l/l) K 0,39 0,32 0,63 0,09 23,5 E 0,4 0,36 0,47 0,02 5,65 Glukoza (mmol/l) K 2,31 1,1 4,4 1,09 47,3 E 3,9 1,1 9,9 2,44 62,3 Hb (g/l) K 247,22 200,55 343,55 42,63 15,54 E 224,22 84,35 321,05 45,05 20,09 MCV (fl) K 60,26 46,47 95,74 7,72 22,95 E 59,3 51,28 69,66 5,07 8,55 MCH (pg) K 43,3 31,04 54,32 7,72 18,26 E 32,65 12,55 43,03 6,53 19,99 MCHC (g/l erit.) K 728,07 356,66 953,75 170,54 23,42 E 547,56 243,4 770,85 113,84 20,79 Svi dobiveni podaci su komparirani i analizirani korištenjem studentovog t-testa, a rezultati tog testa su prikazani u tabeli 2. 38
Tabela 2. Statistička značajnost razlika ispitivanih parametara između kontrolne i eksperimentalne grupe štakora Table 2. The significant difference of the investigated parameters in control and experimental groups of rats Parametar Kontrolna grupa Eksperimentalna grupa Ph vrijednost WBC (10 9 /l) 3,76 5,13 p < 0,05 RBC (10 12 /l) 6,50 6,89 p < 0,05 Hct (l/l) 0,39 0,40 p > 0,05 Glukoza (mmol/l) 2,31 3,92 p < 0,05 Hb (g/l) 247,22 224,22 p < 0,05 MCV (fl) 60,26 59,30 p > 0,05 MCH (pg) 43,30 32,65 p < 0,05 MCHC (g/l erit.) 728,07 547,56 p < 0,05 Vrijednosti hematokrita i MCV nisu se značajno mijenjale u hipertermiji. Statistički signifikantne razlike između kontrolne i eksperimentalne grupe utvrđene su za ostale parametre, kao posljedica djelovanja hipertermije na navedene biohemijske i fiziološke parametre u krvi štakora. Diskusija Analizirajući dobivene vrijednosti hematoloških parametara (tab. 1) evidentno je da nizak koeficijent variranja upućuje na činjenicu da nisu izražena značajnija individualna variranja hematoloških parametara u krvi štakora. U nekim slučajevima, koeficijent variranja je manji kod eksperimentalne grupe, odnosno u uslovima hipertermije, što govori u prilog činjenici da eksperimentalne životinje dobro podnose hipertermiju i nema individualnih razlika. Štakori obje analizirane grupe imaju vrlo izražena individualna variranja u koncentraciji serumske glukoze, a posebno u hipertermiji. Hipertermija, kao stres, izaziva povećanje broja eritrocita, leukocita i koncentracije glukoze, dok ostali parametri pokazuju smanjenje njihovih vrijednosti (Hb, MCH i MCHC), a vrijednosti hematokrita i prosječnog volumena eritrocita (MCV) ne pokazuju skoro nikakve razlike. Prilikom izlaganja štakora hipertermiji dolazi do statistički značajnog porasta vrijednosti broja leukocita i eritrocita. Povećanje broja leukocita je odgovor organizma na stres i predstavlja jednu od adaptivnih sposobnosti organizma prilikom djelovanja stresnih faktora. Poznato je da se u stresnim stanjima aktivira imunološki sistem, što rezultira povećanim brojem leukocita u cirkulaciji (5). I povećanje broja eritrocita može se dovesti u vezu sa adaptivnom sposobnošću organizma, jer se u uslovima hipertermije povećava potreba za kisikom, a da bi se te potrebe podmirile, povećava se broj eritrocita, što automatski znači i povećanje hematokritske vrijednosti (3). Veterinaria 61 (1-2), 35-42, Sarajevo 2012. 39
Osim što je povećanje broja leukocita i eritrocita jedna od adaptivnih osobina organizma na stres, ovo se povećanje generalno može dovesti u vezu i sa povećanim intenzitetom metaboličkih procesa tokom hipertermije, čime se ubrzava rad svih sistema, pa tako i hematopoetskog, jer povećanje intenziteta metaboličkih procesa dovodi do hipoksije koja je glavni stimulator hematopoeze (1). Vrijednosti MCV-a neznatno padaju kod eksperimentalne grupe štakora, ali taj pad vrijednosti nije statistički značajan. Smanjenje vrijednosti ovog parametra u stanju hipertermije može se dovesti u vezu s povećanjem broja eritrocita i njihovom smanjenom zapreminom, jer je poznato da su povećane vrijednosti broja eritrocita praćene smanjenim vrijednostima MCV-a, odnosno broj eritrocita i njihova zapremina su obrnuto proporcionalni (6). Signifikantan pad vrijednosti koncentracije hemoglobina i hematoloških indeksa MCH i MCHC konstatovan je kod eksperimentalne grupe štakora. Za očekivati bi bilo da će, usljed signifikantnog povećanja broja eritrocita kod eksperimentalne grupe štakora, doći i do povećanja vrijednosti koncentracije hemoglobina, kao i povećanja vrijednosti ostala dva hematološka indeksa, obzirom da su njihove vrijednosti vezane za vrijednost koncentracije hemoglobina. Međutim, vrijeme ekspozicije povišenoj temperaturi je bilo prilično kratko (10 minuta), što je vjerovatno bilo nedovoljno za usklađivanje svih adaptivnih mehanizmama koje organizam pokreće u slučaju stresne situacije. Poznato je da povećanu eritropoezu ne prati uvijek povećana sinteza hemoglobina, jer je sinteza hemoglobina dosta složenija (13). To je naročito izraženo kada su organizmu potrebne veće koncentracije kisika, pa hematopoetski sistem ubacuje iz depoa u cirkulaciju veći broj eritrocita, kao što je to u slučaju hipertermije, jer je tada organizam u stanju blage hipoksije (8). Za pretpostaviti je da bi se usljed povećanja broja eritrocita povećala i koncentracija hemoglobina, da je vrijeme ekspozicije povišenoj temperaturi duže trajalo. Logično je bilo očekivati statistički signifikantan porast koncentracije glukoze kod eksperimentalne grupe štakora usljed aktivacije metaboličkih procesa izazvanih reakcijama na povišenu temperaturu. Porast koncentracije glukoze nastupa pod stresom. U stresnim se situacijama (hipertermija, fizički napor, strah, itd.) pored ostalih tvari luči i adrenalin. Zbog jačeg lučenja adrenalina, fiziološki dolazi do laganog porasta glukoze u krvi (4). Povišena vrijednost koncentracije glukoze posljedica je i povećane mišićne aktivnosti usljed kretanja, pri čemu se troši energija, a zbog čega dolazi do priliva glukoze iz njenih depoa. Ovaj porast koncentracije glukoze rezultira adaptacijama na tkivnom nivou (10). Kako su tretirane jedinke štakora pokazale intenzivne reakcije tokom izloženosti povišenoj temperaturi, a koje su se ogledale u neprestanom kretanju, pokušaju bijega i uznemirenošću, logične su i dobijene vrijednosti koncentracije glukoze, kao posljedica intezivnog mišićnog rada i stresnog odgovora. 40
Zaključci Hipertermija djeluje kao stresogeni faktor na hematološki i biohemijski status štakora. Adaptivni odgovor štakora na stresore ogleda se kroz povećanje broja eritrocita i leukocita te povećanje koncentracije glukoze kao najznačajnijeg odbrambenog faktora u stresnoj reakciji. Kratkotrajna hipertermija značajno utiče na eritopoezu, u smislu izbacivanja eritrocita iz njihovih depoa u cirkulaciju, dok je eritropoeza u koštanoj srži nedovoljna da za kratko vrijeme pokrene složene mehanizme, uključujući sintezu hemoglobina, čija je koncentracija u ovakvoj hipertermiji snižena, kao i neki hematološki indeksi. LITERATURA 1. Blair S. Haemato biochemical alterations induced by lied acetate toxicity in Wistar Rats. Department of Veterinary pathology, College of Veterinary Sciences and A. H. Anaund Agriculture University. 1965. 2. Car BD, Eny VM, Everds NE, Clinical pathology of the rat. 1992. 3. Chrousos G, Gold P. The concepts of stress and stress system disorders: overwiev ofphysical and behavioral homeostasis. JAMA. 1992: 267 (9): 1244-1252. 4. Crosby F. Haematologic and serum protein alterations in the hipertermic Rat. Beaton exp. Biol. Med. 1965: 107 : 426 428. 5. Domingeuez-Gerpe, Rey-Mendez. Alterations induced by chronic stress in lymphocyte subsets of blood and primary and secondary immune organs of mice. BMC Immunol. 2001: 2;7. 6. Guyton A. Fiziologija čovjeka. Medicinska naklada, Zagreb. 2000. 7. Hasković E., Ivanc A., Mitrašinović M. Autorizovana skripta Uporedna fiziologija životinja i čovjeka. Univerzitet u Sarajevu. Prirodno - matematički fakultet. Odsjek za biologiju. 2004. 8. Hauptmann E. Osnove kliničke hematologije. Školska knjiga. Zagreb.1991. 9. Ivanc A. Ecophysiological interpretation of the haematology of different species of Percidae in the Tisa river. Tiscia. 1994; 28:53 57. 10. Ivanc A., Hasković E., Dekić R., Sarić M. Mehanizmi fizioloških adaptacija. I Simpozijum biologa Republike Srpske. Banja Luka.2005. 11. Ivanc A., Hasković E., Mitrašinović M. Autorizovana skripta Opšta fiziologija životinja i čovjeka. Univerzitet u Sarajevu. Prirodno-matematički fakultet. Odsjek za biologiju. WUS Austria. 2004. 12. Krupauer V. Vliv pohlaví na váhu lína obecheho. Buletin VUR Vodnany. 1968; 4: 8 13. 13. Nikolić B. Osnovi fiziologije čovjeka. Medicinska knjiga. Beograd Zagreb. 1969. 14. Petrović MV. Uporedna fiziologija životinja I dio. Beograd. 1991. Veterinaria 61 (1-2), 35-42, Sarajevo 2012. 41
15. Suzuki Y. Basofil migrations in acute inflammation. Nippon Suisan Gakkaishi Bulletin of the Japanese Society of Scientific. 1992;11: 2005-2007. 16. Van Breukelen F, Martin SL. Molecular Biology of Thermoregulation. J.Appl. Physiol. 2002. 17. Vijayan MM, Moon TW. Acute handling stress alters hepatic glicogen metabolism. Can J. Sci. 1992; 49: 2226 2260. Uredništvo primilo rukopis 25.01.2012. 42