Mendelova univerzita v Brně Zahradnická fakulta v Lednici Vplyv fortifikácie v rôznych štádiách macerácie/fermentácie na antioxidačné vlastnosti vín

Mendelova univerzita v Brně Zahradnická fakulta v Lednici Vplyv fortifikácie v rôznych štádiách macerácie/fermentácie na antioxidačné vlastnosti vín Diplomová práca Vedúca diplomovej práce Ing. Barbora Nádeníčková Vypracoval Bc. Michal Holovic Lednice 2014

Prehlásenie Prehlasujem, že som diplomovú prácu na téma Vplyv fortifikácie v rôznych štádiách macerácie/fermentácie na antioxidačné vlastnosti vín vypracoval samostatne a všetky použité zdroje a informácie uvádzam v zozname použitej literatúry. Súhlasím, aby bola moja práca zverejnená v súlade s 47b zákona č. 111/1998 Zb., o vysokých školách v znení neskorších predpisov a v súlade s platnou Smernicou o zverejňovaní vysokoškolských záverečných prác. Som si vedomý, že sa na moju prácu vzťahuje zákon č. 121/2000 Zb., autorský zákon a že Mendelova univerzita v Brně má právo na uzavretie licenčnej zmluvy o využití tejto práce ako školného diela podľa 60 odsek. 1 autorského zákona. Ďalej sa zaväzujem, že pred spísaním licenčnej zmluvy o využití diela inou osobou (subjektom) si vyžiadam písomné stanovisko univerzity, že predmetná licenčná zmluva nie je v rozpore s oprávnenými záujmami univerzity a zaväzujem sa uhradiť prípadný príspevok na úhradu nákladov spojených so vznikom diela a to až do ich skutočnej výšky. V Lednici, dňa... Podpis diplomanta....

Poďakovanie Rád by som sa na tomto mieste poďakoval predovšetkým vedúcej diplomovej práce Ing. Barbore Nádeníčkovej, za jej odborné vedenie, cenné pripomienky a ochotu pri riešení problematiky práce. Veľká vďaka tiež patrí Bc. Rostislavovi Slavíkovi, všetkým mojim blízkym, ktorí mi boli počas celej doby spracovávania práce potrebnou oporou a každému, kto sa čo i len malou mierou pripojil ku vzniku tohto diela.

OBSAH 1 ÚVOD...8 2 CIEĽ PRÁCE...9 3 LITERÁRNY PREHĽAD... 10 3.1 HISTÓRIA VÝROBY FORTIFIKOVANÝCH VÍN... 10 3.2 AKÉ SÚ FORTIFIKOVANÉ VÍNA?... 10 3.2.1 POUŽITIE DESTILÁTOV PRI VÝROBE FORTIFIKOVANÝCH VÍN... 11 3.2.2 METÓDY DOLIEHOVANIA (FORTIFIKÁCIE) VÍN... 12 3.2.3 VÝROBA FORTIFIKOVANÝCH VÍN V ZAHRANIČÍ... 13 3.2.4 VÝROBA FORTIFIKOVANÝCH VÍN V ČR... 20 3.3 PROBLÉMY FORTIFIKOVANĆH VÍN... 20 3.4 ŠTÚDIUM FENOLOVÝCH LÁTOK... 22 3.4.1 NEFLAVONOIDY... 23 3.4.2 FLAVONOIDY... 27 3.4.3 SENZORICKÉ VLASTNOSTI FENOLOVÝCH LÁTOK... 34 3.5 ŠTÚDIUM ANTIOXIDAČNEJ AKTIVITY... 36 3.5.1 PÔSOBENIE VOĽNÝCH RADIKÁLOV... 36 3.5.2 REAKTÍVNE KYSLÍKOVÉ A DUSÍKOVÉ FORMY... 37 3.5.3 VÝZNAM ANTIOXIDANTOV... 38 3.5.4 PRÍRODNÉ ANTIOXIDANTY... 40 3.5.5 METÓDY STANOVENIA ANTIOXDAČNEJ AKTIVITY... 42 4 EXPERIMENTÁLNA ČASŤ... 45 4.1 MATERIÁL... 45 4.1.1 VYBRANÉ ODRODY... 45 4.1.2 VÝROBA FORTIFIKOVANÝCH VÍN... 47 4.2 METÓDY... 51 4.2.1 STANOVENIE CUKORNATOSTI MUŠTU... 51 4.2.2 STANOVENIE TITROVATEĽNÝCH KYSELÍN a ph... 51 4.2.3 STANOVENIE ASIMILOVATEĽNÉHO DUSÍKU (YAN)... 51 4.2.4 EBULIOSKOPICKÉ STANOVENIE ALKOHOLU... 52

4.2.5 ANALÝZA VÍNA POMOCOU PRÍSTROJA ALPHA... 52 4.2.6 STANOVENIE CELKOVÝCH ANTOKYANOV... 53 4.2.7 STANOVENIE CELKOVÝCH FENOLOV... 53 4.2.8 STANOVENIE CELKOVÝCH FLAVANOLOV... 53 4.2.9 STANOVENIE ANTIRADIKÁLOVEJ AKTIVITY (METÓDA DPPH)... 54 4.2.10 STANOVENIE REDUKČNEJ SILY (METÓDA FRAP)... 54 4.2.11 HPLC STANOVENIE JEDNOTLIVÝCH FENOL. ZLÚČENÍN... 55 4.3 SENZORICKÉ HODNOTENIE... 56 5 VÝSLEDKY... 57 5.1 ANALÝZA VÍN... 57 5.2 SPEKTROFOTOMETRICKÉ STANOVENIA... 60 5.2.1 Vplyv obsahu fenolových látok na antioxidačnú aktivitu:... 64 5.2.2 Vplyv doby fortifikácie na antioxidačné vlastnosti vín:... 67 5.2.3 Porovnanie jednotlivých odrôd a vplyvu metódy výroby fortifikovaných vín na ich antioxidačné vlastnosti:... 69 5.3 SENZORICKÁ ANALÝZA... 71 6 DISKUSIA... 76 7 ZÁVER... 79 8 SÚHRN... 80 9 RESUMÉ... 81 10 ZOZNAM POUŽITEJ LITERATÚRY... 82 11 PRÍLOHY... 88

ZOZNAM OBRÁZKOV, TABULIEK A GRAFOV Obrázok 1: Systém solera... 16 Obrázok 2: Hydroxybenzoové kyseliny... 24 Obrázok 3: Hydroxyškoricové kyseliny... 25 Obrázok 4: Stilbény... 27 Obrázok 5: Flavonoly... 29 Obrázok 6: Flavanoly (katechíny)... 31 Obrázok 7: Antokyany... 33 Tabuľka 1: Voľné radikály... 37 Tabuľka 2: Analýza muštu použitých odrôd... 48 Tabuľka 3: Štruktúra vzoriek fortifikovaných vín... 50 Tabuľka 4: Hodnoty základnej analýzy vín na prístroji Alpha... 57 Tabuľka 5: Hodnoty profilu hydroxybenzoových a hydroxyškoricových kyselín (v mg.l -1 )... 59 Tabuľka 6: Hodnoty profilu stilbénov a flavonolov (v mg.l -1 )... 59 Tabuľka 7: Hodnoty obsahu celkových fenolových látok, flavanolov a antokyanov... 60 Tabuľka 8: Hodnoty stanovenia antioxidačnej aktivity (DPPH, FRAP)... 63 Tabuľka 9: Korelácia antioxidačnej aktivity (DPPH) a obsahu celkových fenolov... 65 Tabuľka 10: Korelácia antioxidačnej aktivity (FRAP) a obsahu celkových fenolov... 66 Tabuľka 11: Korelácia stanovovaných metód antioxidačnej aktivity... 66 Tabuľka 12: Korelácia doby fortifikácie a metód stanovenia antioxidačnej aktivity... 67 Tabuľka 13: Výsledky senzorického hodnotenia vzoriek fortifikovaných vín... 71 Tabuľka 14: Farebná matica p-hodnôt korelácií senzorických parametrov... 73 Graf 1: Celkové hodnoty obsahu fenolových látok... 60 Graf 2: Celkové hodnoty obsahu flavanolov (katechínov)... 61 Graf 3: Celkové hodnoty obsahu antokyanov... 62 Graf 4: Celkové hodnoty stanovenia antioxidačnej aktivity... 63 Graf 5: Vplyv obsahu celkových fenolov na antioxidačnú aktivitu (metóda DPPH)... 64 Graf 6: Vplyv obsahu celkových fenolov na antioxidačnú aktivitu (metóda FRAP)... 65 Graf 7: Závislosť vplyvu doby fortifikácie na antioxidačnú aktivitu... 67 Graf 8: Celkový vplyv metód fortifikovaných vín na antioxidačnú aktivitu... 68 Graf 9: Vplyv metódy fortifikácie na antioxidačnú aktivitu u odrody 'Modrý Portugal'... 69 Graf 10: Vplyv metódy fortifikácie na antioxidačnú aktivitu u odrody 'Carmenere'... 70 Graf 11: Vplyv metódy fortifikácie na antioxidačnú aktivitu u odrody 'Laurot'... 70 Graf 12: Celkové hodnotenie vzoriek 100-bodovým systémom... 72 Graf 13: Porovnanie vnímania sladkosti a ovocnosti vo vôni a v chuti... 74 Graf 14: Porovnanie vnímania množstva alkoholu vo vôni a v chuti... 75

1 ÚVOD Vo vode môže každý zbadať svoju tvár, no vo víne môže uzrieť srdce druhého (staré francúzske príslovie) Počas dlhej histórie Európy prieskumníci cestovali po svete, obchodovali, dobývali a nosili svoje milované víno s nimi. Čoskoro zistili, že dlhé námorné plavby ich obvyklému stolovému vínu neprospeli. Čomu však cestovanie urobilo dobre, boli vína, ktoré mali vyšší obsah alkoholu a tak sa zrodili fortifikované vína. Fortifikované vína sa začínajú tešiť stále väčšej obľube konzumentov vína v Českej a Slovenskej republike. Vyznačujú sa mnohými pozitívnymi vlastnosťami, sú vyrábané v rozmanitých štýloch a nachádzajú široké uplatnenie v gastronómii. Párovanie s jedlom závisí od typu zvoleného vína, predovšetkým jeho úrovne sladkosti. Fortifikované vína sa podávajú ako aperitívy a slúžia ako výborný doplnok k dezertom. Sladké verzie sú dokonca často podávané aj po jedle namiesto dezertu. Svojimi špecifikami a rôznymi technikami výroby si niektoré fortifikované vína zachovávajú vysoké množstvo obsahu rôznych skupín fenolových látok. Tie sa ako veľmi účinné antioxidanty významnou mierou podieľajú na hodnotení antioxidačných vlastností vín. Antioxidanty sú svojou povahou konzervanty, ktoré zabraňujú oxidácii niektorých zložiek potravín a chránia bunky nášho organizmu pred útokmi voľných radikálov. Výsledky mnohých štúdií a výskumov potvrdili, že antioxidanty môžu predĺžiť život, no nielen jeho dĺžku, ale predovšetkým jeho kvalitu. Neexistuje prameň večnej mladosti, no sú spôsoby ako starnutie spomaliť. Pretože sa začína preukazovať nepriaznivý vplyv syntetických antioxidantov na ľudské zdravie, je dôležité zamerať sa na ich náhradu antioxidantmi prírodnými. Kúzlo prírodných antioxidantov spočíva v ich zdravotnej nezávadnosti a dobrej prijateľnosti. Ťažké je určiť, ktorý antioxidant je najdôležitejší, treba mať na pamäti skutočnosť, že antioxidanty spolupracujú. Reťaz je tak silná ako jej najslabší článok, to isté platí aj o antioxidantoch vo vínach. Diplomová práca na zvolené téma bola vybraná pre vlastný záujem o fortifikované vína, z hľadiska ich metód výroby a analytických vlastností. Verím, že prinesie mnoho užitočných informácií pre všetkých ľudí z rád odborníkov aj laikov, ktorí sa zaoberajú, prípadne budú zaoberať výrobou fortifikovaných vín. 8

2 CIEĽ PRÁCE Cieľom zadanej diplomovej práce zaoberajúcej sa vplyvom fortifikácie v rôznych štádiách macerácie/fermentácie na antioxidačné vlastnosti vín bolo preštudovať literatúru týkajúcu sa fortifikovaných vín, fenolových látok a antioxidačnej aktivity. V praktickej časti boli vybrané tri odlišné modré odrody viniča. V priebehu výroby vína bola v troch časových úsekoch vykonaná fortifikácia vybraným destilátom. Následne boli zmerané základné analytické parametre, so zameraním na spektrofotometrické stanovenie antioxidačnej aktivity. Vína boli senzoricky zhodnotené a získané výsledky štatisticky vyhodnotené. 9

3 LITERÁRNY PREHĽAD 3.1 HISTÓRIA VÝROBY FORTIFIKOVANÝCH VÍN Za zrodom výroby fortifikovaných vín stály nedokonalé podmienky pri lodnej preprave vín do krajín spotreby, najmä do Veľkej Británie, ale tiež Francúzska, Nemecka či Holandska. Vína sa často pri prevoze v drevených sudoch kazili a preto bolo treba ich stabilizovať, napr. prídavkom alkoholu. Zvýšením obsahu alkoholu sa víno zakonzervovalo proti nežiaducemu druhotnému kvaseniu a niektorým vadám vína. Tieto vína teda boli vytvorené v minulosti, v reakcii na technické problémy pri výrobe vína v teplých oblastiach. Hrozná bohaté na cukor a za zvýšenej teploty mali za následok búrlivé kvasenie a víno bolo nestabilné. Následne tvorené mliečne baktérie spôsobovali choroby a produkciu prchavých kyselín. Pridanie alkoholu počas kvasenia bol jednoduchý prostriedok stabilizácie vína a výroby alkoholického a sladkého produktu príjemnej chuti. (RIBÉREAU-GAYON et al., 2006a) Postupom času dochádzalo stále ku skoršiemu doliehovaniu a tak začali vznikať doliehované vína s rôznym obsahom zostatkového cukru. Neskôr v šesťdesiatych rokoch, tieto vína predstavovali významnú časť výroby vín v Kalifornii a Austrálii. Dnes už zotrvali iba najslávnejšie fortifikované vína. Na všetky tieto vína sa vzťahuje ochranná známka a možno ich vyrábať pod týmto označením iba vo vymedzených regiónoch príslušných štátov (JACKSON, 2002). Špecifické prírodné faktory a dobre prispôsobené technológie umožňujú fortifikovaným vínam vývoj ich jemnej vône a bohatej chuti. (RIBÉREAU-GAYON et al., 2006a) 3.2 AKÉ SÚ FORTIFIKOVANÉ VÍNA? Fortifikované, tiež označované ako doliehované, či likérové vína, sa vyznačujú vysokým obsahom cukru a alkoholu, sú to vína, do ktorých je buď pred, počas, alebo po fermentácii pridávaný alkohol. Medzinárodná organizácia pre vinič a víno (OIV) definuje fortifikované vína ako špeciálne vína, majúce celkový obsah alkoholu (potenciálny, aj skutočný) medzi 15-22 % objemových (HORNSEY, 2007). Do tejto kategórie patria všetky vína s prídavkom alkoholu bez ohľadu na rozdiely vo vinifikácii. K fortifikácii sa väčšinou používa vysoko percentný alkohol, zvyčajne neutrálny destilát 10

z vína (vínovica). Pridaním alkoholu do čerstvej hroznovej šťavy, alebo čiastočne skvaseného hroznového muštu sa zastaví kvasenie a tiež následná infekcia octovými baktériami. (LAVILLA, 2010) Fortifikáciu možno uskutočniť v jednom, alebo aj v niekoľkých krokoch. Množstvo pridaného alkoholu, doba a spôsob jeho aplikácie sú spolu s použitou odrodou viniča a oblasťou výroby rovnako dôležité pre charakter fortifikovaného vína. (STÁVEK, 2005) Fortifikované vína môžeme rozdeliť do dvoch hlavných kategórii. Do prvej patria vína, do ktorých sú v priebehu výroby spolu s alkoholom pridávané rôzne aditíva. Používajú sa najmä výťažky z rôznych bylín a korenín, ovocné plody, ale tiež prírodne identické aromatické látky. Spadajú sem všetky vermúty, horké, ovocné a korenené vína. Druhá kategória zahŕňa vína čisto prírodné. K ich výrobe sa používa iba hroznový mušt a fortifikačný alkohol. (STÁVEK, 2005) Na type fortifikovaného vína tiež veľmi závisia skladovacie podmienky pred fľašovaním. Vďaka ich vysokému obsahu alkoholu sú tieto vína viac odolné voči oxidačným procesom. Niektoré skutočne rozvíjajú ich požadované vlastnosti až prostredníctvom určitého stupňa oxidácie. Tieto vína podstupujú hlavne zrenie v sudoch. Iné jemnejšie fortifikované vína sú chránené pred vzduchom a sú fľašované ako staršie. (RIBÉREAU-GAYON et al., 2006a) 3.2.1 POUŽITIE DESTILÁTOV PRI VÝROBE FORTIFIKOVANÝCH VÍN Pri výrobe fortifikovaných vína sa používajú dva druhy destilátov z hrozna. Sú nimi vysoko rektifikovaný alkohol s obsahom etanolu 94-96 % obj., alebo vínovica destilovaná na silu medzi 57-83 % obj. (pozn.: v legislatíve ČR 52-86 % obj.). Vínovica, ktorá je používaná na fortifikáciu portských vín, je často chybne označovaná ako brandy a obsahuje isté množstvo rovnakých zlúčenín, ako napríklad vyššie alkoholy, aldehydy a estery, ktoré doplňujú komplexnosť vína. Na druhej strane fortifikačný alkohol, ktorý sa používa pri výrobe sherry a madeiry, je v podstate vysoko stupňový alkohol. Je opakovane destilovaný z vína, alebo vínu odvodených výrobkov, napríklad výliskov a jedná sa o neutrálny alkohol, ktorý neobsahuje žiadne iné komponenty okrem vody. Po pridaní fortifikačného alkoholu do kvasiaceho muštu je 11

nutné ho s muštom dostatočne premiešať, inak zostane plávať na povrchu a dovolí fermentácii pokračovať. (HORNSEY, 2007) Výpočet množstva potrebného fortifikačného alkoholu je zložitý a závisí od viacerých faktorov: prirodzeného obsahu cukru v mušte, obsahu cukru v dobe fortifikácie, aké množstvo cukru je požadované v konečnom produkte a aký stupeň alkoholu je potrebný. Samotná fortifikácia nie je nevyhnutne veľmi presnou operáciou, pretože po pridaní alkoholu sa hladina cukru zriedi. (HORNSEY, 2007) 3.2.2 METÓDY DOLIEHOVANIA (FORTIFIKÁCIE) VÍN Množstvo pridaného alkoholu úzko súvisí s typom vína aký chceme vyrobiť, rovnako ako čas doliehovania a to, či je doliehovanie vykonané v jednom, alebo vo viacerých krokoch. Každá z metód dodáva pôvodnej surovine jedinečný a typický charakter a každá má vo svete svojho zástupcu. (JACKSON, 2002) Metódy doliehovania: PRED FERMENTÁCIOU (METÓDA MUTAGE): Vína môžu byť doliehované už do čerstvého hroznového muštu ešte pred začatím fermentácie, preto k samotnej fermentácii nikdy nedôjde. Touto cestou sú vyrábané niektoré známe fortifikované vína - mistely, vo Francúzsku nazývané vin de liqueurs (napr. Pineau des Charentes a Ratafia). (HORNSEY, 2007) POČAS FERMENTÁCIE: Metóda zahŕňa pridanie fortifikačného alkoholu v priebehu fermentácie vína. Vysoké zvýšenie hladiny alkoholu zastaví proces kvasenia tým, že kvasinky po jeho pridaní už nedokážu prežiť. Výsledkom je víno s prirodzenou sladkosťou (LA VILLA, 2010). Presná doba doliehovania v priebehu fermentácie závisí na požadovanom množstve obsahu zostatkového cukru. Do portského vína sa alkohol pridáva počas fermentácie, pri dosiahnutí 6 8 % obj. alkoholu. (STÁVEK, 2005) 12

PO FERMENTÁCII: Doliehovanie prebieha prídavkom alkoholu do vína až po ukončení fermentácie. Typickým fortifikovaným vínom vyrobeným touto metódou je španielske sherry. Stupeň fortifikácie tohto vína je menší ako pri portskom, pretože už je fermentáciou prítomné vyššie množstvo prirodzeného alkoholu (HORNSEY, 2007). Sladkosť vína sa upravuje dodatočne prídavkom prírodných sladiacich prostriedkov. (STÁVEK, 2005) 3.2.3 VÝROBA FORTIFIKOVANÝCH VÍN V ZAHRANIČÍ PORTSKÉ: História portského vína začala v polovici 17. storočia vojnou medzi Anglickom a Francúzskom. Ako aj v iných vojnách bolo víno nepostrádateľným nápojom a cenným lodným nákladom. Pretože vína z Porta do Londýna boli prevážané v drevených sudoch a často neboli pred prepravou školené, museli byť upravené tak, aby sa zachovala stabilita vína. Aby sa víno nerozkvasilo, bola do sudov pridaná vínovica (JACKSON, 2008). Nevšedná chuť tohto vína v blízkej dobe zaznamenala veľký ohlas a v Anglicku si víno získalo tak veľkú obľubu, že dopyt po ňom stále stúpal. Vinič, z ktorého strapcov sa portské víno vyrába sa pestuje v údolí rieky Douro a jej prítokov. Vinice sú kvalitatívne odstupňované sériou 12 charakteristík v systéme s názvom cadastro. (LAVILLA, 2010) K výrobe červeného portského vína sa používajú prevažne odrody 'Touriga Francesca', 'Tinta Barroca', 'Tinta Roriz', 'Touriga Nacional', 'Tinto Cao', 'Tinta Amarela' a ďalšie. Z odrôd pestovaných k výrobe bielych portských vín sú používané najmä 'Moscatel', 'Malvasia Fina', 'Codega', 'Malvasia Real', 'Rabigato', 'Gouveio', 'Viosinho' a 'Arinto'. Viničné trate v oblasti majú rozlohu viac ako 250 000 ha. Výroba Portského vyžaduje rýchlu extrakciu farbív a trieslovín. Štandardná fermentácia Portského môže trvať iba dva až tri dni, čo nestačí aby sa maceráciou získala potrebná farba a triesloviny. Tradične bývajú hrozná umiestnené do veľkých, plytkých, žulových nádob zvaných lagares. V nich sú šliapané 8-12 hodinovým procesom nohami, pri ktorom nedochádza k drveniu semien. Inovatívne metódy zahŕňajú použitie vinifikátorov a robotických lagares. (LAVILLA, 2010) 13

Pri technológii výroby sú základom portského vína dve zložky a to víno a vínny destilát (RIBÉREAU-GAYON et al., 2006a). Ide o proces prídavku vínneho destilátu do kvasiaceho muštu. Doba fortifikácie sa odvíja od zostatkového cukru v mušte a nie podľa obsahu alkoholu. Destilát o obsahu alkoholu 77 % sa pridáva vo chvíli, keď je hladina zostatkového cukru v kvasiacom mušte okolo 90 g.l -1 a doliehuje sa na 16-22 % alkoholu. Kvasinky v tak vysokej koncentrácii alkoholu nemôžu fermentovať a tým sa končí premena cukru na etanol. Použitý fortifikačný alkohol nemá celkom neutrálny charakter a má vplyv na zrenie portských vín. V oblasti sa vyrábajú biele aj červené portské vína, ale biele iba ako malá časť produkcie. (CLARKE, BAKKER, 2004) Mladé vína v dobrom zdravotnom stave zotrvajú cez zimu ležať v regióne Douro, čo je veľmi prospešné pre ich sedimentáciu, na jar sú prvý krát stočené z kalov a prevážané do pivníc Vila Nova de Gaia v meste Porto. Za ďalší osud vína už zodpovedajú skúsení enológovia, ktorí určujú najlepšie zmesi pre sceľovanie vín. Vína, ktoré sú určené pre dlhšie zrenia (typ tawny) sú čerpané do malých sudov, v ktorých môžu zotrvať až 40 rokov. (STÁVEK, 2005) Názov portské (Port wine) sa môže legálne používať iba pre fortifikované vína vyrobené na území Portugalska. Portské je teda chránenou známkou a nemôže sa používať v iných krajinách. Oficiálnu klasifikáciu spravuje Instituto dos Vinhos do Douro do Porto (IVDP) a odráža oficiálny súhlas, akým spôsobom a s akými parametrami musí byť víno vyrobené. (MENCARELLI, TONUTTI, 2013) SHERRY: Víno sherry má ešte dávnejšiu históriu ako portské. V roku 1100 pred n. l. založili Féničania mesto Gadir, dnešný Cádíz a priniesli do tohto kraja vinohradníctvo. Ďalším významným mestom bol Xérez/Jerez, ako významné vinárske stredisko, ktoré neskôr obsadili Arabovia. Tí využívali prebytky vína na destiláciu arabským destilačným zariadením zvaným albemic. Vďaka tejto technológii mohlo vzniknúť veľmi podobné sherry, aké je známe dnes. Do vína sa pridával destilát a ďalšie prísady, ktoré zlepšovali jeho chuť a farbu. O spopularizovanie sherry sa postarali až anglickí obchodníci. Efekt bol podobný ako u portského, ľudia v Anglicku si sherry zamilovali, a od tej doby sa Anglicko stalo najväčším odberateľom sherry. (STÁVEK, 2005) 14

Najtypickejšou vlastnosťou sherry je zrenie vína pod kožkou (tzv. flór), ktorú vytvárajú špeciálne kožkotvorné kvasinky na hladine zrejúceho vína. Kvasinky na povrchu vína spotrebúvajú kyslík a bránia tak oxidatívnemu hnednutiu fenolových zlúčenín, na ktoré je víno veľmi citlivé (CLARKE, BAKKER, 2004). Ďalšími významnými kvalitatívnymi faktormi pre vína typu sherry sú biele pôdy s veľmi vysokým obsahom CaCO 3, zvané albariza, vlhké chladné vetry pontete a horúce suché vetry levante. V súčasnosti sa k výrobe sherry používajú už iba 3 odrody viniča, sú nimi 'Palomino' (90 % výsadby), 'Pedro Ximénez' a 'Moscatel'. Po zbere sa hrozná sušia na slamených kruhových rohožiach (systém soleo) a s prispením slnečného svitu sa zbavujú vody a následne lisujú. (ŠVEJCAR, VOLDŘICH, 1991) Získaný mušt s malým obsahom trieslovín sa presúva do sudov, ktoré sa nechajú otvorené, aby malo víno prístup vzduchu. Nasleduje búrlivé kvasenie vďaka divokým kvasinkám, po ktorom víno niekoľko mesiacov pomaly dokváša. Po vykvasení do sucha má výsledné víno okolo 12 % obj. alkoholu (RIBÉREAU-GAYON et al., 2006a). Zo základného vína sú použitím rozdielnych techník zrenia vyrábané tri hlavné typy sherry (Fino, Oloroso a Amontillado). Po analýze vína nasleduje zaradenie do skupín a sudov, ktoré sú označené jednou, dvomi, alebo tromi čiarkami podľa kvality. Tretia skupina (asi 2 % vína) je najčastejšie určená na destiláciu. (CLARKE, BAKKER, 2004) Pre ďalšiu výrobu je nutné víno fortifikovať. Práve prídavok destilátu až po skončení fermentácie je hlavným rozdielom oproti výrobe portských vín. Podľa techniky zrenia rozoznávame tri hlavné typy sherry vín. Fino je ľahké, suché sherry svetlej farby, s výraznou vôňou a jemne trpkou chuťou o obsahu alkoholu 15-15,5 % obj. Druhým je typ oloroso, u ktorého zrenie neprebieha pod flórom, ale za prítomnosti vzdušného kyslíku. Má zlatožltú farbu, plnú, ale hrubšiu chuť s miernym zvyškovým cukrom a vyšší obsah alkoholu na úrovni 16-18 % obj. Tretí typ amontillado zreje pod flórom jeden rok, potom už bez flóru. Amontillado je suché, plné s výrazným buketom, jantárovo žltej farby a obsahom alkoholu 16-18 % obj. (ŠVEJCAR, VOLDŘICH, 1991) Následne sherry zrejú asi 8 mesiacov v dubových sudoch o objemu 600 litrov, ktoré sú zaplnené iba z 5/6, aby bol umožnený rozvoj kožkotvorných kvasiniek, prípadne oxidačného charakteru. Potom dochádza k druhej kontrole kvality, pri ktorej sa 15

vína opäť delia do niekoľkých podkategórií podľa kvality (JACKSON, 2008). Týmto vzniká pyramídový systém sudov nazývaný solera s minimálne tromi radami nad sebou. Princíp solery spočíva v naplnení najvyšších sudov najmladším vínom (añada). Ďalší rok sa z týchto sudov presúva časť vína postupne do nižších rád sudov (criaderas). Sudy v najspodnejšej rade (solera), obsahujú najstaršie víno, pripravené k stáčaniu. Úbytok v sudoch sa okamžite nahradzuje vínom vekovo najbližším, čiže z vyššej vrstvy sudov. Víno takto zreje v sudoch tri až sedem rokov, podľa počtu stupňov v solere (CLARKE, BAKKER, 2004; ŠVEJCAR, VOLDŘICH, 1991). Výsledný produkt nie je ovplyvnený ročníkom a zachováva si prakticky stále rovnaký charakter. Obrázok 1: Systém solera (LaVilla, 2010) MADEIRA: Madeira je svetoznáme portugalské fortifikované víno, pomenované po rovnomennom ostrove. Ostrov Madeira leží v Atlantickom oceáne na západ od Maroka a vďaka svojim jedinečným a priaznivým klimatickým podmienkam je mimoriadne vhodný k pestovaniu viniča. (ŠVEJCAR, VOLDŘICH, 1991) História vinohradníctva na Madeire začala už v r. 1421, keď boli z Grécka dovezené prvé sadenice odrody 'Malvasia'. S fortifikáciou pôvodne fádnych madeirských vín začali až anglickí obchodníci, ktorí už túto techniku poznali z výroby portských vín a tak došlo k ich prvej stabilizácii destilátom. Madeira mala strategickú 16

polohu pre lode plávajúce cez Atlantický oceán do Nového Sveta. Vína, ktoré boli z Madeiry prevážané v tropických teplotách rovníkových oblastí, však cestou do Ameriky nielenže neutrpeli, ale naopak získali na kvalite a svojej dlhej životnosti. V 17. storočí bol princíp aplikovaný aj v ostrovných podmienkach v podobe umiestnenia vína do špeciálnych pecí. Neskôr bol tento spôsob modifikovaný skladovaním mladých vín v oslnených podkrovných skladoch, zvaných lodges. V súčasnosti sú vína zahrievané na stálu teplotu v termovinifikátoroch, zvaných estufas. (STÁVEK, 2005) K výrobe madeiry sa používajú odrody 'Malvasia' ('Malmsey'), 'Sercial', 'Verdelho' a 'Bual'. Z modrých je rozšírená iba odroda 'Tinta Negra Mole'. Vybrané hrozná k výrobe základného vína sa podrvia, nechajú sa kvasiť a skladujú sa oddelene, kvôli zachovaniu ich charakteristický vlastností, až kým nedôjde k ich sceľovaniu. Po vykvasení a až následnom vylisovaní tak mladé vína obsahujú značné množstvo trieslovín. (JACKSON, 2008) Dĺžka fermentácie záleží na požadovanom štýle vína. Veľmi sladké madeiry (Malmsey), sú fortifikované v priebehu kvasenia, aby si zachovali vysoký obsah cukru, madeiry Bual zhruba pri prekvasení polovice cukru. Typy Verdelho a najmä Sercial sú fortifikované na konci fermentácie, alebo až po jej skončení s minimálnym obsahom cukru, respektíve suché (LAVILLA, 2010). Fortifikácia prebieha pridaním neutrálneho vínneho destilátu (95% alkoholu), do obsahu alkoholu 14-18 % obj. V tomto bode je víno nazývané vinho claro a je pripravené na tepelné spracovanie. (JACKSON, 2008) Vinho claro sa premiestňuje do zvláštnych komôr estufas na 4-6 mesiacov, v ktorých je postupne zahrievané na teplotu približne 50 C. Najkvalitnejšie madeiry sú zahrievané 6 mesiacov pri teplote 45-50 C. Po ukončení zahrievania je stále hrubé víno pomaly chladené na okolitú teplotu a premiestnené do pivníc s teplotou 35 C, kde je ponechané ďalšie dva roky. Potom dochádza k ďalšiemu doliehovaniu na požadovanú konečnú hodnotu. Víno sa nazýva generoso a pripravujú sa z neho rôzne typy madeiry, ktorých sladkosť je upravovaná prídavkom sladkého vína, alebo neprekvaseným alkoholizovaným muštom (mistelou). Víno ďalej zreje v rôznych typoch sudov o rôznom objeme až do jeho fľašovania. (STÁVEK, 2005) Názvy typov madeirských vín, ktoré sú rovnaké s názvami odrody, vždy nemusia označovať odrodu viniča použitého pri ich výrobe (JACKSON, 2008). Ak je na však na fľaši uvedený názov, vína musia byť vyrobené aspoň z 85 % uvedenej odrody. (CLARKE, BAKKER, 2004) 17

ĎALŠIE ZNÁME FORTIFIKOVANÉ VÍNA: MALAGA: Malaga je známe likérové víno vyrábané v okolí mesta Malaga v južnom Španielsku na pobreží Stredozemného mora. Jej charakteristickým znakom je rozdielny obsah zostatkového cukru od 20 do 200 g.l -1, typická karamelová chuť a vyššia hladina alkoholu, ktorá sa pohybuje až okolo 23 % obj.. Hlavnou odrodou využívanou k výrobe malagy je 'Pedro Ximénez', prípadne odrody 'Moscatel' a 'Malvasia'. (ŠVEJCAR, VOLDŘICH, 1991) Ak pri zbere nemajú hrozná dostatok cukru, nechávajú sa 2-3 dni zosychať na slnku. Potom sú odstopkované a lisované. Na výrobu najkvalitnejších vín sa používa iba samotok a mušt z prvého lisovania. Hustý mušt sa mierne zasíri, zakvasí čistou kultúrou kvasiniek, nechá sa prekvasiť až na hranicu 200 g.l -1 cukru a pridá sa vínny destilát tak, aby sa prerušilo kvasenie a doliehované víno malo hodnotu presahujúcu 15 % obj. alkoholu. Po 3 až 4 mesiacoch sa víno stočí z kalov a slúži pre výrobu rôznych typov malagy. (STÁVEK, 2005) MARSALA: Marsala je talianske fortifikované víno, pomenované podľa rovnomenného mesta na najzápadnejšom cípe Sicílie. K výrobe marsaly sa používajú dobre vyzreté, alebo až prezreté hrozná odrôd 'Inzolia', 'Catarrotto', 'Grillo' 'Triolo', 'Pignatello' a 'Calabrese'. Pred kvasením sa hrozná vylisujú pod silnejším tlakom, z dôvodu získania vyšších extraktov a oxidovateľných látok. (MENCARELLI, TONUTTI, 2013) Kvasenie je prerušené fortifikáciou tak, aby finálny výrobok mal 16-22 % obj. alkoholu. Do vína sa potom pridáva zahustený hroznový mušt, podľa stupňa sladkosti, ktorý je potrebné docieliť. (ŠVEJCAR, VOLDŘICH, 1991) Marsala je klasifikovaná tromi typmi podľa stupňa sladkosti. Suchá, s obsahom cukru do 40 g.l -1, polosuchá (40-100 g.l -1 ) a sladká s viac ako 100 g.l -1 zostatkového cukru. (MENCARELII, TONUTTI, 2013) MOSCATEL DE SETÚBAL: 18

Výroba fortifikovaného vína Moscatel v regióne Setúbal nachádzajúcom sa na polostrove južne od hlavného mesta Lisabon má dlhú históriu. Od roku 1907 bol región zaregistrovaný na výrobu týchto vín pod názvom Moscatel de Setúbal. Toto fortifikované víno má veľmi krátky čas kvasenia, ktorý končí prídavkom alkoholu, alebo vínneho destilátu do rmutu vyrobeného s najmenej 85% podielom odrody 'Moscatel de Setúbal' (FELICIANO et al., 2008). Na rozdiel od ostatných fortifikovaných vín sa rmut po fortifikácii 77% alkoholom necháva macerovať šesť mesiacov na šupkách. Po skončení macerácie a následnom vylisovaní víno zreje v sudoch z dubového dreva, až do doby jeho fľašovania, v niektorých prípadoch aj desiatky rokov. Sudy s vínom nie sú pri výpare doplňované a tak pri dlhodobom zretí dochádza k silnej oxidácii, ktorá vo vínach spôsobuje značné zmeny farby a aromatických látok. Vína Moscatel de Setúbal sa vyrábajú v rôznych typoch, všetky sú však sladké a najčastejšie sa klasifikujú podľa veku. Obsah alkoholu sa pohybuje okolo 17-20 %, množstvo zostatkového cukru od 150 do 230 g.l -1. Pokiaľ je na fľaši uvedený rok, neznamená ako v prípade portského priemerný vek vína, ale jeho minimálnu dobu zrenia. (STÁVEK, 2005) Pred nafľašovaním je nutné schválenie, ktoré poskytuje Comissão Vitivinícola Regional da Península de Setúbal (CVRPS). (FELICIANO et al., 2008) VIN DE LIQUEUR (VDL): Podobne ako vins doux naturel, vin de liqueur sú sladké doliehované vína, typické pre Francúzsko. Termín vin de liqueur je tiež používaný Európskou úniou k označeniu všetkých vín obohatených alkoholom, vrátane vermútov a vin doux naturel. Rozdiel vin de liqueur oproti vin doux naturels je v ich fortifikácii tesne pred kvasením. VDL sú sladšie, s väčším charakterom dosiahnutým z pridaného destilátu. VDL sa fortifikujú na úroveň alkoholu 16 % - 22 % obj. (www.euvs.org) Mistely sú typy VDL vyrábané najmä vo Francúzsku a doliehované metódou mutage. Pretože v alkohol prekvasí iba malé, alebo vôbec žiadne množstvo hroznového cukru, bývajú mistely veľmi sladké. (STÁVEK, 2005) Vins de liqueur sa vyrábajú v mnohých regionálnych štýloch. Oblasť Champagne tvorí víno Ratafia, región Rhône vyrába Rinquinquin, Languedoc produkuje Cartagéne, vinárska oblasť Jura vyrába Macvin du Jura (fortifikácia 19

destilátom z matolín), v regióne Cognac je to Pineau des Charentes (fortifikácia koňakom) a v Gascogne Floc de Gascogne (fortifikované Armaňakom). 3.2.4 VÝROBA FORTIFIKOVANÝCH VÍN V ČR S výrobou doliehovaných vín sa v Českej republike priemyselne začalo už za rannej existencie Českých vinárskych závodov v prvej polovici dvadsiateho storočia. Vyrábalo sa predovšetkým víno typu madeira, ale tiež niektoré korenené vína. Ako východzia surovina pre tieto vína slúžili dovezené vína z južných krajín, ktoré boli vo svojej dobe pre tento účel najvhodnejšie hlavne z ekonomického hľadiska. Privezené vína sa dosladzovali repným cukrom na 100 g.l -1 a doliehovali na 19 % obj. alkoholu. Na trhu však neboli vína tohto typu príliš žiadané, preto bola ich výroba obmedzená. Tento trend pretrvával až do súčasnosti. Dnes tvoria likérové vína iba nepatrnú časť produkcie vín ČR. V posledných rokoch sa na trhu, vedľa zavedených značiek korenených vín začali objavovať niektoré ušľachtilé likérové vína s originálnym pôvodom, vyrobené šetrnými technológiami. (STÁVEK, 2006) 3.3 PROBLÉMY FORTIFIKOVANĆH VÍN Ako každý typ vína, aj fortifikované napriek vysokému obsahu alkoholu podliehajú mikrobiologickým problémom. Baktérie mliečneho kvasenia (LAB - Lactic Acid Bacteria) sú gram-pozitívne, nesporujúce, fakultatívne anaeróbne a kyselinám tolerantné tyčinky, alebo koky, produkujúce kyselinu mliečnu ako hlavný katabolický konečný produkt z glukózy. (KÖNIG et al., 2009) Druhy rodu Lactobacillus, Oenococcus, Leuconostoc, Pediococcus a Weissella sa prirodzene vyskytujú na strapcoch a extrahujú do hroznového muštu. LAB sa tak bežne vyskytujú vo víne a hrajú dôležitú úlohu pri znižovaní jeho kyslosti a pozitívne prispievajú k vôni a chuti vína (Oenococcus oeni). Môžu byť však tiež zdrojom mnohých nechcených problémov, ktoré znižujú kvalitu a hodnotu vína. (KÁNTOR et al., 2014) Povaha a rozsah týchto znehodnotení závisí od viacerých faktorov, postupu výroby vína a typu baktérií. Baktérie môžu čiastočne metabolizovať zložitejšie zložky 20

vína, ako sú fenolové zlúčeniny, aromatické zlúčeniny, alebo prekurzory aromatických látok. Rody Lactobacillus (napr. L. brevis, L. hilgardii, L. plantarum), Leuconostoc (napr. L. mesenteroides), Streptococcus (S. mucilaginosus) a Pediococcus (napr. P. cerevisiae) môžu produkovať nežiaduce prchavé zlúčeniny, pachuť po pelargóniách, odbúravanie kyseliny vínnej, diacetyl, akroleín a ďalšie. Lactobacillus brevis a L. buchneri môžu metabolizovať glycerol v prítomnosti glukózy, alebo fruktózy, čo vedie k vzniku 3-hydroxy-propionaldehyd (3-HPA), ktorý sa následne redukuje na 1,3- propándiol. 3-HPA je prekurzorom akroleínu. Akroleín väzbou s fenolovými komponentmi spôsobuje horkosť vína. Etanol zvyšuje intenzitu horkej chuti, rovnako ako dobu trvania horkého pocitu. Pri pomalom alkoholovom kvasení, alebo jeho zastavení sú podmienky priaznivé pre bakteriálne rozvoj. LAB kvasia rôzne množstvo cukrov, ktoré nie je úplne fermentované kvasinkami a produkujú kyselinu octovú a kyselinu D-mliečnu. Táto zmena sa nazýva laktátová choroba a je charakterizovaná vysokým obsahom prchavých kyselín znehodnocujúcich víno. K tomuto znehodnoteniu dochádza tiež vo fortifikovaných vínach. (MORENO-ARRIBAS, POLO, 2009) Hlavne vína z teplejších vinárskych regiónov (Južná Afrika, Kalifornia a Austrálie) majú nižšiu kyslosť a ďalšie zvýšenie ph by mohlo viesť k fádnym vínam s nežiaducimi organoleptickými vlastnosťami a následnému rastu baktérií, ako sú Pediococcus a Lactobacillus spp. (L. fructivorans, L. hilgardii, L. brevis, L. plantarum a L. buchneri), ktoré môžu tolerovať množstvo etanolu viac aj ako 20 % obj. a preto sú schopné prežiť v podmienkach fortifikovaných vín, v závislosti na ich spôsobe výroby. Fortifikované vína zväčša obsahujú vysokú úroveň neskvasených cukrov, čím sú náchylné k znehodnoteniu alkoholu tolerantnými mliečnymi baktériami. Vysoké úrovne cukrov, ktoré zostávajú v týchto vínach sa tak môžu stať zdrojom energie pre mikrobiálne rast baktérií. (STRATIOTIS, DICKS, 2002) Udržiavanie primeranej koncentrácie SO 2, nízkeho ph a hygienických podmienok pri spracovaní môže zabrániť kazeniu fortifikovaných vín. 21

3.4 ŠTÚDIUM FENOLOVÝCH LÁTOK Fenolové látky sú v prírode bežne sa vyskytujúce zlúčeniny. Sú súčasťou takmer všetkých potravín, v ktorých sa uplatňujú ako chuťové a vonné látky, alebo ako prírodné farbivá. Fenolové látky vykazujú antioxidačné vlastnosti, majú vitamínové a baktericídne účinky a môžu ovplyvňovať imunitný systém živých organizmov. Majú veľký význam pri výrobe vína, ako aj priame a nepriame dopady na jeho výslednú kvalitu (CARRASCOSA et al., 2011). Pochádzajú z rôznych častí hrozna, z ktorých sú extrahované pri výrobe vína. Najpodstatnejší vplyv majú na charakteristiku a vlastnosti červených vín, no napriek oveľa nižším koncentráciám sú rovnako dôležitými aj vo vínach bielych. (JACKSON, 2008) Spoločným znakom je prítomnosť aspoň jedného aromatického kruhu (benzén), na ktorý sú priamo napojené jedna, alebo viac hydroxylových skupín. Na fenolovej konštrukcii je založená celá skupina. Fenoly sú v mnohých ohľadoch alifatickými štruktúrami podobné na alkoholy, kde je hydroxylová skupina pripojená k reťazcu atómov uhlíka. Fenolové hydroxylové skupiny sú však ovplyvnené prítomnosťou aromatického kruhu. Polyfenoly sú látky, ktoré majú viac ako jednu fenolovú hydroxylovú skupinu pripojenú k jednému, alebo viacerým benzénovým kruhom, sú stabilnejšie ako jednoduché fenolové kyseliny. Fenolové zlúčeniny sú charakteristikou rastlín a ako skupina sa zvyčajne nachádzajú vo forme esterov, alebo glykozidov a nie ako voľné zlúčeniny. (VERMERRIS, NICHOLSON, 2006) Hladina fenolových látok v bobuli je spojená najmä s odrodou, ale môže byť tiež ovplyvnená premenou životného prostredia, technikami pestovania a stavu vyzretia hrozna. U rôznych odrôd Vitis vinifera L. majú rozdiely fenolov v šťave najmä kvantitatívny charakter. Fenolové látky hrajú významnú úlohu vo vinárstve. Sú zodpovedné za rozdiely medzi bielymi a červenými vínami, najmä vo farbe a chuti červených vín a majú významné antioxidačné vlastnosti. Ich štruktúra sa tiež veľmi odlišuje podľa nádoby kde víno zreje a v závislosti na podmienkach zrenia. (RIBÉREAU-GAYON et al., 2006b) V alkoholických nápojoch je obsah fenolových látok rozdielny. Vo vyšších množstvách sa nachádzajú v špeciálnych pivách, liehovinách zrejúcich v dubových sudoch a najmä v špeciálnych vínach, ako napríklad Sherry. V strapcoch viniča a vo víne sa vyskytujú dve hlavné triedy fenolových látok. Sú nimi neflavonoidy a flavonoidy. (STRATIL et al., 2008) 22

3.4.1 NEFLAVONOIDY Neflavonodiné zložky vo víne sú štruktúrne jednoduchšie látky a rozdeľujú sa na hydroxybenzoové kyseliny, hydroxyskořicové kyseliny, prchavé fenoly, stilbény a iné zlúčeniny (napr. lignany a kumaríny). Aj keď nie sú farebné o neflavonoidných zložkách je známe, že zvyšujú a stabilizujú farbu červených vín intramolekulárnymi a medzimolekulárnymi reakciami. (MORENO-ARRIBAS, POLO, 2009) Do muštu sa ľahko extrahujú z buniek vakuol už pri mletí strapcov. Zvýšené hodnoty derivátov hydroxybenzoovej kyseliny sa často vyskytujú vo vínach zrejúcich v dubových sudoch (JACKSON, 2002). Fenolové kyseliny sa nachádzajú v hrozne predovšetkým esterifikované s kyselinou vinnou v hroznovom mušte a víne a môžu byť uvoľnené ako voľné kyseliny pôsobením esteráz. (CARRASCOSA et al., 2011) Koncentrácie fenolových kyselín a ich derivátov sú 100-200 mg.l -1 u červeného vína a 10-20 mg.l -1 u bieleho vína. Identifikovaných bolo sedem benzoových kyselín. Dve z nich sú prítomné iba v stopových množstvách: kyselina salicylová (ortohydroxybenzoová) a kyselina gentisínová (2,5-dihydroxybenzoová kyselina). Rôzne kyseliny sa líšia substitúciou ich benzénového jadra. (RIBÉREAU-GAYON et al., 2006b) Vo víne a hrozne je prítomných niekoľko škoricových kyselín. Vo voľnej forme sa nachádzajú v malom množstve, prevážne sú esterifikované a to najmä s kyselinou vínnou. Môžu tiež tvoriť jednoduché glykozidy glukózy. (CLARKE, BAKKER, 2004) Estery s kyselinou vínnou sú vysoko oxidujúce zložky hroznovej šťavy a zodpovedajú za zhnednutie bielych muštov. Z hľadiska organoleptických vlastností nemajú fenolové kyseliny zvláštnu chuť, alebo zápach. Sú však prekurzormi prchavých fenolov vytváraných pôsobením mikroorganizmov. Ďalšou skupinou zložitejších zlúčenín prítomných v hrozne, víne a dubovom dreve sú stilbény. Stilbény tvoria dva benzénové cykly. Najznámejším stilbénom je resveratrol, považovaný za obrannú látku viniča v reakcii na plesňové infekcie. Resveratrol je významnou zlúčeninou s pozitívnymi zdravotnými vlastnosťami, nachádza sa v šupkách hrozna a je extrahovaný predovšetkým pri fermentácii červeného vína. (RIBÉREAU-GAYON et al., 2006b) 23

3.4.1.1 DERIVÁTY KYSELINY BENZOOVEJ (Kyselina galová, syringová, vanilová, 4-hydroxybenzoová, protokatechová) Sú najjednoduchšími fenolovými látkami vína. Nachádzajú sa v šupkách a semenách bobúľ a to hlavne vo forme glykozidov a esterov. Nemajú príliš vysokú antioxidačnú aktivitu. Vo významnejšom množstve sa vo víne vyskytuje najmä kyselina galová, ostatné hydroxybenzoové kyseliny sa vyskytujú v nižších koncentráciách. (MIKEŠ, 2004) Hydroxybenzoové kyseliny sú odvodené od kyseliny benzoovej a vyznačujú sa prítomnosťou karboxylovej skupiny substituovanej na fenol. (VERMERRIS, NICHOLSON, 2006) Medzi najčastejšie deriváty nájdené vo víne patria kyselina galová, p- hydroxybenzoová kyselina, protokatechová kyselina, syringová kyselina, vanilová kyselina a v stopových množstvách kyselina gentisínová a salicilová. Kyselina galová má z hydroxybenzoových kyselín najvyššiu koncentráciu vo víne. Nielen, že pochádza z hrozna samotného, ale tiež je tvorená hydrolýzou tanínov. V porovnaní s bielymi vínami, podstatne viac kyseliny galovej obsahujú vína červené, pretože vzniká rozpadom antokyanov. Hladiny hydroxybenzoových kyselín vo víne ukazujú veľkú variabilitu v závislosti na odrode viniča a rastových podmienkach. V porovnaní so skupinou hydroxyškoricových kyselín, ich celková koncentrácia vo víne je relatívne nízka. (MORENO-ARRIBAS, POLO, 2009) Obrázok 2: Hydroxybenzoové kyseliny 24

3.4.1.2 DERIVÁTY KYSELINY ŠKORICOVEJ (Kyselina p-kumarová, kávová, ferulová, kaftarová, koutarová, fertarová, sinapová) Hydroxyškoricové kyseliny predstavujú hlavné fenolové látky bieleho vína. Vyskytujú sa predovšetkým v dužine bobúľ viniča a vždy prechádzajú do muštu. Vo víne sú hydroxyškoricové kyseliny prítomné v malom množstve vo svojej voľnej forme, zatiaľ čo prevládajú depsidové formy (vnútorné estery s kyselinou vinnou), medzi ktoré patrí kyselina kaftarová, koutarová a fertarová. Medzi hydroxyškoricovými kyselinami je najvýznamnejšia kyselina kaftarová, ktorá prevláda až do 50 % celkových hydroxyškoricových kyselín. (MORRENO-ARRIBAS, POLO, 2009; FRAGA, 2010) Väčšina hydroxyškoricových kyselín je vo víne esterifikovaná kyselinou vinnou. Prítomnosťou konjugovanej dvojnej väzby vykazujú vysokú antioxidačnú aktivitu. Predovšetkým u bielych muštov a vín môžu byť príčinou ich hnednutia. (CLARKE, BAKER, 2004) Úroveň koncentrácie derivátov hydroxyškoricových kyselín vo víne závisí na mnohých faktoroch, ako sú odroda, pestovateľské podmienky a klimatické podmienky, nie na spôsobe spracovania hrozna. Kým v muštoch a mladých vínach je obsah voľných hydroxyskořicových kyselín veľmi nízky, k nárastu dochádza počas skladovania. Vínne estery sú podrobované hydrolýze a vedú k voľným formám hydroxyškoricových kyselín. S podielom okolo 73 % celkových fenolových látok sú hydroxyškoricové kyseliny najvýznamnejšou skupinou fenolových látok v bielych vínach. (MORENO- ARRIBAS, POLO, 2009) Obrázok 3: Hydroxyškoricové kyseliny 25

3.4.1.3 STILBÉNY (resveratrol, piceid, piceatannol, pterostilbén, ε-viniferín) Stilbény sú neflavonoidné zlúčeniny patriace medzi fytoalexíny (rastlina si ich sama tvorí na ochranu proti mikroorganizmom). Ich syntéza a akumulácia v rôznych častiach rastliny okrem toho, že súvisí s odrodami, je spôsobená biologickými a chemickými elicitormi (zlúčeninami, ktorá sú schopné stimulovať biosyntézu inej zlúčeniny vo vnútri bunečného organizmu). Stilbény majú dva benzénové cykly obvykle spojené etánovým, alebo prípadne etylénovým reťazcom (RIBÉREAU- GAYON et al., 2006b). Prítomné sú v hrozne hlavne ako glykozidy. Tvoria sa zväčša v šupke bobule, ale možno ich nájsť aj ako zložky drevnatých častí viniča, v dužine takmer chýbajú. (SANDLER, PINDER, 2003) Stilbény môže biosyntetizovať vinič ako obrannú reakciu na stres, ako sú mikrobiálne infekcie a UV žiarenie a do vína sa dostávajú v priebehu výroby. Jedným z najdôležitejších a rozsiahlo študovaným stilbénom je trans-resveratrol (trans-3,5,4- trihydroxystilbén). (MORENO-ARRIBAS, POLO, 2009) Pravdepodobne primárna fyziologická úloha resveratrolu, ktorú zohráva vo viniči je jeho antifungálna aktivita. Resveratrol je prvý stilbén produkovaný v tkanivách viniča. Rýchlosť, s akou vinič dokáže zhromažďovať fungitoxické látky je dôležitá v určovaní úspechu, alebo neúspechu pokusu o infekciu. Resveratrol vzniká pôsobením stilbénovej syntázy. Reakciami resveratrolu sú tvorené ďalšie stilbény: glykozyláciou (piceid), metyláciou (piceatannol, pterostilbén) a polymerizáciou (viniferíny) (SANDLER, PINDER, 2003). Viniferíy sú stabilnejšie ako resveratrol, vznikajú oxidačnou polymerizáciou resveratrolu cez aktivitu peroxidázy. (MORENO-ARRIBAS, POLO, 2009) Syntéza stilbénov prebieha v cytoplazme buniek, zlúčeniny sa hromadia vo vakuole bunky. Pretože sa medzi bunkami nepohybujú, musia byť tvorené tam, kde sú potrebné. Vysoký potenciál pre produkciu resveratrolu majú červené aj biele odrody, avšak tým, že sa stilbény vyskytujú najmä v šupke bobule, iba vína vyrobené v kontakte so šupkami obsahujú vysoké hladiny resveratrolu. (SANDLER, PINDER, 2003) Voľné resveratroly sú prítomné v koncentráciách v rozmedzí 0,2 13 mg.l -1 u červených vín a 0,1 0,8 mg.l -1 u bielych vín. Vína z oblastí s viac vlhkým, na choroby náchylným vegetačným obdobím majú tendenciu mať vyšší obsah resveratrolu než vína 26

z oblastí s podnebím teplejším a suchším. Vďaka svojej antioxidačnej, antikarcinogénnej a antimutagénnej schopnosti, sú stilbény považované za zohrávanie kľúčovej úlohy v ľudskej strave. (MORENO-ARRIBAS, POLO, 2009) Resveratrol inhibuje apoptózu buniek, čím chráni pred rôznymi chorobami. Existuje v dvoch konštrukčných izomerických formách (cis- a trans-). Známejšie a viac preskúmané sú trans- izoformy. (FRAGA, 2010) Ešte účinnejšou látkou príbuznou resveratrolu je trans-piceatannol, ktorý však býva vo víne zastúpený iba v malom množstve. (SANDLER, PINDER, 2003) Obrázok 4: Stilbény 3.4.2 FLAVONOIDY Predstavujú veľkú a významnú skupinu fenolových látok, prispievajúcu k farbe, chuti a celkovej plnosti vína. Ich základnú štruktúru tvoria dve molekuly fenolu spojené molekulou pyranu. Z flavonoidov sa najbežnejšie vo víne vyskytujú flavonoly, flavanoly (katechíny), pri červených vínach tiež antokyany. V bielych vínach tvoria flavonoidy menej než 20 % celkového obsahu polyfenolov, vo vínach červených často až viac ako 85 % ich obsahu (>1g.l -1 ). (JACKSON, 2008) Zloženie flavonoidov vo víne závisí nielen na zložení hrozna, ale aj na procese výroby, ktorý určuje extrakciu flavonoidov do muštu a ich následných reakcií v priebehu dozrievania vína. (MORENO-ARRIBAS, POLO, 2009) Vzhľadom k tomu, že flavonoidy sú lokalizované takmer výhradne v pevných častiach strapca (predovšetkým v šupke a semenách), ich prenos do muštu a vína je primárne určený rozsahom macerácie v procese výroby vína (JACKSON, 2002). Extrakcia začne po pomletí hrozna a pokračuje až kým sa víno oddelí od pevného zvyšku (lisovanie). Ďalej je závislá na rozpustnosti zlúčenín a ich lokalizácii v bobuli a 27

iných faktoroch, vrátane koncentrácie alkoholu a oxidu siričitého, oxidu uhličitého a teploty. Biele mušty a vína obsahujú veľmi nízke množstvo flavonoidov. Už po 4 hodinách pri kontakte so šupkami sa koncentrácia monomérov a dimérov katechínov v mušte zvýši trojnásobne. Zmeny v zložení flavonoidov zahŕňajú enzymatické a chemické procesy. Tieto procesy sú založené na reaktivite samotnej fenolovej hydroxylovej skupiny a na rezonancii medzi voľným elektrónovým párom na fenolovom kyslíku a benzénovom kruhu a môžu byť modulované aj prítomnosťou viacerých substituentov. (ANDERSEN, MARKHAM, 2006) V rastlinnej ríši majú rozličné druhy rastlín charakteristické vzory flavonoidov a ich konjugátov. Všetky tieto látky majú dôležité biochemické a fyziologické úlohy v rôznych typoch buniek a orgánoch, v ktorých sa hromadia. Rôzne triedy flavonoidov a ich konjugáty majú početné funkcie v priebehu interakcie rastlín so životným prostredím v biotických a abiotických stresových podmienkach (GROTEWOLD, 2006). Flavonoidy sú dôležitou súčasťou hrozna, nevyhnutnou pre kvalitu vína. Sú zodpovedné za farbu a trpkosť červených vín, rovnako za žltý odtieň oxidovaných bielych vín. Majú nutričné a farmakologické vlastnosti a pri miernej konzumácii vína hrajú úlohu v priaznivých zdravotných účinkoch. (ANDERSEN, MARKHAM, 2006) 3.4.2.1 FLAVONOLY (kvercetín, myricetín, kaemferol, rutín, isorhamnetin) Hlavným flavonolom v hrozne je kvercetín, ďalšími významnými sú myricetín, kaempferol a isorhamnetin. Ide o viac či menej intenzívne žlté pigmenty, menej intenzívne ako antokyany. Flavonoly sú svojou štruktúrou odvodené od flavónov, vyznačujú sa dvoma benzénovými jadrami spojenými kyslíkatou heterocyklickou zlúčeninou. V hrozne sú prítomné vo forme glykozidov. (RIBÉREAU-GAYON et al., 2006b) Flavonoly vznikajú a nachádzajú sa v šupke hrozna, v dužine a semenách prakticky nie sú prítomné. Flavonoly majú niekoľko efektov na víno. Jedným z nich je ich príspevok k horkosti, prah detekcie týchto zlúčenín často prekročujú červené vína. Na druhej strane sa ako skupina flavonoidov môžu zúčastniť kopigmentácie (interakcie 28

s prokyanidinmi napr. katechínmi so vznikom farebného komplexu). (SANDLER, PINDER, 2003) Flavonoly hrajú ochrannú úlohu pred radiačným poškodením slnkom, silne absorbujú UV-B a UV-C žiarenie. Vzhľadom k existencii silnej korelácie medzi expozíciou hrozna a tvorbou flavonolov v šupke bobule, rovnako ako antokyany, majú tendenciu tvoriť sa v exokarpe bobule. Zvýšená expozície strapcov vedie k ich zvýšenej produkcii. Preto menšie a voľnejšie strapce so šupkami viac vystavenými slnku majú vyšší potenciál obsahu kvercetínu ako veľké, tesné strapce s väčším podielom vnútorných bobúľ. (SANDLER, PINDER, 2003) Variabilita vyššieho obsahu flavonolov v strapcoch tiež závisí na vývojovom štádiu, genetických a environmentálnych faktoroch. K biosyntéze flavonolov dochádza v období kvitnutia a opäť najmä počas zrenia. Každá odroda má špecifické profily flavonolov, ktoré môžu byť použité pre ich taxonomickú charakterizáciu. (MORENO- ARRIBAS, POLO, 2009) Flavonoly tvoria relatívne malú časť z celkového obsahu flavonoidov červeného vína v koncentráciách 20-50 mg.l -1. Flavonoly majú silné antioxidačné účinky, sú hydrofóbne a organizmus ich lepšie prijíma rozpustené v alkohole ako v pôvodnej forme. (SANDLER, PINDER, 2003) Obrázok 5: Flavonoly 29

3.4.2.2 FLAVANOLY (KATECHÍNY, FLAVAN-3-OLY) (katechín, epikatechín, epikatechín-galát, galokatechín, epigalokatechín) Flavanoly sú prítomné v rôznych častiach viniča, vrátane dreva, listov, stoniek a bobúľ. V bobuliach sú najviac zastúpené v semenách, menej v šupke a majú silné antioxidačné účinky. Z tohto dôvodu sa množstvo prítomné vo víne môže výrazne líšiť v závislosti prítomnosti semien v priebehu vinifikácie. Šupkové flavanoly sú syntetizované predovšetkým v priebehu niekoľkých týždňov po odkvitnutí. V semenách je akumulácia flavanolov trochu oneskorená v porovnaní so šupkou a maximálnej koncentrácie dosiahne niekoľko týždňov po dozrievaní. Zloženie flavanolov je tiež výrazne ovplyvnené genetikou a stavom rastu. (MORENO-ARRIBAS, POLO, 2009) Flavanoly sú tvorené dvoma benzénovými cyklami viazanými nasýteným kyslíkovým heterocyklom, čím sú veľmi náchylné na oxidáciu (RIBÉREAU-GAYON et al., 2006b). Pretože sú vysoko reaktívne, molekuly flavanolov kondenzujú vzájomne (VERMERRIS, NICHOLSON, 2006). Hroznové flavanoly, sú hydroxylované v troch polohách a vyskytujú sa ako monoméry, ale tiež ako oligoméry a polyméry. Hlavné monomérov flavanolov v strapcoch sú (+)-katechín, jeho izomér (-)-epikatechín a (-)- epikatechin-3-galát, na ktorých sú založené semenné proantokyanidíny (oligomérne a polymérne jednotky katechínov). Hlavné jednotky šupkových proantokyanidínov sú epikatechín a epigalokatechín. (ANDERSEN, MARKHAM, 2006) Flavanoly prispievajú ku kopigmentácii a polymerizácii. Ich polymerizáciou sa tvoria taníny, majúce vplyv na horkosť, trpkosť a farbu vína, ako hlavných aspektov kvality najmä červených vín. Tieto faktory tiež vplývajú na antioxidačnú kapacitu zlúčenín. Monoméry majú vyššiu antioxidačnú kapacitu ako polyméry, glykozylácie molekúl antioxidačnú kapacitu znižujú. Odroda viniča má rovnako vplyv na obsah flavanolov a to najmä v semenách. Obsah flavanolov v šupkách klesá so zvyšujúcou sa expozíciou, ale vzhľadom k tomu, že väčšina flavanolov sa nachádza v semenách bobule, stav expozície strapca má menší vplyv na ich obsah. Priemerný obsah flavanolov vo víne sa pohybuje v rozmedzí 150-250 mg.l -1 (vyšší obsah v 'Pinot Noir'), biele vína, z dôvodu kratšieho kontaktu so šupkami počas fermentácie majú oveľa nižšiu hladinu, okolo 40 mg.l -1. (SANDLER, PINDER, 2003) 30

Obrázok 6: Flavanoly (katechíny) 3.4.2.3 ANTOKYANY (malvidin, cyanidin, delphinidin, peonidin, petunidin) Antokyany sú vo vode rozpustné rastlinné pigmenty zodpovedné za rozmanitú škálu červenej, modrej a fialovej farby. Významné sú pre modré odrody viniča, v bielych odrodách, až na niektoré výnimky absentujú. Nachádzajú sa hlavne v šupkách bobúľ vo vakuolách buniek, alebo tiež u tzv. farbiarok v ich dužine. Vo veľkom množstve sú aj v listoch a to predovšetkým na konci vegetačného obdobia (KENNEDY et al., 2006). Tienením listového mezofylu bunky sa podieľajú na ochrane rastlín pred nadmerným svetlom a majú dôležitú úlohu pre opeľovanie hmyzom. (FRAGA, 2010) Antokyany spôsobujú väčšiu absorpciu slnečného žiarenia, ohrievaním bobule sa zvyšuje aktivita enzýmov, čím sa mení zloženie kyselín a cukrov v bobuli. Sú tvorené v záverečnej fáze vývoja bobule pri dozrievaní. Ich produkcia je najviac spojená s expozíciou strapcov na svetle a najvyššiu hodnotu má v čase zberu, pri prezrievaní ich obsah klesá. Zo šupiek bobúľ sa uvoľňujú v priebehu vinifikácie, pôsobením tepla a účinkom etanolu. (SANDLER, PINDER, 2003) Chemická štruktúra antokyanov zahŕňa dve benzénové jadrá spojené nenasýteným katiónovým kyslíkovým heterocyklom. Odrody viniča majú rovnaké základné štruktúry antokyanov, ale existuje niekoľko malých odchýlok v zložení. Dominantným antokyanom je malvidin, v rôznych odrodách od 90 až tesne pod 50 % obsahu, ďalšími sú delfinidin, peonidin, cyanidin a petunidin. (RIBÉREAU-GAYON et al., 2006b) 31

Antokyany sú oveľa stabilnejšie v glykozidickej, ako aglykónovej forme (antokyanidíny). Bežne pripojeným cukrom (β-glykosidickou väzbou) na pozíciu 3 uhlíka je glukóza, tvoriaca formu glykozidu (SANDLER, PINDER, 2003). Prevládajúcim pigmentom modrých hroznov Vitis vinifera L. je malvidin-3- monoglukozid. Výskyt monoglukozidických antokyanov a ich acylovaných foriem je typický pre modré hrozná väčšiny odrôd Vitis vinifera L. Prítomnosť diglukozidických antokyanov vo väčšom množstve je špecifická pre iné druhy rody Vitis (V. labrusca, V. riparia, V. rupestris, V. rotundifolia). Identifikácia monoglukozidov antokyanov tak slúži k detekcii vín z vinifera. Medzidruhovým krížením sortimentu interšpecifických odrôd však môžu v niektorých odrodách diglukozidické antokyany chýbať. (BALÍK, 2010) Ku zmenám farby vína dochádza prostredníctvom citlivosti antokyanov na zmeny ph a odfarbení siričitanmi, polymerizáciou a kopigmentáciou. Kopigmentácia je spájanie pigmentových molekúl s inými, pôvodne nefarebnými molekulami (napr. flavanoly, flavonoly). Jav kopigmentácie vyvoláva skorej fialové odtiene. Hodnota ph prostredia má výrazný vplyv na farbu antokyanových farbív. Roztoky pod ph 3 dosahujú najintenzívnejšiu červenú farbu. Pri zvyšovaní ph roztoku sa ich červené zafarbenie stráca (ph 4-5). Ďalšie zvyšovanie ph vedie k fialovému až modrému zafarbeniu. (BALÍK, 2010) Aj v rozmedzí ph vín 3-4 môžu byť radikálne zmeny vo farbe v dôsledku ionizačného stavu molekúl. (SANDLER, PINDER, 2003) Napriek veľkému vizuálnemu vplyvu tvoria antokyany u červených vín asi len 12 % z celkového obsahu flavonoidov. Mladé červené vína obsahujú 150-800 mg.l -1, rosé vína 5-50 mg.l -1 antokyanov (SANDLER, PINDER, 2003). Monomérne antokyany pôvodne zodpovedné za farbu mladých červených vín, sú veľmi nestabilné a reaktívne. Ich koncentrácia rýchlo klesá a v priebehu zrenia červených vín sa zapojujú do tvorby oveľa stabilnejších oligomérnych a polymérnych štruktúr. Tieto nové štruktúry sú zodpovedné za farbu starších červených vín, sú menej citlivé na zmenu ph a odolnejšie proti odfarbeniu oxidom siričitým. (BALÍK, 2010) Antokyany spolu s ostatnými polyfenolmi sú významné doplnky výživy najmä vzhľadom na ich antioxidačné účinky. Znižujú riziko kardiovaskulárnych chorôb, Alzheimerovej choroby, inhibujú vírusy, majú vplyv na apoptózu nádorových buniek a chránia v prevencii rôznych ochorení súvisiacich s oxidačným stresom. (ANDERSEN, MARKHAM, 2006) 32

Obrázok 7: Antokyany 3.4.2.4 TANÍNY (TRIESLOVINY) Taníny sú skupinou zlúčenín so širokou rozmanitosťou štruktúr, ktorá zdieľa ich schopnosť viazať a zrážať bielkoviny. Na rozdiel od antokyanov a flavonolov taníny nemajú glykozylované formy, no produkujú stabilné komplexy s proteínmi a polysacharidmi (RIBÉREAU-GAYON et al., 2006b). Sú to pomerne objemné fenolové molekuly, vzniknuté polymerizáciou z elementárnych molekúl. Stupeň polymerizácie ovplyvňuje schopnosť zrážania proteínov (VERMERRIS, NICHOLSON, 2006). Triesloviny s proteínmi interagujú prostredníctvom vodíkových väzieb a hydrofóbnych účinkov. Na interakcie má dôležitý vplyv ph. (MORENO-ARRIBAS, POLO, 2009) V závislosti na ich chemickej štruktúre môžu byť rozdelené do troch skupín: hydrolyzované, kondenzované taníny a komplexné taníny. Hydrolyzovateľné taníny zahŕňajú galotaníny a elagotaníny, ktoré po hydrolýze uvoľňujú kyselinu galovú a elagovú (HORNSEY, 2007). Nie sú zvyčajne syntetizované z hrozna, do vína prechádzajú v priebehu zrenia v sudoch z dubu. Hydrolyzovateľné taníny sú zložené z polyolov spojených s aspoň jednou molekulou kyseliny galovej (galotaníny), alebo kyseliny elagovej (elagotaníny) (MORENO-ARRIBAS, POLO, 2009). Rôzne molekuly sú rozpustné vo vode a rýchlo sa rozpúšťajú zriedené v alkohole. Hrajú významnú úlohu pri starnutí vína v dubových sudoch, z dôvodu ich oxidovateľnosti. Kyselina elagová vo víne pochádza buď z drevených sudov, alebo z pridania enologických tanínov, kyselina galová zo šupiek a semien je prítomná vo víne vždy. (RIBÉREAU-GAYON et al., 2006b) 33

Kondenzované taníny (prokyanidíny) sú oligomérne až polymérne flavonoidy pozostávajúce z 2-10 molekúl flavanolov (katechínov). Ich základné štruktúrne jednotky tvoria (+)-katechín a (-)-epikatechín. Polyméry sú tvorené pôsobením kyselín, alebo enzýmov. Príkladom kondenzované tanínu je prokyanidín B2 (Epikatechín- (4β 8')-epikatechín) (VERMERRIS, NICHOLSON, 2006). Kondenzované taníny sú hojné v rôznych častiach hrozna (semená, šupky a stopky) a sú extrahované do vína v priebehu výroby. Ich stupeň polymerizácie sa postupne mení v priebehu starnutia v dôsledku chemických transformácií. (MORENO-ARRIBAS, POLO, 2009) Komplexné alebo zmiešané taníny nachádzajúce sa v rastlinách sa skladajú z kovalentných komplexov medzi elagotanínmi a flavanolmi (RIBÉREAU-GAYON et al., 2006b). Jednotka katechín je v nich viazaná glykozidicky buď k jednotke galotanínu, alebo elagotanínu. Komplexné taníny sa tvoria v procese starnutia červeného vína. Intenzita trpkosti je vyššia v mladom víne a zrením sa znižuje. (VERMERRIS, NICHOLSON, 2006) Koncentrácia kondenzovaných tanínov v červenom víne sa líši v závislosti na odrode hrozna a ešte väčšou mierou, metódou výroby vína. Hodnoty sa pohybujú medzi 1-4 g.l -1. V suchom bielom víne, koncentráciu určuje kvalita sedimentácie. Pohybuje sa v rozmedzí od 100 mg.l -1 v prípade ak mušt náležite usadzuje, do 200-300 mg.l -1, ak prebieha kvasenie v prítomnosti kalov. Sladké biele vína vyrobené z botrytických strapcov majú veľmi nízky obsah tanínu, pretože sú kompletne degradované hubou (RIBÉREAU-GAYON et al., 2006b). Triesloviny sú príčinou trpkej, zvieravej (adstringentnej) chuti. Ako súčasť prírodnej medicíny majú použitie ako protizápalové a antiseptické látky. (VERMERRIS, NICHOLSON, 2006) 3.4.3 SENZORICKÉ VLASTNOSTI FENOLOVÝCH LÁTOK Vzhľadom na rozdiely v štruktúre a vlastnostiach jednotlivých fenolových látok, sa významne odlišujú aj ich senzorické vlastnosti. Vnímanie chuti fenolových látok závisí najmä od stupňa ich polymerizácie. Nízkomolekulárne fenolové látky vykazujú horké chuťové tóny, kým látky s vyšším stupňom polymerizácie (vysokomolekulárne) prispievajú k organoleptickým vlastnostiam trieslovitou chuťou. (KENNEDY et al., 2006) 34

Horkosť sa zvyšuje so stúpajúcou koncentráciou monomérnych flavanolov, s chuťovým vnemom najviac patrným v zadnej časti jazyka. Trieslovitosť (adstringencia) je vysušujúci, sťahujúci, drsný pocit v ústach, ktorý vzniká vzájomným pôsobením tanínov s proteínmi slín v ústnej dutine. (JACKSON, 2002) Celkový organoleptický dojem je založený na harmonickej rovnováhe medzi týmito dvoma typmi pocitov, ktoré priamo súvisia s typom a koncentráciou rôznych molekúl. Trpkosť a horkosť môže zvyšovať aj vysoká koncentrácia etanolu. (RIBÉREAU-GAYON et al., 2006b) Svojimi senzorickými vlastnosťami sa líšia izolované frakcie zo strapcov viniča: 1) Relatívne málo polymerizované katechíny a prokyanidíny (diméry, triméry, atď.) sú najmenej reaktívne s proteínmi. Roztok chutí viac kyslo, ako sťahujúco. 2) Oligomérne a polymérne prokyanidíny sa správajú podobným spôsobom, dávajú dojem plnosti, s výraznou horkosťou a trpkosťou. Trpkosť kondenzovaných tanínov vín pozostávajúcich z prokyanidínov sa znižuje polymerizáciou. Pri degustácii kombinácia trieslovín a polysacharidov vyvoláva dojem plnosti a guľatosti a je vysoko žiaduca. 3) Antokyany a ich kombinácie s trieslovinami majú výraznú horkosť najmä u mladých vín, keď molekulárne štruktúry nie sú príliš komplexné. 4) Trieslová bilancia mladého červeného vína pochádza z dobrej harmonizácie tanínov z oboch pôvodov. Semenné taníny dávajú vínu štruktúru a telo, zatiaľ čo šupkové taníny poskytujú plnosť a guľatosť. (RIBÉREAU-GAYON et al., 2006b) Fenolové kyseliny a ich konjugáty nemajú žiadny zvláštny senzorický význam vo vínach (najmä kvôli ich nedostatočnému množstvu), avšak môžu byť významnými prekurzormi prchavých fenolov (vinylfenoly a etylfenoly). Medzi hlavné zložky spôsobujúce horkosť patria monomérne flavanoly a flavan-3,4-dioly (katechíny a leukokyanidíny). Vo vínach červených je prahová hodnota vnímania katechínov oveľa vyššia ako vo vínach bielych. (CLARKE, BAKKER, 2004) Fenolové látky hrajú dôležitú úlohu predovšetkým v chuti červených vín. Sú zodpovedné za niektoré pozitívne chuťové vlastnosti (štruktúra, plnosť a guľatosť), ale aj za pomerne negatívnejšie aspekty (horkosť, drsnosť, trpkosť a štíhlosť). (RIBÉREAU-GAYON et al., 2006b) 35

3.5 ŠTÚDIUM ANTIOXIDAČNEJ AKTIVITY 3.5.1 PÔSOBENIE VOĽNÝCH RADIKÁLOV Voľné radikály ako prirodzená zložka ľudského organizmu sú vo všeobecnosti nestále, vysoko reaktívne a energetické molekuly. Vyznačujú sa obmedzenou dobou existencie a nízkou koncentráciou v ustálenom stave. (KUBIŠTOVÁ, 2012) Reaktívne kyslíkové druhy alebo, voľné radikály sa môžu tvoriť v rámci prirodzeného metabolizmu organizmu (prooxidatívnymi enzýmovými systémami, lipidovou oxidáciou, ožiarením, zápalmi, fajčením, či procesom glykoxidácie), ale aj ako faktory životného prostredia (napríklad látkami znečisťujúcimi ovzdušie). (DLUGOŠOVÁ, PŠENÁKOVÁ, 2004) Je pre ne charakteristická mimoriadna reaktivita a môžu byť nebezpečné pre ľudský organizmus. Vo veľkom množstve vznikajú v priebehu infekcií a ochorení. Sú považované za sprievodcov mnohých civilizačných ochorení. Svojim pôsobením sa podieľajú na vzniku diabetu, očných chorôb, zápalov, nádorov, porúch imunity, neurodegenerativních chorob (Parkinsonovej a Alzheimerovej choroby) a podporujú starnutie organizmu. (www.vscht.cz) Každá bunka je denne napadnutá asi 10 000 voľnými radikálmi, preto musí byť dostatočne antioxidačne chránená. Prevládajúci stav voľných radikálov sa nazýva oxidačný stres. Oxidačný stres je vzostup hladiny voľných radikálov v bunkách, kde sa hromadia vo väčšom ako normálnom množstve. Je to fyziologický stav, v miestach nerovnováhy medzi tvorbou reaktívnych metabolitov a antioxidatívnymi obrannými mechanizmami. (JANÍKOVÁ, 2011) Voľné radikály majú jeden, alebo viac nespárených elektrónov v atómovom, alebo v molekulovom orbitále. K tomuto nepárovému elektrónu sa snažia získať iný elektrón, aby si získali svoju vlastnú stabilitu. Svoj nespárený elektrón prevažne spárujú s elektrónom, ktorý odoberajú iným látkam, čím ich oxidujú. Reakciou voľných radikálov s oxidovanou látkou sa tvoria metabolity, ktoré môžu byť často reaktívnejšie a teda aj škodlivejšie ako pôvodný radikál. (DLUGOŠOVÁ, PŠENÁKOVÁ, 2004) Molekuly, ktoré sú atakované voľnými radikálmi sa samé stávajú voľnými radikálmi a spôsobujú reťazovú reakciu, ktorá môže viesť k zničeniu bunky. K reťazovej reakcii dochádza, keď radikál reaguje s ďalšou molekulou, abstrahuje elektrón 36

a tým vytvára nový radikál, ktorý môže reagovať s inými molekulami. (VERMERRIS, NICHOLSON, 2006) Vlastnosť neutralizovať voľné radikály majú antioxidanty, bez toho aby sa radikálmi samé stali. Ide teda o látky, ktoré ponúkajú svoje vlastné elektróny voľným radikálom, čím bránia poškodeniu buniek. Tým, že antioxidant neutralizuje voľný radikál, sám sa stane neaktívnym. Preto musíme v našom tele antioxidanty neustále dopĺňať. (www.phytochemicals.info) Voľné radikály primárne pôsobia na dôležité makromolekuly. K ich dobre známym škodlivým účinkom patrí peroxidácia lipidov, oxidatívne poškodenie nukleových kyselín, sacharidov a funkcie bielkovín. Ochrana proti vzniku a následnému účinku voľných kyslíkových molekúl preto musí byť u človeka účinne posilňovaná príjmom exogénnych ochranných látok s antioxidačným účinkom. (HALLIWELL, GUTTERIDGE, 1999) 3.5.2 REAKTÍVNE KYSLÍKOVÉ A DUSÍKOVÉ FORMY Reaktívne formy kyslíka (reactive oxygen species ROS) a reaktívne formy dusíka (reactive oxygen species ROS), súhrnne označované RONS (reactive oxygen and nitrogen species), zahrňujú voľné radikály a ich príslušné reaktívne látky neradikálovej povahy, ktoré už nemajú nepárový elektrón (napr. peroxid vodíku, kyselina chlórna, ozón, singletový kyslík, kyselina dusitá). Tabuľka 1: Voľné radikály (Štípek, 2000) VOĽNÉ RADIKÁLY KYSLÍKA VOĽNÉ RADIKÁLY DUSÍKA Superoxidový radikál O 2 - Oxid dusnatý NO Hydroxylový radikál HO Oxid dusičitý NO 2 Peroxylový radikál ROO Alkoxylový radikál RO Hydroperoxylový radikál HO 2 RONS zastávajú v organizme celú radu nezastupiteľných funkcií. Slúžia ako signálne molekuly, faktory imunitnej ochrany a považujú sa za významné prostredníky 37

prenosu energie. Napriek tomu môžu zohrávať negatívnu rolu v patogenézii mnohých chorôb. (KUBIŠTOVÁ, 2012) Zvlášť závažná je reakcia peroxidácie lipidov, medzi hydroxylovými radikálmi a nenasýtenými mastnými kyselinami vedľajších reťazcov fosfolipidov v bunečnej membráne. Ako dôsledok peroxidácie lipidov môže byť ovplyvnená tekutosť membrány a membránové proteíny a najmä receptory sa môžu stať súčasťou radikálových reakcií, ktoré ovplyvňujú ich funkciu. (VERMERRIS, NICHOLSON, 2006) Pôvodcom väčšiny týchto negatív je rola RONS na vzniku oxidačného stresu. Reaktívne formy kyslíka môžu pôsobiť ako mobilné redox signály pre expresiu antioxidačných enzýmov a induktory oxidačného poškodenia bunkových komponentov. (FRAGA, 2010) Reaktívne formy kyslíka (ROS) sú molekuly obsahujúce kyslíkový atóm a tým sú vysoko reaktívne v dôsledku prítomnosti voľných radikálov, alebo konfiguráciu atómu kyslíka, kedy je elektrónov viac než obvykle. Živé organizmy vyvinuli rôzne spôsoby inaktivácie ROS. Prvým mechanizmom je enzymatická inaktivácia. Druhým dôležitým mechanizmom je inaktivácia využitím antioxidantov. Antioxidanty môžu reagovať s radikálmi, ale skôr než sa menia v iné reaktívne molekuly, sú tieto zlúčeniny relatívne stabilné v prítomnosti radikálového elektrónu. V dôsledku toho uhasia reťazovú reakciu a nedôjde tak k ďalšiemu poškodeniu. Relatívna stabilita antioxidantov obsahujúcich radikálový elektrón je zvyčajne výsledkom prítomnosti konjugovaných väzieb, preto sú fenolové a aromatické zlúčeniny všeobecne veľmi účinnými antioxidantmi. (VERMERRIS, NICHOLSON, 2006) 3.5.3 VÝZNAM ANTIOXIDANTOV Antioxidanty sú látky, ktoré pôsobia na voľné radikály v potravinách ich inaktiváciou. Chránia bunky pred účinkom voľných radikálov a ďalších reaktívnych oxidačných činidiel, čím obmedzujú proces oxidácie. (DECKER et al., 2010) Tento proces sa dá zastaviť väzbou medzi dvoma radikálmi, alebo dvomi podobnými reakciami s antioxidantom. Reakcia medzi voľnými radikálmi prebieha ich stretnutím a vďaka svojej veľmi vysokej reaktivite vytvorením nereaktívnej molekuly, ktorá už nemá žiadny voľný nepárový elektrón. Reakcie s antioxidantmi prebiehajú rovnako a odlišujú sa iba v tom, či predá elektrón voľný radikál antioxidantu, alebo 38

naopak antioxidant radikálu. Tým vzniknú dve samostatné, ďalej nereaktívne častice, ktoré pre organizmus nepredstavujú žiadne nebezpečenstvo. (HALLIWELL, 2009) Najznámejší vznik voľných radikálov prebieha v dýchacom reťazci, kde oxidáciou vzdušným kyslíkom vzniká energia a ako vedľajšie produkty voľné superoxidové (O - 2 ) a hydroxylové radikály (HO ). (HALLIWELL, 2009) Negatívne pôsobenie voľných radikálov v organizme je vyvážené existenciou viacerých obranných mechanizmov (PACKER et al., 1999). Obranné mechanizmy proti poškodeniu vyvolaným RONS spadajú do 3 nasledovných kategórií: a) Preventívne antioxidanty zabraňujúce tvorbe voľných radikálov: - chelátory prechodných kovov a ďalšie proteíny uplatňujúce sa v metabolizme a transporte prechodných kovov, ktoré prevádzajú kovové prooxidanty, predovšetkým deriváty železa a medi na stabilné produkty. (účinnými chelátormi sú napríklad kvercetín a taníny) - antioxidačné enzýmy (napr. kataláza, superoxid dismutáza) b) Pohlcujúce antioxidanty eliminujúce voľné radikály: - vychytávače ( scavengers ) prerušujú už bežiaci proces reťazovej radikálovej reakcie (napr. tokoferoly). - lapače ( trappers ) menia voľné radikály na relatívne stabilnejšie radikály (napr. vitamín E) - zhášače ( quenchers ) slúžia k prevedeniu singletového kyslíku na tripletový. (napr. lykopén, kyselina askorbová) c) Reparačné antioxidanty odstraňujúce poškodené molekuly z organizmu: - lipofilné enzýmy (fosfopiláza) pre vyššie karboxylové kyseliny - proteolytické enzýmy pre proteíny - reparačné endonukleázy pre DNA (ĎURAČKOVÁ, 1998) Ďalším významným rozdelením antioxidantov je klasifikácia na prírodné, prírodne identické a syntetické antioxidanty: - Prírodné antioxidanty sú najčastejšie syntetizované rastlinami (ale aj mikroorganizmami, hubami a inými) a do nášho tela sa dostávajú potravou. - Syntetické antioxidanty sú syntetizované umelo a pridávané do potravín za 39

účelom predĺženia trvanlivosti, zabráneniu vzniku nežiaducich chutí a vôní a pre dosiahnutie vyššej nutričnej hodnoty potravín obsahujúcich ľahko oxidovateľné zložky. - Prírodne identické antioxidanty sa nachádzajú bežne v potravinách, avšak sú syntetizované priemyslovo (napr. niektoré syntetické tokoferoly a kyselina askorbová). (KUBIŠTOVÁ, 2012) Vzhľadom k zvyšovaniu koncentrácie kyslíka a uvoľneniu proteínov z viazaných kovov, je pri spracovaní potravín často nevyhnutné pridávanie syntetických antioxidantov. Príjem syntetických antioxidantov však prináša zdravotné riziká, na rozdiel od oveľa prijateľnejších prírodných antioxidantov. Výskumy sa preto zameriavajú na možnosť náhrady syntetických prídavných antioxidantov látkami prírodnými (DECKER et al., 2010). Konkrétnym prípadom je napríklad obmedzenie prídavkov oxidu siričitého (SO 2 ), ako prídavného syntetického antioxidantu vo vínach, ktoré už obsahujú celú radu prírodných látok s antioxidačnými účinkami. Prirodzené antioxidanty sa ďalej delia na hydrofilné (účinkujú iba extracelulárne), lipofilné (sú rozpustné v tukoch, vďaka čomu prenikajú bunečnými membránami a účinkujú intercelulárne) a na amfofilné (kombinujú obe predchádzajúce) a určujú dostupnosť antioxidantov v mieste potreby. (PACKER et al., 1999) Antioxidanty môžu byť syntetizované priamo v tele, alebo sú prijímané potravou. Antioxidantom prijímaným potravou sa v súčasné dobe venuje veľká pozornosť a to hlavne z hľadiska ich biologickej účinnosti a ľahkej dostupnosti. Cieľom tejto aktivity je ochrana štruktúr a funkcií mnohých biomolekúl, udržiavanie fyziologickej rovnováhy medzi iniciátormi oxidácií (RONS) a systémom antioxidačnej ochrany organizmu v priebehu oxidačného stresu, či stimulácii tvorby a aktivity endogénnych antioxidantov. (KUBIŠTOVÁ, 2012) 3.5.4 PRÍRODNÉ ANTIOXIDANTY Prírodné antioxidanty sú syntetizované v rastlinách a zastávajú v nich množstvo nezastupiteľných funkcií. Pomáhajú ich chrániť pred niektorými živočíchmi (horká chuť antioxidantov v rastlinách), či opačne pomáhajú prilákať opeľovačov (pestrá farebná 40

škála niektorých antioxidantov), alebo chránia pred infekciou vírmi a baktériami (antivírové a antimikrobiálne vlastnosti). Ide o najrozšírenejšiu triedu metabolitov v prírode. Ich kľúčovou úlohou je ochrana rastliny napríklad pred ultrafialovým žiarením, či atakom patogénov. Prírodné fenolové zlúčeniny sa radia medzi najhojnejšie látky vykazujúce antioxidačnú aktivitu v našej strave. Jedná sa o redukčné agens, ktoré v kombinácii s ďalšími redukčnými činidlami v našej strave pôsobia ako antioxidanty a chránia náš organizmus pred oxidačným stresom. (KUBIŠTOVÁ, 2012) Prírodné antioxidanty získava ľudský organizmus najmä potravou z ovocia, zeleniny, obilnín, liečivých rastlín a alkoholických a nealkoholických nápojov. Zdroje antioxidantov obsahujú veľa rôznych zlúčenín s antioxidačnými účinkami. Najvýznamnejšie prírodné antioxidanty sú tokoferoly, kyselina askorbová (vitamín C), karotenoidy, fenolové látky (fenolové kyseliny, stilbény a flavonoidy) a mnoho ďalších, pričom najviac zastúpenými prírodnými antioxidantmi v potrave sú práve fenolové látky. Ako účinné antioxidanty sú obzvlášť dôležité v oblasti ochrany proti ľudským degeneratívnych chorôb. (PACKER et al., 1999) Prírodné fenolové zlúčeniny sú sekundárnymi metabolitmi rastlín, ktoré vznikajú biogeneticky prostredníctvom dvoch primárnych syntetických dráh: šikimátovej a acetátovej (KUBIŠTOVÁ, 2012). Ich reaktivita je spojená s kyslým charakterom fenolových funkčných skupín a nukleofilným charakterom benzénového jadra. Fenolové látky sú najviac aktívne v kyslom prostredí a nízke ph vína podporuje antibakteriálnu aktivitu a udržiavanie pigmentu v roztoku. (SANDLER, PINDER, 2003) Fenolové antioxidanty môžu inhibovať dva dôležité kroky v reťazovej reakcii voľných radikálov. Za prvé reakciou s peroxylovými radikálmi a inhibíciou tvorby hydroperoxidov a za druhé alkoxyláciou radikálov a inhibíciou tvorby aldehydu. Pre správne zhodnotenie účinnosti fenolových antioxidantov je nevyhnutná inhibícia tvorby aldehydov spôsobujúcich biologické poškodenie, ktorá je ich dôležitou funkciou. (PACKER et al., 1999) Antioxidačný účinok prírodných fenolových zlúčenín býva spravidla komplexný a možno k nemu priradiť niekoľko základných mechanizmov. Hydroxylové skupiny polyfenolov sú dobrými donormi atómov vodíka. Tento typ antioxidantov môže reagovať s RONS v terminálnej fáze reakcie, ktorá preruší cyklus generovania ďalších voľných radikálov. Táto vlastnosť viacerých polyfenolov je daná ich ľahkou oxidovatelnosťou. Význam reakcie spočíva v eliminácii radikálov skôr, ako môžu reagovať s ďalšími bunkovými komponentmi. 41

Antioxidačná aktivita polyfenolov tiež vyplýva z ich schopnosti vytvárať chelátové väzby s niektorými bivalentnými kovmi (napr. meď a dvojmocné železo). Inhibujú tak Fentovu, či Haber-Weissovu reakciu, ktorých sa voľné ionty týchto kovov zúčastňujú a ktoré vedú k produkcii RONS. Medzi posledný mechanizmus antioxidačných účinkov polyfenolov patrí schopnosť inhibovať určité enzýmy zahrnuté v generácii voľných radikálov. (KUBIŠTOVÁ, 2012) 3.5.5 METÓDY STANOVENIA ANTIOXDAČNEJ AKTIVITY K vzájomnému porovnaniu antioxidačných účinkov bol v súvislosti s analýzou potravinových vzoriek zavedený pojem celková antioxidačná aktivita. Tento parameter kvantifikuje kapacitu vzorky biologického materiálu eliminovať voľné radikály. (KUBIŠTOVÁ, 2012) Pri hodnotení antioxidačnej aktivity je posudzované pôsobenie látok rôznej chemickej povahy s odlišnými reakčnými mechanizmami. K charakterizácii potravinového materiálu z hľadiska antioxidačných vlastností je preto vhodné použiť viacero metód. (SOCHOR et al., 2010) Spoločným rysom metód je charakterizovať v podmienkach blízkych fyziologickému prostrediu antioxidačné, respektíve redukčné schopnosti, ako súhrnnú vlastnosť potravinového preparátu. Metódy k stanoveniu antioxidačnej aktivity možno rozdeliť do dvoch skupín: metódy hodnotiace schopnosť eliminovať radikály (najčastejšie donáciou protónu) a metódy posudzujúce redoxné vlastnosti látok (KUBIŠTOVÁ, 2012). Nižšie sú popísané metódy, ktoré už našli uplatnenie v charakterizácii antioxidačnej aktivity vína. 3.5.5.1 Metódy hodnotiace elimináciu radikálov Metóda ABTS / TEAC (Trolox equivalent antioxidant capacity) Metóda pomocou ABTS radikálov je jednou z najčastejšie používaných metód pre stanovenie celkovej antioxidačnej aktivity. Založená je na neutralizácii radikál kationtu vzniknutého jedno elektrónovou oxidáciou syntetického chromofóru ABTS (2,2 -azinobis 3-ethylbenzothiazolín-6-sulfonát). Reakcia sa väčšinou prevádza na 42

koncentráciu troloxu a pre čisté látky je TEAC definovaná ako mikromolárna koncentrácia ekvivalentu Troloxu (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2- karboxylová kyselina) vykazujúca rovnakú antioxidačnú aktivitu ako testovaná látka. (RE et al., 1999) Metóda DPPH (1,1-difenyl-2-(2,4,6-trinitrofenyl)hydrazyl) Princípom metódy je reakcia testovanej látky so stabilným syntetickým dusíkovým radikálom DPPH (difenylpikrylhydrazylom), pri ktorej dochádza k redukcii radikálu za vzniku DPPH-H (difenylpikrylhydrazínu). Vďaka intenzívnemu zafarbeniu tohto radikálu je daná reakcia sledovaná spektrofotometricky pri vlnovej dĺžke 515 nm zodpovedajúcej maximu absorbancie daného radikálu. Napriek tomu, že ide o veľmi jednoduchú metódu, môže mať aj svoje obmedzenia. Mnohé rýchlo reagujúce antioxidanty môžu byť inertné voči DPPH, alebo s ním reagovať veľmi pomaly. (PAREJO et al., 2000) Metóda DMPD (N,N-dimethyl-1,4-diaminobenzen) Zlúčenina DMPD (N,N-dimethyl-1,4-diaminobenzén) sa v experimentálnom roztoku prevedie pomocou pôsobenia železitej soli na relatívne stabilnú červenofialovú radikálovú formu. Po pridaní vzorky sa v prítomnosti redukčných faktorov radikál zháša a tým dochádza k odfarbeniu roztoku a poklesu absorbancie. Zmena intenzity zafarbenia tohto radikálu je potom úmerná zhášajúcej schopnosti antioxidantov prítomných vo vzorke. (FOGLIANO et al., 1999) Metóda ORAC (Oxygen Radiacal Absorbance Capacity) V testovanom systéme sa generujú kyslíkové radikály a hodnotí schopnosť testovanej vzorky spomaliť či zastaviť radikálovú reakciu. Detekcia je založená na sledovaní úbytku fluorescencie β fykoeritrinu (indikačný proteín) po ataku radikálmi. Ako generátor peroxylových radikálov sa najčastejšie používa AAPH (2,2 azobis(isobutyrimidamid)-dihydrochlorid) a ako kontrolná látka štandard Trolox. (CAO et al., 1999) 43

3.5.5.2 Metódy založené na hodnotení redoxných vlastností látok Metóda FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power) FRAP patrí medzi jednoduché metódy založené na hodnotení redukčných účinkov antioxidantov. Na rozdiel od iných metód nevyužíva žiadny radikál, pretože meria iba silu antioxidantov a nie ich schopnosť zhášať voľné radikály. Metóda je založená na redukcii železitých komplexov TPTZ (2,4,6-tripyridyl-S-triazin) s chloridom železitým (FeCl 3 ), ktoré sú takmer bezfarbé a po redukcii tvoria modro zafarbený železnatý komplex. Metóda má svoje limity spočívajúce v meraní pri nefyziologicky nízkej hodnote ph (3,6), pri ktorej nie sú zachytené s komplexom pomaly reagujúce polyfenolové látky a thioly. (OU et al., 2002) Metóda CUPRAC (Cupric Reducing Antioxidant Capacity) Metóda využíva neocuproín (Nc = 2,9-dimethyl-1,10-fenantrolin) ako chelatačné činidlo. Je založená na meraní absorbancie CUPRAC chromofóru (Cu(I)-Nc chelátu), ktorý vzniká ako výsledok redoxnej reakcie antioxidantov s CUPRAC činidlom (Cu(II)- Nc), pri vlnovej dĺžke 490 nm zodpovedajúcej maximu absorbancie tohto chromofóru. (APAK et al., 2004) 44

4 EXPERIMENTÁLNA ČASŤ 4.1 MATERIÁL 4.1.1 VYBRANÉ ODRODY K výrobe vín boli vybrané 3 odlišné modré odrody z pohľadu senzorických vlastností, fenolového zloženia a pôvodu. Konkrétne klasická skoršia odroda 'Modrý Potrugal', svetová kabernetová odroda 'Carmenere' a česká interšpecifická odroda 'Laurot'. 'MODRÝ PORTUGAL' 'Modrý Portugal' je tradičná stará odroda viniča s neznámym pôvodom. Pestuje sa predovšetkým v regióne strednej Európy a v posledných rokoch stále znova viac získava na význame a popularite. Má stredne veľký až veľký list, väčšinou 3 laločnatý s ostrým zúbkovaním. Strapec je stredne veľký až veľký, kuželovitý s rozvetvenou strapinou do tvaru krídielok, stredne hustý až hustý, bobuľa stredne veľká, tmavomodrá s voskovým povlakom, so šťavnatou dužinou a tenkou šupkou. Dozrieva koncom septembra až začiatkom októbra. 'Modrý Portugal' nie je náročný na stanovište, je vhodný do všetkých oblastí. Dobré sú svahovité polohy s ľahšími pôdami. Nevhodné sú vlhké a dusíkom prehnojované pôdy. Odroda má nižšiu odolnosť voči zimným mrazom, je citlivá na hubové choroby, pri nedokonalom prevedení zelených prác hlavne na múčnatku. Zelené práce hrajú veľkú úlohu aj na kvalitu vína, pretože má bujný rast. Doporučené zaťaženie je 6-8 očiek na m 2. 'Modrý Portugal' má mnohostranné využitie, je vhodný pre veľké množstvo technológií spracovania. Obsah kyselín sa pohybuje na úrovni 7-11 g.l -1. Víno je ľahšieho typu, s rubínovou farbou, jemnou vôňou, harmonické s výrazným ovocným aróma po červenom ovocí, podporené jemnou trieslovinou. Väčšinou sa pije ako mladé (Svätomartinské). (PAVLOUŠEK, 2007; KRAUS et al., 2010) 45

'CARMENERE' 'Carmenere' je veľmi stará kabernetová odroda Vitis vinifera L., pochádzajúca pravdepodobne z juhozápadného Francúzska. Dnes je veľmi rozšírenou najmä v Chile. Je registrovaná v niektorých krajinách EÚ, preto je ju možné pestovať aj v ČR. List má stredne veľký, 5 laločnatý s hlbšími výkrojmi. Strapec je malý až stredne veľký, valcovito - kuželovitý, so stredne veľkou bobuľou. Odroda je vhodná pre najlepšie polohy, kde môže plne vyniknúť jej kvalita. Požiadavky na pôdu má nižšie, vhodné sú suchšie, záhrevné a vododržné pôdy. V polohách, kde nie je dokonale preverené pestovanie modrých odrôd môžu vo víne vynikať výrazné trávové tóny. Odroda dozrieva v druhej polovici októbra, bobule zamäkajú pomerne neskoro. Odolnosť k zimným mrazom je dobrá. Odolnosť k peronospóre a padlí je nižšia. Významné sú včasne vykonané zelené práce, ktoré znižujú citlivosť bobúľ voči múčnatke. 'Carmenere' má dobrú až veľmi dobrú odolnosť k botrytíde, čo umožňuje dlhé zrenie na kroch. Doporučené zaťaženie je 6-8 očiek na m 2. 'Carmenere' je považovaná za odrodu s najvyšším obsahom methoxypyrazínov. Pri začiatku zamäkania bobúľ sú senzoricky patrné veľmi výrazné trávnaté tóny, ktoré v priebehu zrenia vplyvom oslnenia strapcov postupne prechádzajú do bobuľového ovocia a ostružín. Pre zber je dôležitá predovšetkým fenolová zrelosť šupky a semien. Technológia výroby vína je podobná odrodám 'Cabernet Sauvignon' a 'Merlot'. V porovnaní s nimi má však 'Carmenere' jemnejšiu štruktúru trieslovín. Dĺžka macerácie sa preto odvíja od methoxypyrazínových tónov v bobuliach a fenolovej zrelosti semien. Kvalita vína je veľmi vysoká, víno má tmavočervenú farbu, vo vôni a chuti s výraznými tónmi lesného a červeného ovocia. Chuť je plná, extraktívna, harmonická s jemnou trieslovinou. (PAVLOUŠEK, 2012; LAVILLA, 2010) 'LAUROT' 'Laurot' je prvá modrá muštová interšpecifická odroda viniča, zapísaná v Českej republike do štátnej odrodovej knihy v roku 2004. Vyšľachtená bola v spolupráci šľachtiteľov F. Mádl, M. Michlovský, V. Kraus, V. Peřina a L. Glos. Jedná sa o kríženie odrôd 'Merlan' x 'Fratava'. Má stredne veľký list, tmavozelený, 3-5 laločnatý s výraznejšími spodnými výkrojmi. Povrch listu je jemne plstnatý. Strapec je veľký, s menšími tmavomodrými 46

bobuľami, u základu rozvetvený, stredne hustý a dlhý. Optimálnu zrelosť dosahuje 'Laurot' v druhej polovici októbra. Hodí sa do najlepších viničných tratí, svahovitých pozemkov s dobrou expozíciou. Je náročnejší na pôdu, neznáša suché stanoviská, optimálne sú hlinité až hlinitopiesčité pôdy s dobrým vodným režimom. 'Laurot' má veľmi dobrú odolnosť k peronospóre, odolnosť k múčnatke a botrytíde je dobrá. Pri nadmerných dažďoch a hustejšom strapci odolnosť voči botrytíde klesá. Odroda je veľmi plodná, vyžaduje nižšie zaťaženie (4-6 očiek na m 2 ), nevyhnutná je regulácia násady v dobe vegetácie a vylamovanie zálistkov v zóne strapcov. Z dôvodu znižovania vysokej kyseliny tejto odrody (9-13,5 g.l -1 ) a fenolovej zrelosti je významné oslnenie strapcov. 'Laurot' je vhodný pre pestovanie v ekologickom vinohradníctve. Víno má príťažlivú tmavú rubínovú farbu, je plné, v chuti s dominantnými tónmi červeného ovocia (čerešne, višne), pri vyššej zrelosti až lesného ovocia. V mladom víne je vyššia úroveň kyselín a trieslovín, ktoré však majú dobrú štruktúru. Zrením sa víno postupne zaplňuje a naberá na harmónii. (PAVLOUŠEK, 2007; KRAUS et al., 2010) 4.1.2 VÝROBA FORTIFIKOVANÝCH VÍN K výrobe vín bolo použité hrozno z odrôd viniča pestovaných vo vinohrade Záhradníckej fakulty Mendelovej univerzity v Lednici. Vybrané boli 3 modré odrody s rôznymi charakteristikami ('Modrý Portugal', 'Carmenere', 'Laurot'). Skoršia odroda 'Modrý Portugal' bola zberaná dňa 8.10.2013, pri cukornatosti 19,5 NM a k účelu výroby fortifikovaných vín už nebola ďalej dosladená. Obe odrody 'Carmenere' a 'Laurot' boli zberané dňa 29.10.2013. 'Carmenere' dosiahlo cukornatosti 20 NM (bez dosladenia), 'Laurot' dozrel do cukornatosti 17 NM a z dôvodu čo najviac podobného potenciálu cukru v rámci odrôd bol dosladený repným cukrom na 20 NM. Po zbere boli hrozná prevezené a ďalej spracovávané v sklepe ústavu vinohradníctva a vinárstva. Po mlýnkoodstopkovaní bol rmut prečerpaný do plastových 60 litrových kadí a zasírený prídavkom tekutého SO 2 (40%) dávkou 20 mg.l -1. Vzorka muštu bola okamžite analyzovaná v laboratóriu Zahradníckej fakulty. 47

Tabuľka 2: Analýza muštu použitých odrôd Odroda Zber Cukornatosť ( NM) Obsah asimilovateľného dusíka (mg.l -1 ) Obsah titrovateľných kyselín (g.l -1 ) ph Modrý Portugal 8.10.2013 19,5 182,7 7,5 3,16 Carmenere 29.10.2013 20 397,7 8,15 3,49 Laurot 29.10.2013 17» 20 258,1 10,7 3,07 Získaný rmut slúžil k výrobe jednotlivých typov fortifikovaných vín. Množstvo potrebného fortifikačného alkoholu bolo vypočítané zmiešovacou rovnicou. K fortifikácii bol použitý čistý, senzoricky neutrálny vínny destilát o liehovitosti 50 % objemových. VÝROBA VÍNA FORTIFIKOVANÉHO PRED FERMENTÁCIOU (MUTAGE): MACERÁCIA RMUTU >> LISOVANIE >> FORTIFIKÁCIA Rmut k výrobe vzorky z odrody 'Modrý Portugal' bol macerovaný 48 hodín a následne bolo získané potrebné množstvo muštu ručným lisovaním cez dierkové sito. Vzorky z odrôd 'Carmenere' a 'Laurot' boli vyrobené už po 24 hodinovej macerácii rmutu, odčerpaním muštu z rmutu pomocou ponorného kovového sita. Pred samotným prídavkom vínovice mušty 2 hodiny sedimentovali, aby sa čiastočne odstránilo vysoké množstvo kalov z muštu. Fortifikácia vzoriek prebehla ešte pred samotným začatím fermentácie rmutu. Vínovica bola pridávaná postupne a dôkladne premiešaná s muštom. Rozdielnosť dvoch spôsobov výroby vzoriek metódy mutage bola zvolená za účelom získania poznatkov o možných spôsoboch a dĺžky macerácie pred začatím fermentácie. VÝROBA VÍNA FORTIFIKOVANÉHO POČAS FERMENTÁCIE: FERMENTÁCIA RMUTU >> LISOVANIE >> FORTIFIKÁCIA Rmut k výrobe fortifikovaného počas fermentácie bol po odobraní muštu k výrobe vzoriek metódy mutage zakvasený kvasinkami Zymaflore FX10 firmy Laffort. Matolinový klobúk bol v priebehu fermentácie niekoľkokrát denne ponáraný, aby 48

dochádzalo k účinnejšej extrakcii antokyanov a rmut nepodliehal oxidácii a octovým baktériám. Pravidelným meraním na ebulioskope, bol meraný obsah vznikajúceho alkoholu. Pri dosiahnutí úrovne čo najbližšie 7 % obj., bol celý objem kvasiaceho rmutu vylisovaný pneumatickým lisom Wottle a do kvasiaceho vína bol postupne (z dôvodu reakciou vznikajúceho tepla a penenia) pridaný vypočítaný objem vínovice. Rmut odrôd 'Carmenere' a 'Laurot' bol lisovaný v rovnaký deň, čo vysvetľuje rozdiel v mierne nižšej koncentrácii alkoholu 'Laurotu' pri fortifikácii, proti rýchlejšie kvasiacemu 'Carmenere'. VÝROBA VÍNA FORTIFIKOVANÉHO PO FERMENTÁCII: FERMENTÁCIA >> LISOVANIE >> DOKVASENIE >> FORTIFIKÁCIA Výroba fortifikovaného po fermentácii prebiehala podobným spôsobom ako u vína fortifikovaného počas fermentácie. Po vylisovaní rmutu a odobratí potrebného množstva kvasiaceho vína k výrobe vzoriek fortifikovaných počas fermentácie bol objem kvasiaceho vína prečerpaný do sklených demižónov, v ktorých postupne u všetkých odrôd prekvasil do sucha. Po skončení fermentácie bol potrebný objem mladého vína prevedený do menších 5 litrových demižónov a fortifikovaný vypočítaným množstvom vínovice do požadovanej liehovitosti. Finalizácia vzoriek: Jednotlivé vzorky fortifikovaných vín boli po vyrobení ponechané po dobu asi 1 mesiaca na jemných kaloch a následne prvýkrát stočené. Počas ďalšej doby zrenia a spájania s pridaným alkoholom boli stočené z kalov ešte dvakrát. Po každom stočení boli vína vždy doplnené (vytvorenou malou vzorkou fortifikovaného vína, adekvátnou k jednotlivým metódam výroby) po okraj. Vína zreli v sklenených demižónoch pri stálej teplote okolo 15 C až do doby fľašovania pred degustáciou, uskutočnenou dňa 25.2.2014. Množstvo vzorky potrebnej k analýze vín a spektrofotometrickým stanoveniam bolo odoberané priamo z demižónov. Všetky merania boli vykonané v laboratóriu ústavu vinohradníctva a vinárstva na Zahradníckej fakulte v Lednici. 49

Tabuľka 3: Štruktúra vzoriek fortifikovaných vín Vzorka Objem vyrobenej vzorky (v litroch) doba fortifikácie pri % obj. alkoholu Mušt / víno : 50% vínovica (pomer) M - MP 3 0 1,63 : 1 M - CA 3 0 1,63 : 1 M - LA 3 0 1,63 : 1 P - MP 5 7,1 2,60 : 1 P - CA 5 7,2 2,62 : 1 P - LA 5 6,6 2,50 : 1 S - MP 5 11,7 4,26 : 1 S - CA 5 11,8 4,32 : 1 S - LA 5 12 4,43 : 1 OZNAČENIE VYROBENÝCH VZORIEK: vzorka metóda fortifikácie odroda M - MP MUTAGE MODRÝ PORTUGAL M - CA MUTAGE CARMENERE M - LA MUTAGE LAUROT P - MP POČAS FERMENTÁCIE MODRÝ PORTUGAL P - CA POČAS FERMENTÁCIE CARMENERE P - LA POČAS FERMENTÁCIE LAUROT S - MP PO FERMENTÁCII MODRÝ PORTUGAL S - CA PO FERMENTÁCII CARMENERE S - LA PO FERMENTÁCII LAUROT 50

4.2 METÓDY 4.2.1 STANOVENIE CUKORNATOSTI MUŠTU Cukornatosť muštu bola meraná pomocou digitálneho refraktometra POCKET REFRACTOMETER PAL-1 (uvádzaná v Brix). Pred každou sériou meraní prebehlo kontrolné meranie destilovanej vody a v prípade potreby bolo prevedené vynulovanie refraktometru. Pred každým meraním bola detekčná zóna refraktometra opláchnutá destilovanou vodou a dôkladne osušená papierovým obrúskom (KOBLIŽKA, 2014). Namerané hodnoty v Brixov boli pomocou tabuliek prevedené na stupne normalizovaného muštomeru ( NM). 4.2.2 STANOVENIE TITROVATEĽNÝCH KYSELÍN a ph Obsah titrovateľných kyselín bol stanovený titračne za použitia automatického titrátora TITROLINE EASY. Ako titrační činidlo bol použitý 0,1 mol.l -1 roztok NaOH o známom faktore. Na analýzu bolo pipetou odmeraných 10 ml vzorky, ktorá bola následne zriedená pridaním 10 ml destilované vody. Vzorka bola titrovaná až do ph 8,1 (systematická chyba merania zahrnutá vo výpočte). Detekcia ph bola zaistená použitím ph - elektródy SenTix 21. Miešanie vzorky v priebehu analýzy bolo zaistené integrovaným magnetickým miešadlom. Po ukončení titrácie bola z displeja titrátora odčítaná spotreba roztoku NaOH v mililitroch s presnosťou na dve desatinné miesta. (KOBLIŽKA, 2014) Výpočet: obsah titrovateľných kyselín (v g.l -1 ) = spotreba 0,1M NaOH x f (faktor NaOH) x 0,75 4.2.3 STANOVENIE ASIMILOVATEĽNÉHO DUSÍKU (YAN) Množstvo YAN bolo stanovené formaldehydovou titráciou za použitia automatického titrátora TITROLINE EASY. Pri stanovení YAN bolo postupované rovnako ako pri stanovení titrovateľných kyselín. Následne bolo pridaných 10 ml 36-38% vodného roztoku formaldehydu (ph formaldehydu bolo upravené na 8,1 pomocou 1 mol.l -1 roztoku NaOH) a zmes bola opäť titrovaná do ph 8,1. Po ukončení titrácie 51

bola z displeja titrátora odčítaná spotreba roztoku NaOH v mililitroch s presnosťou na dve desatinné miesta. (KOBLIŽKA, 2014) Výpočet: obsah asimilovateľného dusíka (v g.l -1 ) = spotreba 0,1M NaOH x f (faktor NaOH) x 140 4.2.4 EBULIOSKOPICKÉ STANOVENIE ALKOHOLU Táto metóda je založená na určení bodu varu vína, ktorého hodnota sa mení v závislosti od koncentrácie alkoholu (etanolu) vo vode. V prípade vína teplota varu závisí na obsahu alkoholu a súčasne sa mení s tlakom vzduchu. Ebulioskop bol naplnený destilovanou vodou, tá privedená k varu a bol nastavený nulový bod stupnice na mieste ustálenia ortuťového stĺpca. Tým istým spôsobom sa ďalej pokračovalo s testovanými vzorkami vína, ebulioskop sa naplnil po značku a víno sa zahrievalo. Bod, na ktorom sa na krátky čas ustálil ortuťový stĺpec označil obsah alkoholu v Malligandových stupňoch (t.j. v obj. % alkoholu). (BALÍK, 1998) 4.2.5 ANALÝZA VÍNA POMOCOU PRÍSTROJA ALPHA Prístroj ALPHA je kompaktný FTIR analyzátor využívajúci vzorkovaciu techniku ATR, ktorá významne zjednodušuje úpravu vzorky pred analýzou. Vzorky čírych vín boli analyzované bez úpravy. Pred zahájením merania prvej vzorky bol prístroj dôkladne prepláchnutý deionizovanou vodou a zmerané pozadie slepej vzorky. Pre analýzu bol pomocou striekačky odobraný 1 ml vzorky, pričom 0,5 ml poslúžilo k prepláchnutiu systému a z druhého 0,5 ml vzorky boli prevedené tri merania. V závislosti na použitej kalibrácii boli zmerané dáta pomocou softwaru automaticky vyhodnotené a prevedené do tabuľky. (KOBLIŽKA, 2014) 52

SPEKTROFOTOMETRICKÉ STANOVENIA: Úprava vzoriek: Vína boli pred stanovením jednotlivých parametrov odstredené (3000 x g; 6 min). Červené vína (vzorky počas a po fermentácii) boli zriedené riediacim pufrom (40 mm kyselina vinná, 40 mm octan sodný, 12 % etanolu) 6x, svetlejšie vzorky metódy mutage boli zriedené 2x. 4.2.6 STANOVENIE CELKOVÝCH ANTOKYANOV Meranie bolo vykonané SO 2 metódou. V 2 ml eppendorfke 110 μl vzorky s 990 μl 1,1 M HCl. Slepý pokus bol ku každej vzorke pripravený rovnakým spôsobom, kedy roztok HCl bol nahradený čerstvým 0,22 M roztokom K 2 S 2 O 5 (SO 2 ). Po 180 minútach boli v kyvete zmerané absorbancie vzoriek s HCl pri 280 nm a 520 nm. Vzorka s SO 2 bola meraná iba pri 520 nm. (SOMERS, EVANS, 1977; ZOECKLEIN et al., 1990) Výpočet: celkové antokyany (mg.l -1 ) = 4 x riedenie x [A(HCl) 520 - (5/3) x A(SO 2 ) 520 ] 4.2.7 STANOVENIE CELKOVÝCH FENOLOV Celkové fenoly boli stanovené metódou optickej hustoty (OD 280 ) z antokyanov pri absorbancii 280 nm. Výsledné hodnoty boli prepočítané a vyjadrené vo forme mg.l -1 ekvivalentov kyseliny galovej (GA). (SOMERS, EVANS, 1977; ZOECKLEIN et al., 1990) Výpočet: celkové fenoly (OD 280 GA v mg.l -1 ) = 10 x riedenie x A(HCl) 520 4.2.8 STANOVENIE CELKOVÝCH FLAVANOLOV Koncentrácia celkových flavanolov bola stanovená pomocou metódy založenej na reakcii p-dimethylaminocinnamaldehydu (DMACA). Pri tejto metóde na rozdiel od široko používanej reakcie s vanilínom nedochádza k interferencii s antokyanmi a navyše poskytuje vyššiu citlivosť a selektívnosť. Do 1,5 ml eppendorfky s 980 μl 53

roztoku činidla (0,1% DMACA a 300 mm HCl v MeOH) bolo pridaných 20 ml vzorku, pretrepané a ponechané reagovať 12 minút pri laboratórnej teplote. Potom bola zmeraná absorbancia pri 640 nm oproti slepej vzorke. Koncentrácia celkových flavanolov bola vypočítaná z kalibračnej krivky za použitia katechínu ako štandardu (10-200 mg.l -1 ). Výsledky sú vyjadrené vo forme mg.l -1 ekvivalentov katechínu. (LI et al., 1996) 4.2.9 STANOVENIE ANTIRADIKÁLOVEJ AKTIVITY (METÓDA DPPH) Metóda je založená na deaktivácii komerčne dostupného 2,2-difenyl-βpikrylhydrazylového radikálu (DPPH) prejavujúceho sa úbytkom absorbancie pri 515 nm. Ku 980 μl roztoku DPPH v metanolu (150 μm) bolo pridaných 20 μl vzorky, pretrepané a po 30 minútach zmeraná absorbancia pri 515 nm v porovnaní s demineralizovanou vodou. Ku stanoveniu antoradikálovej aktivity bol použitý rozdiel absorbancií slepého pokusu (riediaci pufr) a vzorky. Antiradikálová aktivita bola vypočítaná z kalibračnej krivky, za použitia kyseliny galovej ako štandardu (10-200 mg.l -1 ). Výsledky sú vyjadrené vo forme mg.l -1 ekvivalentov kyseliny galovej (GA) a mm Trolox ekvivalentov. (ARNOUS et al., 2001) 4.2.10 STANOVENIE REDUKČNEJ SILY (METÓDA FRAP) Pre stanovenie redukčnej schopnosti vína bola upravená metóda založená na redukcii železitých iontov (ferric reducing/antioxidant power). V 2 ml eppendorfke bolo zmiešaných 980 μl reakčnej zmesi (1 nm TPTZ, 2 nm FeCl 3, 50 nm HCl a 100 nm Na 2 SO 4 ) s 20 μl vzorky. Zmes bola 20 minút inkubovaná pri 37 C v termobloku. Po inkubácii bolo pridaný 1 ml riediaceho pufru a po 10 minútach státia pri laboratórnej teplote bola zmeraná absorbancia pri 620 nm oproti slepej vzorke (riediaci pufr). Redukčná sila bola vypočítaná z kalibračnej krivky za použitia kyseliny galovej ako štandardu. Výsledky sú vyjadrené vo forme mg.l -1 ekvivalentov kyseliny galovej (GA) a mm ekvivalentov kyseliny askorbovej. (PULIDO et al., 2000) 54

4.2.11 HPLC STANOVENIE JEDNOTLIVÝCH FENOL. ZLÚČENÍN Vína boli odstredené (3000 x g; 6 min). Svetlejšie vína boli 2x zriedené 50 mm HClO 4, červené vína boli 4x zriedené 30 mm HClO 4. Inštrumentácia: Binárny vysokotlaký systém Shimadzu LC-10A. Systém controler: SCL-10Avp. 2 pumpy: LC-10ADvp. Kolónový termostat s manuálnym nástrekovým ventilom Rheodyne: CTO-10ACvp. DAD detektor: SPD-M10Avp. Software: LCsolution. Podmienky separácie: Kolóna: Alltech Alltima C18 3 μm; 3 x 150mm + predkolóna 3 x 7,5mm. Teplota separácie: 60 C. Objem nástreku vzorku: 20 ul. Prietok mobilnej fázy: 0,6 ml/min. Mobilná fáza A: 15 mm HClO 4. Mobilná fáza B: 15 mm HClO 4, 10% MeOH, 50% ACN. Gradientový program: 0,00 min 4% B 20,00 min 28% B 30,00 min 42% B 35,00 min 60% B 38,00 min 100% B 40,00 min 100% B 40,01 min 0% B 40,99 min 0% B 41,00 min 4% B 43,00 min 4% B Celková dĺžka analýzy 43 minút. Regenerácia systému 4 minúty. Dáta zaznamenávané v rozmedzí 200-520 nm. Stanovenie jednotlivých zložiek na základe kalibračných kriviek štandardov: 200 nm: katechín; epikatechín 260 nm: kys. vanilová; kys.protokatechová; kys. 4-hydroxybenzoová 275 nm: kys. galová; kys. syringová; 285 nm: cis-piceid; cis-resveratrol 55

310 nm: kys. p-kumarová a jej deriváty; trans-piceid; trans-resveratrol 325 nm: kys. kávová a jej deriváty; kys. ferulová a jej deriváty; piceatannol 360 nm: rutín; myricetín; kvercetín; kaemferol; isorhamnetin 520 nm: antokyany Deriváty hydroxyškoricových kyselín boli kalibrované základnými kyselinami od ktorých sú odvodené. Antokyany boli kalibrované na malvidin-3,5-diglukosid. 4.3 SENZORICKÉ HODNOTENIE Senzorické hodnotenie vyrobených fortifikovaných vín sa uskutočnilo dňa 25.2.2014 v učebni D11 na Zahradníckej fakulte v Lednici. Degustácie sa zúčastnilo 12 odborných degustátorov, študentov oboru vinohradníctvo a vinárstvo a členov profesorského zboru ústavu vinohradníctva a vinárstva. Degustátori mali k dispozícii hodnotiace tabuľky, skleničky OIV, odlievky a vodu k neutralizácii chuti. Slepou degustáciou v náhodnom poradí bolo hodnotených 9 vzoriek fortifikovaných vín. Vzorky boli hodnotené 100 bodovým systémom OIV a ďalšími vybranými senzorickými parametrami systémom úsečiek (0-10 b.), kde najvyššia hodnota predstavovala najvyššie senzorické vnímanie konkrétneho parametra. Výsledky z degustácie boli spriemerované, hodnoty z úsečiek prepočítané na body a ďalej štatisticky spracované. 56

5 VÝSLEDKY K spracovaniu získaných výsledkov boli použité softwary EXCEL a STATISTICA 10 CZ. Namerané hodnoty boli rozdelené do kategórií a usporiadané do prehľadných tabuliek a grafov. 5.1 ANALÝZA VÍN Vzorky fortifikovaných vín boli pôvodne doliehované na hodnotu 19 % obj. Z dôvodu ďalšej manipulácie s vínami, nariedením stáčaním z kalov v malých objemoch vína, klesla hodnota alkoholu v priemere zhruba o 1 %. Celkový obsah alkoholu sa pohybuje v rozmedzí 17,7-18,7 % obj. Tabuľka 4: Hodnoty základnej analýzy vín na prístroji Alpha Vzorka Alkohol (% obj.) ph Glycerol (g.l -1 ) Hustota Kys. octová (g.l -1 ) Kys. mliečna (g.l -1 ) Kys. jablčná (g.l -1 ) Kys. vinná (g.l -1 ) Celk. kyseliny (g.l -1 ) Celk. cukry (g.l -1 ) M - MP 17,8 3,5 2,67 1,024 0,07 0,09 0,99 2,58 3,54 106,8 M - CA 18,1 3,7 3,23 1,028 0,20 0,11 1,80 2,21 3,98 113,8 M - LA 18,7 3,3 2,80 1,026 0,17 0,25 1,01 3,61 5,15 113,1 P - MP 18,4 3,4 5,90 1,002 0,15 0,10 2,02 2,37 4,75 49,1 P - CA 17,7 3,6 7,38 1,003 0,27 0,54 2,40 2,04 5,15 45,8 P - LA 18,1 3,1 5,72 1,003 0,19 0,38 1,31 4,04 6,52 49,6 S - MP 17,9 3,3 7,41 0,989 0,21 0,38 2,06 2,42 5,44 11,5 S - CA 18,1 3,5 7,65 0,989 0,27 0,54 2,65 2,42 5,70 9,9 S - LA 17,9 3,1 7,10 0,989 0,23 0,57 1,60 3,88 7,18 12,1 Hodnota ph vzoriek fortifikovaných vín je oproti vínam bez prídavku etanolu všeobecne vyššia. To je spôsobené prídavkom vínovice, s ph vyšším ako samotné víno. Vyššie ph dosahujú varianty s prídavkom väčšieho množstva vínovice. Pri každej odrode sa neskoršou fortifikáciou (prídavkom nižšieho množstva vínovice) ph znižuje. Glycerol vzniká v procese kvasenia glukózy. Obsah glycerolu je preto výrazne nižší 57

u vzoriek, pri ktorých prídavkom etanolu nedošlo k fermentácii (metóda mutage), naopak najdlhšou dobou fermentácie je obsah glycerolu najvyšší u vzoriek fortifikovaných po fermentácii. Najnižšia hodnota kyseliny octovej je u vzorky mutage 'Modrý Portugal' (0,07 g.l -1 ), najvyššia u metód počas fermentácie a po fermentácii z odrody 'Carmenere' (0,27 g.l -1 ). Kyselina octová vzniká oxidáciou etanolu a produkciou kvasiniek. Jej najnižšie hodnoty dosahujú vzorky mutage fortifikované pred fermentáciou. Množstvo kyseliny octovej je vo všetkých vzorkách výrazne pod hodnotou, považujúcou sa za znamenie negatívnej aktívnej bakteriálnej činnosti. Celkový obsah kyselín je vplyvom nariedenia prídavkom vínovice významne nižší v porovnaní s nameranými hodnotami analýzy muštu. U vzoriek metódy mutage došlo k až približne polovičnému zníženiu obsahu celkových kyselín. V prípade veľmi vysokej kyseliny v mušte u odrody 'Laurot' (10,7 g.l -1 ), však prídavkom vínovice došlo k prijateľnému zníženiu obsahu celkových kyselín. Množstvo celkového zostatkového cukru sa u vzoriek fortifikovaných vín odvíja od doby zastavenia fermentácie prídavkom etanolu, cukornatosti hrozna, prípadne dosladenia vín. Vzhľadom k nižšej cukornatosti vybraných odrôd sa hodnota zostatkového cukru vo vzorkách metódy mutage pohybuje v rozmedzí 107-114 g.l -1, vo vzorkách fortifikovaných počas fermentácie medzi 46-50 g.l -1. Pôvodne do sucha prekvasené vzorky fortifikované po fermentácii, boli k zjemneniu vyššej kyseliny pre potreby degustácie dosladené hroznovým koncentrátom k hranici polosuchého vína. HPLC ANALÝZA JEDNOTLIVÝCH FENOLOVÝCH ZLÚČENÍN: Profil fenolových zlúčenín vzoriek fortifikovaných vín bol stanovený vysoko účinnou kvapalinovou chromatografiou (HPLC). Tabuľka 5 uvádza hodnoty obsahu hydroxybenzoových a hydroxyškoricových kyselín. Najvyššiu koncentráciu vo víne z hydroxybenzoových kyselín má kyselina galová. Vo vzorkách vín dosiahla najvyššiu hodnotu u 'Modrého Portugalu' fortifikovaného po fermentácii. Najnižšie hodnoty mali vzorky metódy mutage. Hodnoty obsahu stilbénov a flavonolov, ako významných antioxidantov a zdraviu prospešných látok sú uvedené v tabuľke 6. Najvyššie množstvo trans-resveratrolu bolo vo vzorke fortifikovanej po fermentácii z odrody 'Carmenere' (2,032 mg.l -1 ). Pri metóde fortifikácie počas fermentácie bola jeho najvyššia hodnota opäť u odrody 'Carmenere' (1,546 mg.l -1 ), najnižšie hodnoty trans-resveratrolu boli namerané vo vzorkách vín fortifikovaných pred fermentáciou (mutage). 58

Tabuľka 5: Hodnoty profilu hydroxybenzoových a hydroxyškoricových kyselín (v mg.l -1 ) Vzorka Kyselina galová Kyselina protokatechuová Kyselina 4-hydroxybenzoová Kyselina vanilová Kyselina syringová Kyselina kávová Kyselina kaftarová (ako kávová) Kyselina kumarová Kyselina koutarová Kyselina ferulová Kyselina fertarová M - MP 0,509 0,469 0,199 1,134 2,050 0,756 13,76 0,427 2,328 0,257 1,461 M - CA 0,989 0,855 0,080 1,841 2,176 0,579 4,434 0,851 1,180 0,039 0,451 M - LA 1,033 0,432 0,079 0,537 2,329 0,645 21,88 0,498 3,718 0,034 0,824 P - MP 1,813 0,567 0,387 2,279 3,666 0,956 30,46 0,589 4,147 0,455 1,432 P - CA 7,386 1,851 0,677 4,178 4,340 1,939 20,14 3,100 4,726 0,564 0,657 P - LA 6,189 0,955 0,667 1,092 4,541 1,305 42,17 1,545 8,669 0,211 1,026 S - MP 11,05 0,966 0,412 2,514 4,920 0,945 35,03 1,169 4,301 0,562 1,494 S - CA 7,571 1,968 0,821 3,501 4,462 1,773 25,73 3,632 6,581 0,569 0,952 S - LA 8,261 1,311 0,831 1,617 5,000 0,464 50,64 2,426 0,866 0,299 1,202 Tabuľka 6: Hodnoty profilu stilbénov a flavonolov (v mg.l -1 ) Vzorka Trans-resveratrol Trans-piceid (ako voľný resv.) Cis-resveratrol Cis-piceid (ako voľný resv.) Transpiceatannol Myricetín Kvercetín Kaemferol Isorhamnetin Rutín M - MP 0,144 1,616 0,331 2,448 0,035 0,038 0,516 0,056 0,124 0,414 M - CA 0,038 0,744 0,058 0,604 0,025 0,000 0,000 0,000 0,000 0,029 M - LA 0,268 1,075 0,123 1,239 0,035 0,000 0,000 0,000 0,000 0,329 P - MP 0,655 1,660 0,858 2,688 0,041 0,439 0,926 0,018 0,145 1,024 P - CA 1,546 1,589 2,507 3,093 0,031 0,070 0,214 0,038 0,036 0,249 P - LA 1,121 1,995 1,533 3,524 0,039 0,033 0,203 0,013 0,197 0,831 S - MP 0,770 1,859 1,098 3,146 0,017 0,624 0,184 0,022 0,018 0,389 S - CA 2,032 1,592 3,762 3,170 0,030 0,130 0,315 0,039 0,020 0,261 S - LA 1,659 2,044 2,545 3,313 0,043 0,053 0,074 0,013 0,012 1,039 Obsah jednotlivých flavonolov je špecifický u každej odrody. Vo vyrobených vzorkách fortifikovaných vín dosahovali všeobecne vysoké hodnoty flavanolov vzorky z odrody 'Modrý Portugal', najvyšší obsah kvercetínu bol u metódy počas fermentácie. 59

5.2 SPEKTROFOTOMETRICKÉ STANOVENIA Tabuľka 7: Hodnoty obsahu celkových fenolových látok, flavanolov a antokyanov Vzorka Celkové fenoly (mg.l -1 GA) Flavanoly (mg.l -1 ekv. katechínu) Antokyany (mg.l -1 ) M - MP 285,7 39 113,9 M - CA 167 11 6,8 M - LA 224,3 22 5,1 P - MP 459,5 108 202 P - CA 478,8 96 166,8 P - LA 535,3 84 198,8 S - MP 491,6 113 202 S - CA 608,6 125 227,2 S - LA 609,9 101 270,8 700 Sloupcový graf z Celk. fenoly 600 500 celk. fenoly (mg.l -1 GA) 400 300 200 100 0 M - MP M - CA M - LA P - MP P - CA P - LA S - MP S - CA S - LA vzorka Graf 1: Celkové hodnoty obsahu fenolových látok 60

Celkový obsah fenolových látok bol stanovený metódou optickej hustoty (OD 280 ) z antokyanov. Najvyšší obsah fenolových látok mali vzorky fortifikované po fermentácii z odrôd 'Laurot' (609,9 mg.l -1 ) a 'Carmenere' (608,6 mg.l -1 ), najnižší obsah mala vzorka mutage z 'Carmenere' (167 mg.l -1 ). Významné sú rozdiely najmä v obsahu fenolových látok u vzoriek fortifikovaných pred fermentáciou, oproti vzorkám fortifikovaným počas a po fermentácii. Nižšie množstvo celkových fenolov u vzoriek metódy mutage je spôsobené skorým oddelením muštu od rmutu modrých odrôd. Obsah celkových fenolových látok s neskoršou dobou fortifikácie má stúpajúcu tendenciu. 140 Sloupcový graf z Flavanoly 120 flavanoly (mg.l -1 ekv. katechínu) 100 80 60 40 20 0 M - MP M - CA M - LA P - MP P - CA P - LA S - MP S - CA S - LA vzorka Graf 2: Celkové hodnoty obsahu flavanolov (katechínov) Vzorky fortifikované počas a po fermentácii dosahujú výrazne vyššie hodnoty obsahu celkových flavanolov v porovnaní so vzorkami pred fermentáciou (mutage). Najvyššiu hodnotu dosiahla vzorka fortifikovaná po fermentácii z odrody 'Carmenere' (125 mg.l -1 ), najnižšiu hodnotu mala vzorka mutage z rovnakej odrody (11 mg.l -1 ). Flavanoly sa nachádzajú najmä v semenách bobúľ, to spôsobuje veľké rozdiely v obsahu pri metóde mutage, keďže sa látky kvôli krátkemu kontaktu s rmutom zo semien nestihnú uvoľniť vo väčšom množstve. V rámci odrôd dosahovali vyššie 61

hodnoty 'Modrý Portugal' a 'Carmenere', oproti menej vyzretému 'Laurotu'. Vyšší obsah flavanolov u 'Modrého Portugalu' môže byť spôsobený jeho dlhším časovým úsekom nakvášania rmutu (6 dní), ako u odrôd 'Carmenere' a 'Laurot' (obe 3 dni). antokyany (mg.l -1 ) 300 280 260 240 220 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 Sloupcový graf z Antokyany M - MP M - CA M - LA P - MP P - CA P - LA S - MP S - CA S - LA vzorka Graf 3: Celkové hodnoty obsahu antokyanov Množstvo obsahu antokyanov vo víne súvisí predovšetkým s dĺžkou nakvášania rmutu. Najvyššie hodnoty obsahu antokyanov mali vzorky fortifikované po fermentácii, konkrétne najviac farbiarka 'Laurot' (270,8 mg.l -1 ), ktorá obsahuje farbivá aj v dužine. Veľmi významný je nízky obsah antokyanov u metódy mutage odrôd 'Carmenere' (6,8 mg.l -1 ) a 'Laurot' (5,1 mg.l -1 ). Aj v porovnaní so vzorkou mutage z 'Modrého Portugalu' má nízke hodnoty na svedomí rozdielna technika ich výroby. Mušt použitý k výrobe vzoriek mutage z 'Carmenere' a 'Laurotu' bol získaný z rmutu macerovaného 1 deň ('Modrý Portugal' bol macerovaný 2 dni) a oddelený odčerpaním muštu z rmutu (u 'Modrého Portugalu' ručným lisovaním). Možno tak pozorovať značné rozdiely pri dvoch rôznych metódach výroby u vín fortifikovaných pred fermentáciou. 62

;Tabuľka 8: Hodnoty stanovenia antioxidačnej aktivity (DPPH, FRAP) Vzorka Antiradikálová aktivita - DPPH (mg.l -1 GA) Antiradikálová aktivita - DPPH (mm Trolox) Redukčná sila - FRAP (mg.l -1 GA) Redukčná sila - FRAP (mm Kys. askorbovej) M - MP 83,2 1,8 76,1 1,15 M - CA 19,7 0,43 22 0,33 M - LA 45,5 0,99 39,4 0,59 P - MP 169,1 3,66 167,4 2,52 P - CA 145,5 3,15 132,2 1,99 P - LA 176,2 3,82 163,9 2,47 S - MP 200,3 4,34 183,2 2,76 S - CA 197,5 4,28 186,1 2,8 S - LA 205,1 4,44 202,2 3,04 220 Sloupcový graf z více proměnných 200 180 antioxidačná aktivita (mg.l -1 GA) 160 140 120 100 80 60 40 DPPH FRAP 20 0 M - MP M - CA M - LA P - MP P - CA P - LA S - MP S - CA S - LA vzorka Graf 4: Celkové hodnoty stanovenia antioxidačnej aktivity Najvyššie hodnoty antioxidačnej aktivity stanovenej metódou antiradikálovej aktivity (DPPH) mali vzorky fortifikované po fermentácii ('Laurot' - 205,1 mg.l -1, 63

'Modrý Portugal' - 200,3 mg.l -1, 'Carmenere' - 197,5 mg.l -1 ). Antioxidačná aktivita u vzoriek fortifikovaných počas fermentácie dosiahla najvyššej hodnoty u odrody 'Laurot' (176,2 mg.l -1 ), najnižšiu hodnotu získanú metódou stanovenia redukčnej sily (FRAP) mala odroda 'Carmenere' (132,3 mg.l -1 ). Všeobecne najnižšie antioxidačné hodnoty mali vzorky mutage, u ktorých v závislosti na metóde výroby mala najvyššiu hodnotu vzorka z 'Modrého Portugalu' (83,2 mg.l -1 ) a najnižšiu vzorka z 'Carmenere' (19,7 mg.l -1 ). V zrovnaní dvoch metód stanovenia antioxidačnej aktivity (DPPH a FRAP) boli vyššie hodnoty antioxidačnej aktivity u všetkých vzoriek, s výnimkou vzorky metódy mutage z 'Carmenere' namerané metódou stanovenia antiradikálovej aktivity (DPPH). Výsledky získané meraním metódou stanovenia redukčnej sily (FRAP) však dosiahli iba nepatrne nižších hodnôt, preto sú obe metódy zrovnateľné a vhodné k porovnaniu antioxidačnej aktivity fortifikovaných vín a obsahu fenolových látok. 5.2.1 Vplyv obsahu fenolových látok na antioxidačnú aktivitu: 220 Bodov ý graf : Celk. f enoly v s. DPPH GA (Celé příp. v y nech. u ChD) Korelace : r =,97047 200 180 160 DPPH (mg.l -1 GA) 140 120 100 80 60 40 20 0 100 200 300 400 500 600 700 Celk. f enoly (mg.l -1 GA) 0,95 Int.spol. Graf 5: Vplyv obsahu celkových fenolov na antioxidačnú aktivitu (metóda DPPH) 64

Tabuľka 9: Korelácia antioxidačnej aktivity (DPPH) a obsahu celkových fenolov Korelace Označ. korelace jsou významné na hlad. p <,05000 N=9 (Celé případy vynechány u ChD) Proměnná Průměry Sm.odch. Celk. fenoly DPPH (GA) Celk. fenoly DPPH (GA) 428,9644 163,8129 1,000000 0,970473 138,0111 70,6760 0,970473 1,000000 Graf 5 ukazuje hodnoty nameraného obsahu celkových fenolových látok vo všetkých vzorkách fortifikovaných vín v porovnaní s hodnotami antioxidačnej aktivity stanovenými metódou DPPH. So zvyšujúcou sa hodnotou obsahu celkových fenolových látok sa zvyšuje tiež hodnota antioxidačnej aktivity. Koeficient korelácie v tabuľke 9 potvrdzuje štatisticky veľmi silnú závislosť celkového obsahu fenolových látok na antioxidačnú aktivitu vín, meranú metódou antiradikálovej aktivity (DPPH). 220 Bodový graf: Celk. fenoly vs. FRAP GA (Celé příp. vynech. u ChD) Korelace : r =,96995 200 180 160 FRAP (mg.l -1 GA) 140 120 100 80 60 40 20 0 100 200 300 400 500 600 700 Celk. fenoly (mg.l -1 GA) 0,95 Int.spol. Graf 6: Vplyv obsahu celkových fenolov na antioxidačnú aktivitu (metóda FRAP) 65

Tabuľka 10: Korelácia antioxidačnej aktivity (FRAP) a obsahu celkových fenolov Korelace Označ. korelace jsou významné na hlad. p <,05000 N=9 (Celé případy vynechány u ChD) Proměnná Průměry Sm.odch. Celk. fenoly FRAP (GA) Celk. fenoly FRAP (GA) 428,9644 163,8129 1,000000 0,969954 130,2778 67,5648 0,969954 1,000000 Rovnako, ako u predchádzajúcej metódy, môžeme pozorovať zvyšovanie hodnôt antioxidačnej aktivity v súvislosti so stúpajúcim obsahom celkových fenolových látok. Koeficient korelácie v tabuľke 10 potvrdzuje veľmi silnú závislosť obsahu fenolových látok aj na antioxidačnú aktivitu stanovenú metódou FRAP. Celková antioxidačná aktivita vín teda úzko súvisí s celkovým obsahom fenolových látok fortifikovaných vín. Antioxidačná aktivita vzoriek fortifikovaných vín bola stanovovaná dvoma rozdielnymi metódami: metódou hodnotiacou elimináciu radikálov (DPPH) a metódou založenou na hodnotení redoxných vlastností látok (FRAP). Nasledujúca tabuľka sleduje koreláciu týchto dvoch metód použitých pri meraní výsledkov antioxidačnej aktivity. Tabuľka 11: Korelácia stanovovaných metód antioxidačnej aktivity Korelace Označ. korelace jsou významné na hlad. p <,05000 N=9 (Celé případy vynechány u ChD) Proměnná Průměry Sm.odch. FRAP (GA) DPPH (GA) FRAP (GA) DPPH (GA) 130,2778 67,56476 1,000000 0,996871 138,0111 70,67605 0,996871 1,000000 Na základe koeficientu korelácie je z tabuľky 11 patrná významná, veľmi silná štatistická závislosť medzi použitými dvoma metódami stanovenia antioxidačnej aktivity fortifikovaných vín. Pri ďalšom pozorovaní a vyhodnocovaní vplyvu doby fortifikácie na antioxidačné vlastnosti fortifikovaných vín, tak môžeme pracovať s oboma metódami súčasne. 66

5.2.2 Vplyv doby fortifikácie na antioxidačné vlastnosti vín: antixodačná aktivita (mg.l -1 GA) Bodový graf: Doba fortifikácie (%) vs. Antioxidačná aktivita (Celé příp. vynech. u ChD) Korelace FRAP (GA) : r =,94669 Korelace DPPH (GA) : r =,94682 220 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 0 2 4 6 8 10 12 doba fortifikácie (pri % obj.) DPPH (GA) FRAP (GA) 0,95 Int. spol. Graf 7: Závislosť vplyvu doby fortifikácie na antioxidačnú aktivitu Priebeh vplyvu doby fortifikácie na antioxidačné vlastnosti v zrovnaní dvoch metód stanovenia antioxidačnej aktivity (DPPH a FRAP) odhaľuje bodový graf 7 korelácie s intervalom spoľahlivosti 0,95. Zanesením bodov doby fortifikácie do grafu pri % obj. fermentáciou vytvoreného alkoholu u všetkých vzoriek vidieť stúpanie hodnôt antioxidačnej aktivity jednotlivých vzoriek fortifikovaných vín. Možno tak predpokladať, že v prípade vyššej cukornatosti hrozna, vytvorením vyššieho prirodzeného množstva alkoholu a následnou neskoršou fortifikáciou pri % obj., budú mať hodnoty antioxidačnej aktivity naďalej stúpajúci charakter. Tabuľka 12: Korelácia doby fortifikácie a metód stanovenia antioxidačnej aktivity Proměnná Doba fortifikácie (pri % obj.) DPPH (GA) FRAP (GA) Korelace Označ. korelace jsou významné na hlad. p <,05000 N=9 (Celé případy vynechány u ChD) Doba fortifikácie (pri DPPH (GA) FRAP (GA) % obj.) 1,000000 0,946817 0,946694 0,946817 1,000000 0,996871 0,946694 0,996871 1,000000 67

Tabuľka 12 ukazuje veľmi silnú koreláciu doby fortifikácie s metódami stanovenia antioxidačnej aktivity. Dve použité metódy stanovenia antioxidačnej aktivity, ako už bolo popísané vyššie medzi sebou veľmi významne korelujú. Koeficienty korelácie doby fortifikácie a jednotlivých metód majú teda takmer podobnú hodnotu. 220 Krabicový graf dle skupin antioxidačná aktivita (mg.l -1 ) 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 FRAP GA DPPH GA 0 PRED FERMENTÁCIOU POČAS FERMENTÁCIE PO FERMENTÁCII varianta Graf 8: Celkový vplyv metód fortifikovaných vín na antioxidačnú aktivitu Z celkového pohľadu vplyvu metód fortifikácie na antioxidačné vlastnosti vidieť stúpajúci trend rozmedzia hodnôt antioxidačnej aktivity s neskoršou dobou fortifikácie. Značný je najmä výrazný rozdiel medzi dobou fortifikácie pred fermentáciou (metóda mutage) a počas fermentácie. Antioxidačná aktivita rôznych typov výroby vzoriek mutage sa pohybuje v hodnotách 19,7-83,2 mg.l -1, u vzoriek fortifikovaných počas fermentácie je to 132,2-176,2 mg.l -1. Menšie, avšak stále významné rozdiely sú vo fortifikácii počas fermentácie a po fermentácii. Hodnoty antioxidačnej aktivity vzoriek fortifikovaných po fermentácii dosahujú 183,2-205,1 mg.l -1. Antioxidačná aktivita tak dlhšou fermentáciou a neskoršou dobou fortifikácie k dosiahnutiu požadovaného celkového množstva alkoholu stúpa. 68

5.2.3 Porovnanie jednotlivých odrôd a vplyvu metódy výroby fortifikovaných vín na ich antioxidačné vlastnosti: V rámci pokusu hodnotenia vplyvu fortifikácie v rôznych štádiách macerácie a fermentácie na antioxidačné vlastnosti vín, boli tiež zrovnávané výsledky medzi tromi vybranými modrými odrodami viniča a vplyv metódy fortifikácie na antioxidačnú aktivitu u jednotlivých odrôd. 220 Bodový graf z více proměnných proti vzorka 200 antioxidačná aktivita (mg.l -1 ) 180 160 140 120 100 FRAP (GA) DPPH (GA) 80 60 M - MP P - MP S - MP vzorka Graf 9: Vplyv metódy fortifikácie na antioxidačnú aktivitu u odrody 'Modrý Portugal' Antioxidačná aktivita skoršej odrody 'Modrý Portugal' narastala s neskoršou dobou fortifikácie (graf 9). U metódy mutage bola nameraná hodnota 83,2 mg.l -1, u vzorky fortifikovanej počas fermentácie 169,1 mg.l -1 a najvyššia pri fortifikácii po fermentácii 200,3 mg.l -1, všetky stanovené metódou antiradikálovej aktivity. Rovnako antioxidačná aktivita kabernetovej odrody 'Carmenere' stúpala od metódy mutage, až k metóde fortifikácie po fermentácii (graf 10). Vzorka mutage mala hodnotu antioxidačnej aktivity 22 mg.l -1 (metódou redukčnej sily), fortifikovaná počas fermentácie 145,5 mg.l -1 a po fermentácii 197,5 mg.l -1 ekvivalentov kyseliny galovej. 69

220 Bodový graf z více proměnných proti vzorka 200 180 antioxidačná aktivita (mg.l -1 ) 160 140 120 100 80 60 FRAP (GA) DPPH (GA) 40 20 0 M - CA P - CA S - CA vzorka Graf 10: Vplyv metódy fortifikácie na antioxidačnú aktivitu u odrody 'Carmenere' 220 Bodový graf z více proměnných proti vzorka 200 180 antioxidačná aktivita (mg.l -1 ) 160 140 120 100 80 FRAP (GA) DPPH (GA) 60 40 20 M - LA P - LA S - LA vzorka Graf 11: Vplyv metódy fortifikácie na antioxidačnú aktivitu u odrody 'Laurot' 70

Najvyššie hodnoty antioxidačnej aktivity u odrody 'Laurot' (graf 11) boli zaznamenané pri metóde fortifikácie po fermentácii, kde hodnota dosiahla úroveň 205,1 mg.l -1 (pri stanovení DPPH), u vzorky fortifikovanej počas fermentácie bola táto hodnota 176,2 mg.l -1. Najnižšiu hodnotu mala vzorka metódy mutage (45,5 mg.l -1 ). Aj pri tejto odrode vidieť stúpajúcu tendenciu antioxidačnej aktivity s dobou fortifikácie. Z grafov vplyvu metódy výroby fortifikovaných vín na antioxidačnú aktivitu u jednotlivých odrôd, môžeme vyčítať rastúci trend hodnôt antioxidačnej aktivity s posúvajúcou sa dobou (metódou) fortifikácie u všetkých odrôd. Pri porovnaní vybraných odrôd použitých k výrobe fortifikovaných vín, aj napriek slabšej vyzretosti, celkovo najvyššie hodnoty antioxidačných vlastností dosahovala interšpecifická odroda 'Laurot'. U metódy mutage, v prípade rovnakej technológie výroby všetkých vzoriek by bolo možné očakávať zhodný výsledok. V zrovnaní odrôd 'Carmenere' a 'Modrý Portugal' boli hodnoty pri metóde fortifikácie po fermentácii podobné. Pri fortifikácii počas fermentácie antioxidačnými hodnotami prevažoval 'Modrý Portugal', čo môže byť spôsobené slabšou fenolovou vyzretosťou inak kvalitnejšej odrody 'Carmenere'. Vplyv na výšku hodnoty antioxidačnej aktivity však závisí predovšetkým od metódy výroby fortifikovaných vín a doby fortifikácie. 5.3 SENZORICKÁ ANALÝZA Tabuľka 13: Výsledky senzorického hodnotenia vzoriek fortifikovaných vín Vzorka Vzhľad - atraktívnosť Vôňa - ovocnosť Vôňa - vnímané množstvo alkoholu Chuť - ovocnosť Chuť - sladkosť Chuť - vnímané množstvo alkoholu Senzorika - celkové hodnotenie M - MP 6,9 6 5,4 6,6 7,9 6,7 86,8 M - CA 5 6 3,8 6,2 7,5 4,8 83,6 M - LA 5,7 6 4,8 6,3 7,8 6,2 86,0 P - MP 6,9 5,5 6,1 5,2 4,4 6,4 82,0 P - CA 7 6 5,5 6,1 4,7 6,7 84,0 P - LA 8,1 5,4 4,6 6 4,5 4,8 85,6 S - MP 7,2 4,4 4,2 4,4 1,9 6,3 81,8 S - CA 7,5 5,5 4,4 4,7 2 5,4 85,2 S - LA 8,5 5,1 4,3 5 2,5 4,8 85,8 71

Zhrnutie kompletných výsledkov senzorického hodnotenia vyrobených vzoriek fortifikovaných vín je uvedené v tabuľke 13. Čísla v tabuľke sú priemerom hodnotenia všetkých degustátorov a podrobnejšie sú zobrazené v nasledujúcich grafoch. 94 Krabicový graf z hodnotenie seskupený vzorka 92 90 hodnotenie (body) 88 86 84 82 80 78 76 M - MP M - CA M - LA P - MP P - CA P - LA S - MP S - CA S - LA vzorka Priemer Priemer±0,95 Int. spol. Priemer±SmOdch Graf 12: Celkové hodnotenie vzoriek 100-bodovým systémom Spomedzi degustovaných vín bola najvyššie hodnotená vzorka metódy mutage vyrobenej z 'Modrého Portugalu' s priemerným hodnotením 86,8 bodu. V závese za ňou sa umiestnila vzorka metódy mutage z 'Laurotu' s priemerom 86 bodov, po fermentácii z 'Laurotu' s priemerom 85,8 bodu a počas fermentácie z 'Laurotu' s priemerným hodnotením 85,6 bodu. Najnižšie hodnotené boli vzorky z 'Modrého Portugalu' fortifikované po fermentácii s priemerom 81,8 bodu a počas fermentácie, so ziskom 82 bodov. V rámci použitých odrôd k výrobe fortifikovaných vín bol u vzoriek fortifikácie počas a po fermentácii najlepšie hodnotený interšpecifický 'Laurot'. Len s nepatrne nižším hodnotením za ním skončilo kabernetové 'Carmenere', najnižšie hodnotený bol ľahší 'Modrý Portugal'. Zo vzoriek metódy mutage však dosiahol najvyššieho hodnotenia práve 'Modrý Portugal', vyznačujúci sa svojim prevažujúcim ovocným charakterom najmä v mušte, používanom k výrobe tohto typu fortifikovaného vína. 72

Pri porovnaní metód výroby fortifikovaných vín neboli spozorované významné rozdiely medzi metódami, tie sa v celkovom hodnotení prejavili predovšetkým medzi odrodami, ktoré tak zohrávajú dôležitú rolu vo výbere použitia k výrobe fortifikovaných vín. Škála celkového hodnotenia sa pohybovala v neveľkom rozmedzí 82-87 bodov, čo značí dobrú kvalitu všetkých vyrobených vzoriek fortifikovaných vín. Tabuľka 14: Farebná matica p-hodnôt korelácií senzorických parametrov Proměnná Vzhľad - atraktívnosť Vôňa - ovocnosť Vôňa - vním. mn. alk. Chuť - ovocnosť Chuť - sladkosť Chuť - vním. mn. alk. Senzorika - celk. hodn. Barevná matice p-hodnot korelací (Tabulka3) N=9 (Celé případy vynechány u ChD) p<= 0,001 0,010 0,025 0,050 0,100 0,150 0,200 0,350 0,500 1 Vzhľad - atraktívnosť Vôňa - ovocnosť Vôňa - vnímané množstvo alkoholu Chuť - ovocnosť Chuť - sladkosť Chuť - vnímané množstvo alkoholu Senzorika - celkové hodnotenie 0,121 0,836 0,190 0,028 0,625 0,636 0,121 0,397 0,004 0,010 0,694 0,216 0,836 0,397 0,531 0,637 0,031 0,851 0,190 0,004 0,531 0,001 0,715 0,154 0,028 0,010 0,637 0,001 0,609 0,327 0,625 0,694 0,031 0,715 0,609 0,608 0,636 0,216 0,851 0,154 0,327 0,608 Cieľom farebnej matice p-hodnôt korelácií je prehľadné zhodnotenie vzťahu medzi hodnotenými premennými. Nulová hypotéza potom vyjadruje nezávislosť premenných. Ak je p < α (hladina významnosti), nulová hypotéza sa voči príslušnej alternatívnej hypotéze zamietne. Znamená to, že rozdiel získaný vo vzorke je príliš veľký na to aby bol iba náhodný. Medzi premennými teda existuje významný vzťah. Pri p < 0,05 ide o štatisticky významný a p < 0,01 štatisticky vysoko významný vzťah. Štatisticky vysoko významné vzťahy v senzorike hodnotených parametrov sa ukázali medzi vnímaním zostatkového cukru vín (sladkosti v chuti) a vnímaním ovocného charakteru vín v chuti. Ďalšími vysoko významnými vzťahmi bolo vnímanie medzi ovocnosťou vo vôni a v chuti a tiež medzi vnímaním sladkosti v chuti a ovocnosti vo vôni vín. Štatisticky významný sa ukázal aj vplyv hodnotenia atraktívnosti vzhľadu vín a vnímania sladkosti. Štatisticky významný vzťah bol medzi množstvom vnímaného alkoholu vo vôni a v chuti. Celkové hodnotenie fortifikovaných vín nebolo štatisticky významne ovplyvnené množstvom vnímaného alkoholu jednotlivých metód fortifikácie. Vyššie množstvo pridanej vínovice, potrebné k dosiahnutiu požadovanej liehovitosti (najvyššie pri metóde mutage) je tak pravdepodobne kompenzované vyššou úrovňou zostatkového cukru príslušnej metódy výroby fortifikovaných vín. 73

9 Sloupcový graf z více proměnných 8 7 hodnotenie (0-10 b.) 6 5 4 3 2 1 0 M - MP M - CA M - LA P - MP P - CA P - LA S - MP S - CA S - LA Vôňa - ovocnosť Chuť - ovocnosť Chuť - sladkosť vzorka Graf 13: Porovnanie vnímania sladkosti a ovocnosti vo vôni a v chuti Senzorickým hodnotením vnímania sladkosti vzoriek vín, bol degustátormi správne zhodnotený obsah zostatkového cukru u rozličných metód fortifikovaných vín, kedy najsladšie vzorky metódy mutage dosiahli najvyššieho hodnotenia vnímania sladkosti a najnižších hodnôt dosiahli vzorky fortifikované po fermentácii s najmenším obsahom zostatkového cukru, aj napriek ich miernemu dosladeniu pre potreby degustácie. Vnímanie ovocnosti vo vôni a v chuti dosiahlo veľmi podobných hodnôt. Zrovnaním hodnotenia vnímania ovocného charakteru vín vo vôni a v chuti s vnímaním sladkosti, pozorovať znižovanie vnímania ovocnosti s nižším obsahom zostatkového cukru vzoriek vín (graf 13). Hodnota sladkosti výsledného vína tým pádom výrazne podporuje ovocný charakter fortifikovaných vín. Keďže k docieleniu požadovanej rovnakej liehovitosti variant fortifikovaných vín bolo na základe množstva fermentáciou vytvoreného prirodzeného alkoholu potrebné rozdielne vysoké množstvo pridaného alkoholu (vínovice), pri senzorickej analýze sa hodnotilo práve toto množstvo vnímania pridaného alkoholu vo vôni a v chuti vín (graf 14). Vo všeobecnosti najvyššie bol viac vnímaný alkohol u vzoriek 74

vyrobených z odrody 'Modrý Portugal', ako u ostatných dvoch použitých odrôd. Porovnaním metód fortifikovaných vín sa nepatrne najmenej vnímané množstvo alkoholu (najmä vo vôni) javí pri metóde fortifikácie po fermentácii, u ktorej skutočne došlo k najnižšiemu prídavku vínovice. Medzi metódami fortifikácie pred a počas fermentácie bolo v chuti vnímané podobné množstvo pridaného alkoholu, vo vôni bol však alkohol najviac vnímaný pri vínach fortifikovaných počas fermentácie, u vzoriek fortifikovaných pred fermentáciou vo vôni prevážil ovocný a sladký charakter vína. Celkovo bol u všetkých vzoriek vyšší alkohol vnímaný viac v chuti ako vo vôni. 8 Sloupcový graf z více proměnných 7 6 hodnotenie (0-10 b.) 5 4 3 2 1 0 M - MP M - CA M - LA P - MP P - CA P - LA S - MP S - CA S - LA Vôňa - vnímané množsto alkoholu Chuť - vnímané množstvo alkoholu vzorka Graf 14: Porovnanie vnímania množstva alkoholu vo vôni a v chuti V navrhnutom pokuse diplomovej práce boli vyrobené rôzne štýly a typy fortifikovaných vín, za použitia troch rozdielnych modrých odrôd viniča. Na základe výsledkov senzorickej analýzy však treba vyzdvihnúť vysokú kvalitu všetkých týchto špeciálnych vín, prihliadajúc tiež k obrovskému potenciálu ich zrenia a vývoja do budúcna. 75

6 DISKUSIA Vplyv obsahu fenolových látok na antioxidačné vlastnosti fortifikovaných vín: Fenolové zlúčeniny sú v prírode široko distribuované látky s významnými antioxidačnými vlastnosťami. Do vína prechádzajú v rozličnom množstve, rôznymi technikami v priebehu jeho výroby. Ich antioxidačný potenciál závisí od počtu a usporiadania hydroxylových skupín a rozsahu štruktúry konjugácie. Antioxidačná aktivita vín súvisí s celkovým obsahom fenolových látok a zložením jednotlivých fenolových zlúčenín. Pri štúdiu konkrétnych významných zlúčenín s antioxidačnými vlastnosťami, uvádza Arcari et al. (2012) namerané hodnoty flavonolu kvercetínu v červených fortifikovaných vínach v rozmedzí 2,71 mg.l -1 (Portské, Douro) až dokonca 26,42 mg.l -1 u brazílskych fortifikovaných vín. V diplomovej práci zo vzoriek vín fortifikovaných v priebehu fermentácie dosiahol najvyššiu hodnotu 0,926 mg.l -1 'Modrý Portugal' fortifikovaný počas fermentácie. López et al. (2003) potvrdzuje najvyššie antioxidačné vlastnosti kvercetínu, aj v porovnaní s trans-resveratrolom a ostatnými pozorovanými látkami (kyselina galová, rutín). Najvyššia hodnota trans-resveratrolu bola nameraná vo vzorke z odrody 'Carmenere' fortifikovanej po fermentácii (2,032 mg.l -1 ). Arcari et al. (2012) udáva hodnoty transresveratrolu vo fortifikovaných vínach na úrovni 2,33-10,94 mg.l -1. Z fenolových kyselín boli vo fortifikovaných vínach najviac zastúpené kyselina galová a kyselina syringová, rovnako tak vo svojej práci prezentuje García-Viguera et al. (1997). Z hydroxyškoricových kyselín prevládala kyselina kaftarová. Ako uvádza Feliciano et al. (2008), antioxidačná aktivita fortifikovaných vín súvisí s celkovým obsahom fenolových látok viac, ako s ich jednotlivými skupinami. Tiež Arcari et al. (2012) prezentuje tvrdenie, že výsledky antioxidačnej aktivity fortifikovaných vín veľmi silne korelujú predovšetkým s obsahom celkových fenolových zlúčenín. Pri zrovnaní obsahu fenolových látok so stanovením antioxidačnej aktivity metódou DPPH (antiradikálovej aktivity) uvádza silnú korelácieu 0,82, pri metóde FRAP (redukčnej sily) dokonca veľmi silnú koreláciu 0,98. Hua et al. (2008) vo svojej štúdii však korelačný koeficient medzi obsahom celkových fenolov a antioxidačnou aktivitou vín meranou metódou DPPH, uvádza už na veľmi silnej korelácii 0,96. Tieto hodnoty sa v podstate rovnajú výsledkom prezentovaným 76

v diplomovej práci, kde závislosť obsahu celkových fenolových látok a antioxidačnej aktivity dosiahli rovnako veľmi silných korelácií, pri DPPH = 0,971 a pri metóde FRAP = 0,970. Zároveň bola zistená takmer dokonalá, veľmi silná korelácia medzi dvomi použitými metódami merania antioxidačnej aktivity fortifikovaných vín, s koeficientom korelácie 0,997. Antioxidačná aktivita fortifikovaných vín teda veľmi významne koreluje s obsahom celkových fenolov a skupín fenolových látok. Porovnanie vplyvu doby fortifikácie na antioxidačné vlastnosti vín: Fortifikácia vzoriek prebehla v troch štádiách výroby vín. Vínovica bola pridaná do muštu pred začatím fermentácie, do fermentujúceho vína počas priebehu kvasenia a do vína po skončení fermentácie. Hodnoty obsahu flavanolov (katechínov), celkových fenolových látok a antioxidačnej aktivity mali u všetkých použitých modrých odrôd viniča rastúci trend s posúvajúcou sa dobou fortifikácie primárneho vína, respektíve muštu. Najvyšší obsah flavanolov a celkových fenolových látok mali vzorky vín fortifikované po fermentácii. Vo výške obsahu nasledovali vzorky fortifikované počas fermentácie, najnižších hodnôt dosiahli vína fortifikované pred fermentáciou, u ktorých sa tiež vo výsledkoch významne prejavila rozdielna technika ich výroby. Arcari et al. (2012) uvádza antioxidačnú aktivitu fortifikovaných vín 2,7-20,11 mm Troloxu (DPPH). Z vyrobených vín mali najvyššie hodnoty antioxidačnej aktivity vzorky s metódou fortifikácie po fermentácii (4,28-4,44 mm Troloxu), vzorky fortifikované počas fermentácie mali hodnoty 3,15-3,82 mm Troloxu a nakoniec vína fortifikované pred fermentáciou dosiahli rozmedzia 0,43-1,8 mm Troloxu (DPPH). Odroda hrá značnú rolu v celkovej antioxidačnej charakteristike vín, uvádza Lachman et al. (2009). Skutočne, najvyššie antioxidačné vlastnosti z použitých odrôd vykazovala odroda 'Laurot'. Za ňou nasledovali s vyrovnanejšou bilanciou odrody 'Modrý Portugal' a 'Carmenere'. Pri porovnávaní odrôd viniča, však treba počítať aj so stupňom vyzretosti jednotlivých odrôd po fenolovej stránke v konkrétnom ročníku. Viac ako chemické zloženie hrozna, je ale pre konečný produkt z pohľadu antioxidačnej aktivity dôležitý hlavne proces výroby fortifikovaného vína, ako uvádza aj Feliciano et al. (2008). Toto tvrdenie sa zhoduje so závermi zistenými meraním a vyhodnotením výsledkov vzoriek fortifikovaných vín vyrobených v rámci praktického pokusu 77

diplomovej práce, kedy doba fortifikácie dosahuje u oboch meraných metód antioxidačnej aktivity vysoko významnú hodnotu korelácie 0,947. Táto hodnota tak potvrdzuje významný vplyv prídavku alkoholu na antioxidačné vlastnosti fortifikovaných vín. Nižšie hodnoty fenolových látok namerané vo vínach vyrobených v rámci diplomovej práce, úzko súvisiace s hodnotami antioxidačnej aktivity vín, majú na svedomí menej priaznivé klimatické podmienky ročníku 2013 a tým nižšia fenolová vyzretosť hrozna, ktorá je dôležitá najmä pri modrých odrodách viniča a ktorá dosahuje neporovnateľne vyšších úrovní v južnejších krajinách. Prezentované výsledky nám však dávajú dostatočnú predstavu o významných rozdieloch v rámci porovnania jednotlivých metód výroby fortifikovaných vín a vplyvu doby fortifikácie vín na ich antioxidačné vlastnosti. Porovnanie senzorických vlastností metód fortifikovaných vín: Pre fortifikované vína sú typické vysoký obsah alkoholu a široká škála výšky zostatkového cukru vo víne. Obsah alkoholu vo vyrobených vzorkách sa pohyboval medzi 17,7-18,7 % obj. Z výsledkov hodnotení degustátorov a vyjadrení štatistických závislostí medzi hodnotenými parametrami vyplýva, že vyššie množstvo pridaného alkoholu celkové hodnotenie jednotlivých metód fortifikovaných vín neznižuje. Jackson (2002) uvádza, etanol ako látku, ktorá sa vyznačuje svojim sladkým aspektom, znižuje kyslosť vína a podporuje sladkosť cukru vo víne. Degustátormi hodnotené vnímané pridané množstvo alkoholu vo vôni, ani v chuti významne neovplyvňuje vnímanie sladkosti a ovocnosti vína. Vnímanie sladkosti a ovocnosti však stúpa so zvyšujúcim sa obsahom zostatkového cukru, ktorého úroveň závisí od použitej metódy výroby fortifikovaných vín. Vyššia sladkosť vína podporuje vnímanie ovocnosti vo vôni aj v chuti vín. Zvolená metóda doliehovania fortifikovaných vín vplýva na určité senzorické parametre vín, rovnako ako výber odrody použitej k výrobe fortifikovaných vín. Doba fortifikácie významne ovplyvňuje najmä hodnotu zostatkového cukru, jej senzorické vnímanie a vnímanie s ňou súvisiaceho ovocného charakteru vín. 78

7 ZÁVER Fortifikované vína predstavujú skupinu špeciálnych vín, do ktorých bol v priebehu výroby pridaný vysoko percentný alkohol. Vyznačujú sa tiež rozličným obsahom zostatkového cukru, závisiacim od mnohých metód výroby vín. Úlohou diplomovej práce bolo vyhodnotiť vplyv rôznej doby fortifikácie na antioxidačné vlastnosti vín. Antioxidanty sú látky, ktoré chránia pred škodlivým účinkom voľných radikálov obmedzovaním procesu oxidácie. Ich zdrojom vo víne sú skupiny fenolových látok, extrahujúce sa z bobúľ do vína v priebehu procesu výroby vína. Najvyšší celkový obsah fenolových látok mali vzorky vín fortifikovaných po fermentácii, nižšie hodnoty boli vo vínach fortifikovaných počas fermentácie a najnižšie vo vzorkách vín fortifikovaných pred fermentáciou (metóda mutage). Najvyššie hodnoty antioxidačnej aktivity, meranej dvomi metódami, dosiahli rovnako vzorky vín s dobou fortifikácie po fermentácii, najnižšie boli u vzoriek vín fortifikovaných pred začatím fermentácie. Výsledky praktického pokusu poukázali na významnú koreláciu obsahu fenolových látok s hodnotou antioxidačnej aktivity fortifikovaných vín a vplyvu doby fortifikácie na ich antioxidačnú aktivitu. Zo získaných poznatkov analýzy vín a senzorického hodnotenia možno vyvodiť úsudok, že vhodnými odrodami k výrobe fortifikovaných vín v tunajších podmienkach, môže byť práve skupina interšpecifických odrôd viniča, s vysokým obsahom farbív a bohatým fenolovým profilom. Fortifikované vína sa čoraz viac dostávajú do povedomia širokej verejnosti. Výroba týchto vín je preto zaujímavá aj z pohľadu výrobcov, pre ktorých po splnení príslušných legislatívnych podmienok predstavuje vhodný doplnok sortimentu vín, s vysokým potenciálom zrenia, dobrou mikrobiologickou stabilitou a širokým uplatnením v gastronómii. Oxid siričitý je látka syntetickej povahy, ktorá sa zaraďuje medzi alergény a u citlivejších ľudí môže vyvolať nepríjemné alergické reakcie. K výrobe fortifikovaných vín postačuje použitie minimálneho množstva SO 2. Úlohu stabilizačného prostriedku zastupuje vysoké množstvo celkového alkoholu. Hodnota antioxidačnej aktivity fortifikovaných vín závisí predovšetkým od metódy výroby vín a doby fortifikácie. Jej správnym zvolením, z hľadiska vlastností akých chceme v konečnom produkte dosiahnuť, tak možne ovplyvniť aj celkové antioxidačné vlastnosti týchto špeciálnych vín. 79

8 SÚHRN Zadaná diplomová práca sa zaoberala štúdiom a vyhodnotením vplyvu fortifikácie v rôznych štádiách macerácie/fermentácie na antioxidačné vlastnosti vín. V literárnej časti práce boli prehľadne opísané kapitoly týkajúce sa rôznych metód výroby a typov fortifikovaných vín, jednotlivých skupín fenolových látok nachádzajúcich sa vo víne a štúdia antioxidačnej aktivity vína a metód jej stanovenia. V praktickej časti boli vybrané tri modré odrody viniča, z ktorých bolo postupne vyrobených 9 vzoriek fortifikovaných vín. Doba fortifikácie sa uskutočnila v troch rôznych štádiách macerácie. Prvou bola fortifikácia do muštu pred začatím fermentácie, druhou fortifikácia počas fermentácie pri prekvasení cukru na približne 7 % obj. alkoholu a treťou fortifikácia po fermentácii do mladého suchého vína. Fortifikácia prebiehala prídavkom vypočítaného množstva vínovice do objemu vína, prípadne muštu, na rovnakú úroveň liehovitosti všetkých výsledných vzoriek vín. Po určitej dobe spájania s destilátom prebehla základná analýza vzoriek vín a stanovenie profilu fenolových látok. Spektrofotometricky bol ďalej stanovený celkový obsah fenolových látok, flavanolov, antokyanov a antioxidačnej aktivity, ktorá bola stanovená dvomi rozdielnymi metódami. Základná analýza a spektrofotometrické merania boli uskutočnené v troch vyhotoveniach, výsledky boli spriemerované. Vzorky fortifikovaných vín boli nakoniec za účasti 12 degustátorov senzoricky zhodnotené a všetky získané výsledky zhrnuté do tabuliek a grafov, štatisticky vyhodnotené a popísané s vyvodením záverov pre praktické využitie. Kľúčové slová: fortifikácia, fortifikované vína, fenolové látky, antioxidačná aktivita, antioxidanty 80

9 RESUMÉ Diploma thesis dealt with studying and evaluating the impact of fortification in different stages of maceration/fermentation on antioxidant properties of wine. The literary part of the work was clearly described chapters on various production methods and types of fortified wines, different classes of phenolic substances present in wine and study of antioxidant activity of wine and methods of assessment. In the practical part, were selected three blue grape variety from which it was successively produced 9 samples fortified wines. Time fortification took place in three different stages of maceration. The first was the fortification to the must before the start of fermentation, a second fortification during the fermentation of sugar - fermentation to about 7 % by volume alcohol, and the third fortification after fermentation in young dry wine. Fortification was carried out by adding the calculated amount of spirit in the volume of wine or must, at the same level of spirituosity all the resulting wine samples. After some time joining the distillate was carried out basic analysis of wine samples and determination of the profile of phenolic compounds. Spectrophotometric method was further assessed total content of phenolic compounds, flavanols, anthocyanins and antioxidant activity, which was determined by two different methods. Basic analysis and spectrophotometric measurements were performed in triplicate and the results were averaged. Samples of fortified wines were finally sensory evaluated participation of 12 tasters, and all the results summarized in tables and graphs, statistically evaluated and described in drawing conclusions for practical use. Keywords: fortification, fortified wines, phenolic compounds, antioxidant activity, antioxidants 81

10 ZOZNAM POUŽITEJ LITERATÚRY ANDERSEN, Øyvind M a Kenneth R MARKHAM. Flavonoids: chemistry, biochemistry, and applications. Boca Raton, FL: CRC, Taylor, 2006, 1237 p. ISBN 08-493-2021-6. APAK R., K. GÜÇLÜ, M. ÖZYÜREK, S.E. KARADEMIR. A novel total antioxidant capacity index for dietary polyphenols, vitamin C and E, using their cupric ion reducing capability in the presence of neocuproine: The CUPRAC method, J. Agric. Food Chem, 2004. 52: p. 7970-7981. ARCARI, Stefany Grützmann, Eduardo Sidinei CHAVES, Regina VANDERLINDE, Jean Pierre ROSIER a Marilde T. BORDIGNON-LUIZ. Brazilian fortified wines: Chemical composition, chromatic properties and antioxidant activity. Food Research International [online]. 2013, vol. 53, issue 1, s. 164-173 [cit. 2014-04-23]. DOI: 10.1016/j.foodres.2013.04.025. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/s0963996913002639 ARNOUS, A.; MARKIS, D.P.; KEFELAS P. Effect of principal polyphenolic components in relation to antioxidant characteristics of aged red wines. J. Agric. Food Chem. 2001, 49, 5736-5742. BALÍK, Josef. Anthokyaninová barviva v hroznech a vínech: Anthocyanin pigments in grapes and wines. Vyd. 1. Mendelova univerzita v Brně, 2010, 108 s. Folia Universitatis Agriculturae et Silviculturae Mendelianae Brunensis. ISBN 978-80- 7375-412-9. BALÍK, J. Vinařství: návody do laboratorních cvičení. 1. vyd. Brno: Mendelova zemědělská a lesnická univerzita, 1998. 96 s. ISBN 80-7157-317-5. CAO, G., R. L. PRIOR. Measurement of oxygen radical absorbance capacity in biological samples. Methods in Enzymology, 1999., p. 50 62. CARRASCOSA SANTIAGO, Alfonso V, Rosario MUÑOZ a Ramón GONZÁLEZ GARCIA. Molecular wine microbiology. 1st. ed. Boston: Academic Press, 2011, vii, 363 p. ISBN 01-237-5021-0. CLARKE, R a Jokie BAKKER. Wine flavour chemistry. Ames, Iowa: Blackwell Pub., c2004, xii, 324 p. ISBN 14-051-0530-5. 82

DECKER, Eric A., D. Julian MCCLEMENTS a Ryan J. ELIAS. Oxidation in foods and beverages and antioxidant applications. Philadelphia: Woodhead Pub., 2010, 2 v. Woodhead Publishing in food science, technology, and nutrition. ISBN 978-184- 5699-833. DLUGOŠOVÁ, Katarína a Ivana PŠENÁKOVÁ. Antioxidačné účinky vybraných sekundárnych metabolitov. Katedra biotechnológií, Fakulta prírodných vied Univerzity sv. Cyrila a Metoda v Trnave: Nova Biotechnologica, 2004. ISSN 1338-6905. ĎURAČKOVÁ, Z. Voľné radikály a antioxidanty v medicíne 1: definícia, rozdelenie a biologický význam voľných radikálov a antioxidantov, Bratislava: Slovak Academic Press, 1998. 285 s. ISBN 80-88908-11-6. Exposition Universelle des Vins et Spiritueux. About Vin de liqueur [online]. 2008 [cit. 2014-04-06]. Dostupné z: http://www.euvs.org/en/collection/spirits/fortifiedwine/vin-de-liqueur FELICIANO, Rodrigo P., Maria N. BRAVO, Marilda M. PIRES, Ana T. SERRA, Catarina M. DUARTE, Luís V. BOAS a Maria R. BRONZE. Phenolic Content and Antioxidant Activity of Moscatel Dessert Wines from the Setúbal Region in Portugal. Food Analytical Methods [online]. 2008, vol. 2, issue 2, s. 149-161 [cit. 2013-06-16]. DOI: 10.1007/s12161-008-9059-7. Dostupné z: http://link.springer.com/article/10.1007%2fs12161-008-9059-7 FOGLIANO V., V. VERDE, G. RANDAZZO, A. RITIENI. A method for measuring antioxidant activity and its application to monitoring the antioxidant capacity of wines. J. Agric. Food Chem, 1999. 47: p. 1035-1040. FRAGA, Cesar G. Plant phenolics and human health: biochemistry, nutrition, and pharmacology. Hoboken, N.J.: Wiley, c2010, xii, 593 p. Wiley-IUBMB series on biochemistry and molecular biology. ISBN 04-702-8721-7. GARCÍA-VIGUERA, Cristina, Johanna BAKKER, Sara J. BELLWORTHY, Hillary P. READER, Steven J. WATKINS a Peter BRIDLE. The effect of some processing variables on non-coloured phenolic compounds in port wines. Springer- Verlag. 1997, č. 205, s. 321-324. Dostupné z: http://link.springer.com/article/10.1007%2fs002170050173 GROTEWOLD, Erich. The science of flavonoids. New York: Springer, c2006, vii, 273 p. ISBN 978-038-7288-215. HALLIWELL, B., The wanderings of a free radical. Free Radical Biology and Medicine, 2009. 46(5): p. 531-542. 83

HALLIWELL, B.; GUTTERIDGE, J. M. C., (eds): In: Free Radical in Biology and Medicine. Oxford University Press, UK, 1999c, p. 105. HORNSEY, Ian S. The chemistry and biology of winemaking. Cambridge, UK: Royal Society of Chemistry, c2007, xi, 457 p. ISBN 978-085-4042-661. HUA, Li, Wang XIAOYU, Li YONG, Li PEIHONG a Wang HUA. Polyphenolic compounds and antioxidant properties of selected China wines. Food Chemistry. 2008, roč. 2009, č. 112, s. 454-460. Dostupné z: http://citeseerx.ist.psu.edu/viewdoc/download?doi=10.1.1.323.5250&rep=rep1&typ e=pdf JACKSON, Ronald S. Wine science: principles and applications. 3rd ed. Amsterdam: Elsevier/Academic Press, 2008. ISBN 978-012-3736-468. JACKSON, Ron S. Wine tasting: a professional handbook. San Diego: Academic Press, c2002, xvi, 295 p. ISBN 01-237-9076-X. JANÍKOVÁ, Adriana. Prirodzené antioxidanty v rastlinných produktoch. Nitra, 2011. Bakalárska práca. Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre. KÁNTOR, Atilla, Miroslava KAČÁNIOVÁ, Jana PETROVÁ, Juraj MEDO, Lukáš HLEBA a Katarína ROVNÁ. Identification of lactic acid bacteria isolated from red wine samples by RT-QPCR. Slovak University of Agriculture in Nitra: Faculty of Biotechnology and Food Sciences, 2014. ISSN 1338-5178. KENNEDY, James,; Cédric SAUCIER a Yves GLORIES. Grape and Wine Phenolics: History and Perspective. [online]. 2006 [cit. 2012-03-19]. Dostupné z: http://www.researchgate.net/publication/257200044_grape_and_wine_phenolics_ History_and_perspective KOBLIŽKA, Vojtěch. Metodika sběru a zpracování hroznů na ústavu 556. Lednice, 2014, 6 s. KÖNIG, Helmut, Gottfried UNDEN a Jürgen FRÖHLICH. Biology of microorganisms on grapes, in must and in wine. Berlin: Springer, c2009, xviii, 522 p. ISBN 978-3-540-85462-3. KRAUS, V.; HUBÁČEK, V.; ACKERMANN, P. Rukověť vinaře. 3. vyd. Praha: Brázda, 2010. 267 s. ISBN 978-80-209-0378-5. KUBIŠTOVÁ, Vladimíra. Studium antioxidační aktivity vína. Olomouc, 2012. Diplomová práce. Univerzita Palackého v Olomouci. 84

LACHMAN, Jaromír, Miloslav ŠULC, Kateřina FAITOVÁ a Vladimír PIVEC. Major factors influencing antioxidant contents and antioxidant activity in grapes and wines. International Journal of Wine Research. 2009, 2009:1, s. 101-121. Dostupné z: http://www.researchgate.net/publication/49605868_major_factors_influencing_anti oxidant_contents_and_antioxidant_activity_in_grapes_and_wines LAVILLA, Joe a Doug WYNN. The wine, beer,: a guide to styles and service. Hoboken, N.J.: Wiley, c2010, xi, 513 p., [32] p. of plates. ISBN 04-701-3884-X. LI, Y.-G.; TANNER, G.; LARKIN, P. The DMACA-HCl protocol and the treshold proanthocyaninidin content for bloat safety in forage legumes. J. Sci. Food Agric. 1996, 70, 89-101. LÓPEZ, M, Maria N. BRAVO, Marilda M. PIRES, Ana T. SERRA, Catarina M. DUARTE, Luís V. BOAS a Maria R. BRONZE. Study of phenolic compounds as natural antioxidants by a fluorescence method. Talanta. 2003-06-13, vol. 60, 2-3, s. 609-616. DOI: 10.1016/S0039-9140(03)00191-7. Dostupné z: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/s0039914003001917 MENCARELLI, Fabio a Pietro TONUTTI. Sweet, reinforced, and fortified wines: grape biochemistry, technology, and vinification. Chichester: John Wiley & Sons, Ltd, 2013, xi, 357 p. ISBN 978-047-0672-242. MIKEŠ, O. Sledování změn obsahu fenolických kyselin v průběhu barikování vín. Vinařský obzor. Velké Bílovice: Svaz vinařů České republiky, 2004, č. 3. ISSN 1212-7884. MORENO-ARRIBAS, M a M POLO. Wine chemistry and biochemistry. New York: Springer, c2009, xv, 735 p. ISBN 9780387741185-. Nařízení rady (ES) č. 1493/1999: o společné organizaci trhu s vínem. Dostupné z: http://eurlex.europa.eu/legalcontent/cs/all/?uri=celex:31999r1493 OU, B.X., et al., Analysis of antioxidant activities of common vegetables employing oxygen radical absorbance capacity (ORAC) and ferric reducing antioxidant power (FRAP) assays: A comparative study. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2002. 50(11): p. 3122-3128. PACKER, Lester, Midori HIRAMATSU a Toshikazu YOSHIKAWA. Antioxidant food supplements in human health. San Diego: Academic Press, c1999, xxv, 511 p. ISBN 01-254-3590-8. 85

PAJERO, L., et al., Evaluation of scavenging activity assessed by Co(II)/EDTAinduced luminol chemiluminescence and DPPH center dot (2,2-diphenyl-1- picrylhydrazyl) free radical assay. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods, 2000. 44(3): p. 507-512. PAVLOUŠEK, Pavel. Encyklopedie révy vinné. Vyd. 1. Brno: Computer Press, 2007. ISBN 978-80-251-1704-0. PAVLOUŠEK, Pavel. Vinařský obzor: Odborný časopis pro vinohradnictví, sklepní hodpodářství a obchod vínem. Velké Bílovice: Svaz vinařů České republik, 2012, č. 9. ISSN 1212-7884. Phytochemicals: Antioxidants [online]. 2006 [cit. 2013-03-19]. Dostupné z: http://www.phytochemicals.info/antioxidants.php PULIDO, R.; BRAVO, L.; SAURA-CALIXO, F. Antioxidant activity of dietary polyphenols as determined by a modified ferric reducing/antioxidant power assay. J. Agric. Food Chem. 2000, 48, 3396-3402. RE, R., et al., Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay. Free Radical Biology and Medicine, 1999. 26(9-10): p. 1231-1237. RIBÉREAU-GAYON, Pascal, Denis DUBOURDIEU a Bernard DONÈCHE. Handbook of enology: The Microbiology of Wine and Vinifications. 2nd ed. Hoboken, NJ: John Wiley, 2006a, 2 v. ISBN 04-700-1037-1. RIBÉREAU-GAYON, Pascal, Denis DUBOURDIEU a Bernard DONÈCHE. Handbook of enology: The Chemistry of Wine Stabilization and Treatments. 2nd ed. Hoboken, NJ: John Wiley, 2006b, 2 v. ISBN 04-700-1037-1. SANDLER, Merton a Roger PINDER. Wine: a scientific exploration. New York: Taylor, 2003, xvi, 320 p. ISBN 04-152-4734-9. SOCHOR, J., et al., Fully Automated Spectrometric Protocols for Determination of Antioxidant Activity: Advantages and Disadvantages. Molecules, 2010. 15(12): p. 8618-8640. SOMERS, T.C.; EVANS, M.E. Spectral evaluation of young red wines: anthocyanin equilibria, total phemnolics, free and molecular SO 2, chemical age. J. Sci. Food Agric. 1977, 28, 279-287. 86

Spektrofotometrické metody: antioxidační kapacita, volné radikály. In: Vysoká Škola Chemicko-Technologická v Praze [online]. [cit. 2013-03-19]. Dostupné z: http://www.vscht.cz/ktk/www_324/lab/navody/obori/spektrofotometrie.pdf STÁVEK, J.; Likérová, dolihovaná vína. Vinařský obzor. Velké Bílovice: Svaz vinařů České republiky, 2006, č.7-8. ISSN 1212-7884. STÁVEK, J. Portské a ostatní fortifikovaná vína. Vyd. 1. Praha: Radix, 2005, 135s. ISBN 80-860-3161-6. STRATIL, Pavel,; Vlastimil KUBÁŇ a Jitka FOJTOVÁ. Comparison of the Phenolic Content and Total Antioxidant Activity in Wines as Determined by Spectrophotometric Methods [online]. 2008, Vol. 26, No. 4:, s. 242-253 [cit. 2013-03-19]. Dostupné z: http://www.agriculturejournals.cz/publicfiles/01961.pdf STRATIOTIS, A.L. a L.M.T. DICKS. Identification of Lactobacillus spp. Isolated from Different Phases During the Production of a South African Fortified Wine. Department of Microbiology, Stellenbosch University, Stellenbosch: South African Journal of Enology + Viticulture, 2002, č. 23. ISSN 0253-939X. ŠTÍPEK, S. a kol.: Antioxidanty a volné radikály ve zdraví a nemoci. Grada Publishing Avicenum, 2000. ISBN 80-7169-704-4. ŠVEJCAR Václav; Rudolf VOLDŘICH. Vinařství: technologie speciálních vín. 1. Vyd. Brno: Vysoká škola zemědělská v Brně, 1991,64 s. VERMERRIS, Wilfred a Ralph L NICHOLSON. Phenolic compound biochemistry. London: Springer, c2008, xii, 276 p. ISBN 14-020-9289-X. Zákon o spotřebních daních. In: č. 353/2003 Sb. 2003. Dostupné z: http://www.zakonyprolidi.cz/cs/2003-353 Zákon o vinohradnictví a vinařství a o změně některých souvisejících zákonů (zákon o vinohradnictví a vinařství). In: č. 321/2004 Sb. 2004. Dostupné z: http://www.zakonyprolidi.cz/cs/2004-321 ZOECKLIEN, B.W.; FUGELSANG, K.C.; GUMP, B.H.; NURY, F.S. Production Wine Analysis; Van Nostrand Reinhold Publ.: New York, 1990; s. 129-168. 87

11 PRÍLOHY PRÍLOHA č.1: LEGISLATÍVA LIKÉROVÝCH VÍN V ČR Zákon č. 321/2004 Zb. o vinohradníctve a vinárstve (Aktuálne znenie) 22 Likérové víno: (1) Likérové víno sa vyrába a označuje spôsobom stanoveným predpismi Európskej únie 63) a týmto zákonom. (2) Likérové víno sa môže označiť názvom "akostné likérové víno", ak: a) bolo vyrobené z vínnych strapcov zozbieraných na vinici vhodnej pre akostné víno stanovenej oblasti ( 5), ktoré boli zozbierané v rovnakej vinárskej oblasti, b) výroba vína použitého k výrobe akostného likérového vína prebehla vo vinárskej oblasti, v ktorej boli vinné strapce zozbierané, c) nebol prekročený hektárový výnos podľa 6 odsek 2, d) víno splňuje požiadavky na akosť stanovené prevádzajúcim právnym predpisom, e) víno bolo Inšpekciou zatriedené ako akostné likérové víno, f) víno splňuje požiadavky predpisov Európskej únie 63) (3) Etiketa akostného likérového vína obsahuje údaje stanovené predpismi Európskej únie 63) a ďalej tieto údaje: a) názov vinárskej oblasti, v ktorej bolo víno vyrobené, b) evidenčné číslo akosti. (4) Etiketa akostného likérového vína môže okrem údajov podľa odsekov 2 a 3 obsahovať a) názov odrody alebo odrôd, za podmienok stanovených predpisov Európskej únie; podiel každej odrody uvedenej na etikete musí činiť najmenej 15 %, b) ročník zberu, za podmienok stanovených predpisov Európskej únie 53a), c) názov vinárskej podoblasti, ak pochádzajú produkty užité k výrobe vína výlučne z tejto vinárskej podoblasti. 88

63) SÚVISIACA PRÁVNA ÚPRAVA: PRÍLOHA č. I bod 14 nariadenie Rady (ES) č. 1493/1999 Definícia produktov: Likérové víno: produkt, ktorý A. vykazuje: skutočný obsah alkoholu najmenej 15 % objemových a najviac 22 % objemových, celkový obsah alkoholu najmenej 17,5 % objemových, s výnimkou akostných likérových vín stanovených pestovateľských oblastí (akostných likérových vín s. o.), ktoré sú zapísané na zozname, ktorý bude zostavený; B. sa vyrába: a) z čiastočne skvaseného hroznového muštu alebo vína alebo zmesi čiastočne skvaseného hroznového muštu a vína alebo hroznového muštu alebo zmesi hroznového muštu s vínom u niektorých akostných likérových vín s. o., ktoré budú určené, v prípade likérových vín a akostných likérových vín s. o. musia vyššie uvedené produkty: pochádzať z odrôd viniča, ktoré sú vybrané z odrôd uvedených v čl. 42 odsek 5 a vykazovať prirodzený obsah alkoholu najmenej 12 % objemových, s výnimkou niektorých akostných likérových vín s. o. uvedených na zozname, ktorý bude zostavený; b) a za prídavku, i) samostatne alebo v zmesi, neutrálneho alkoholu vinného pôvodu, vrátane alkoholu získaného destiláciou sušených strapcov so skutočným obsahom alkoholu najmenej 96 % objemových, 64 CS Úradný vestník Európskej únie 03/sv. 26 destilátu z vína alebo sušených strapcov so skutočným obsahom alkoholu najmenej 52 % objemových a najviac 86 % objemových, ii) tak aj prípadne jedného alebo viac z týchto produktov: zahusteného hroznového muštu,

zmesi produktov uvedených v bodu i) s hroznovým muštom uvedeným pod písm. a) prvou a štvrtou odrážkou; iii) v prípade niektorých akostných likérových vín s. o. uvedených na zozname, ktorý bude zostavený: produktov podľa bodu i), samostatne alebo v zmesi alebo jedného alebo viac týchto produktov: destilátu z vína alebo sušených strapcov so skutočným obsahom alkoholu najmenej 95 % objemových a najviac 96 % objemových, vínovice alebo matolinovej pálenky so skutočným obsahom alkoholu najmenej 52 % a najviac 86% objemových, destilátu zo sušených strapcov so skutočným obsahom alkoholu najmenej 52 % objemových a nižším než 94,5 % objemových, tak aj prípadne jedného alebo viac z týchto produktov: čiastočne skvaseného hroznového muštu zo zaschnutých strapcov, zahusteného hroznového muštu získaného účinkom priameho ohňa, ktorý, ak sa odhliadne od tohto postupu, zodpovedá definícii zahusteného hroznového muštu, zahusteného hroznového muštu, zmesi jedného z produktov uvedených v druhej odrážke s hroznovým muštom uvedeným v písm. a) prvej a štvrtej odrážke. PRÍLOHA č. I bod 23 Alkoholizované víno: produkt, ktorý vykazuje skutočný obsah alkoholu najmenej 18 % objemových a najviac 24 % objemových, je získaný výhradne tým, že víno bez zostatkového cukru bolo alkoholizované prídavkom nerektifikovaného produktu pochádzajúceho z destilácie vína so skutočným obsahom alkoholu najviac 86 % objemových, vykazuje obsah prchavých kyselín vyjadrený prostredníctvom kyseliny octovej najviac 1,5 gramu na liter.

PRÍLOHA V bod J Medzné hodnoty a podmienky pre určité enologické postupy Likérové víno: 1. Pre výrobu likérových vín sa používajú tieto produkty: čiastočne skvasený hroznový mušt, víno, zmes vyššie uvedených produktov alebo hroznový mušt alebo zmes tohto produktu s vínom pre určité akostné likérová vína s. o. podľa zoznamu, ktorý bude zostavený. 2. Okrem toho sa pridávajú: a) u likérových vín a u akostných likérových vín s. o., s výnimkou akostných likérových vín s. o. uvedených pod písmenom b) i) tieto produkty, buď samostatne, alebo v zmesi: neutrálny alkohol, ktorý pochádza z destilácie vinárskych produktov, vrátane sušených vínnych strapcov, ktorého obsah alkoholu je najmenej 96 % objemových a ktorého vlastnosti zodpovedajú predpisom Spoločenstva, destilát z vína alebo sušených vínnych strapcov, ktorého obsah alkoholu je najmenej 52 % objemových a najviac 86 % objemových a ktorého vlastnosti zodpovedajú vlastnostiam, ktoré budú stanovené; ii) a prípadne jeden alebo viac z týchto produktov: zahustený hroznový mušt, produkt, ktorý bol získaný zmiešaním jedného alebo viac produktov uvedených v bodu i) s hroznovým muštom uvedeným v bodu 1 prvej alebo štvrtej odrážke; 03/sv. 26 CS Úradný vestník Európskej únie 81 b) u určitých akostných likérových vín s. o. podľa zoznamu, ktorý bude zostavený: i) buď produkty uvedené pod písm. a) bodom i), buď samostatne, alebo v zmesi, ii) alebo jeden či viac týchto produktov: alkohol vinného pôvodu alebo zo sušených vínnych strapcov, ktorého obsah alkoholu činí najmenej 95 % objemových a najviac 96 % objemových a ktorého

vlastnosti zodpovedajú predpisom Spoločenstva alebo, ak nie je táto oblasť predpismi Spoločenstva nijak upravená, príslušnými vnútroštátnymi predpismi, pálenka z vína alebo matolinová pálenka, ktorej obsah alkoholu činí najmenej 52 % objemových a najviac 86 % objemových a ktorej vlastnosti zodpovedajú predpisom Spoločenstva alebo, ak nie je táto oblasť predpismi Spoločenstva nijak upravená, príslušnými vnútroštátnymi predpismi,, pálenka zo sušených vínnych strapcov, ktorej obsah alkoholu činí najmenej 52 % objemových a najviac 94,5 % objemových a ktorej vlastnosti zodpovedajú predpisom Spoločenstva alebo, ak nie je táto oblasť predpismi Spoločenstva nijak upravená, príslušnými vnútroštátnymi predpismi,; iii) tak aj prípadne jeden alebo viac týchto produktov: čiastočne skvasený hroznový mušt zo zaschnutých vínnych strapcov, zahustený hroznový mušt získaný pôsobením priameho ohňa, ktorý, ak odhliadneme od tohto postupu, zodpovedá definícii zahusteného hroznového muštu, zahustený hroznový mušt, produkty získané zmiešaním jedného alebo viacerých produktov uvedených v bode ii) s hroznovým muštom uvedeným v bode 1 prvej alebo štvrtej odrážke. 3. Produkty uvedené v bode 1 slúžiace k výrobe likérových vín a akostných likérových vín s. o. môžu byť spracovávané iba enologickými postupmi stanovenými v tomto nariadení. 4. Avšak: a) zvýšenie prirodzeného obsahu alkoholu je možno uskutočniť iba za použitia produktov uvedených v bode 2; b) môžu byť pre určité produkty stanovené odchýlky oprávňujúce členský štát povoliť použitie síranu vápenatého, pokiaľ ide o tradičný postup a obsah síranov takto pripravovaného produktu neprekročí hodnotu 2,5 gramu na liter, vyjadrených ako síran draselný. Takto získané produkty môžu byť doplnkovo prikyslené kyselinou vinnou až do 1,5 gramu na liter. 5. Bez toho, aby boli dotknuté prísnejšie predpisy, ktoré môžu členské štáty vydávať pre likérová vína a akostné likérová vína s. o. vyrábané na ich území, sú u týchto produktov povolené enologické postupy a ošetrenie stanovené v tomto nariadení.

6. Taktiež je povolené: a) sladenie uvedené v prehlásení a evidencii, pokiaľ u užitých produktov neprebehlo obohatenie zahusteným hroznovým muštom, pomocou zahusteného hroznového muštu alebo rektifikovaného muštového koncentrátu, pokiaľ zvýšenie celkového obsahu alkoholu dotyčného vína nepresiahne 3 % objemové, zahusteného hroznového muštu alebo rektifikovaného hroznového muštu či čiastočne skvaseného hroznového muštu zo sušených vínnych strapcov v prípade produktov uvedených na zozname, ktorý bude zostavený, pokiaľ zvýšenie celkového obsahu alkoholu dotyčného vína nepresiahne 8 % objemových, zahusteného hroznového muštu alebo rektifikovaného muštového koncentrátu v prípade vín podľa zoznamu, ktorý bude zostavený, pokiaľ zvýšení celkového obsahu alkoholu dotyčného vína nebude činiť viac ako 8 % objemových; b) pridanie liehu, destilátu alebo pálenky z vína uvedených v bodoch 1 a 2, aby sa vyrovnali straty, ktoré vzniknú odparením počas zretia; c) zretie pri teplote nepresahujúcej 50 C v prípade produktov uvedených na zozname, ktorý bude zostavený. 82 CS Úradný vestník Európskej únie 03/sv. 26 7. Bez toho, aby boli dotknuté prísnejšie predpisy, ktoré môžu členské štáty vydávať pre likérová vína a akostné likérová vína s. o. vyrábané na ich území, nemôže obsah oxidu siričitého pre likérové vína a akostné likérová vína s. o. v okamžiku ich dodania k priamej ľudskej spotrebe prekročiť tieto hodnoty: a) 150 miligramov na liter, pokiaľ je obsah zostatkového cukru nižší ako 5 gramov na liter; b) 200 miligramov na liter, pokiaľ je obsah zostatkového cukru vyšší ako 5 gramov na liter. 8. Odrody viniča, z ktorých pochádzajú produkty užité k príprave likérových vín a akostných likérových vín s. o. uvedené v bodu 1, sú vyberané z odrôd viniča uvedených v čl. 42 odsek 5. 9. Prirodzený obsah alkoholu produktov uvedených v bodu 1, ktoré boli použité k výrobe iného likérového vína ako akostného likérového vína s. o., musí byť najmenej 12 % objemových.

ZÁKON č. 353 / 2003 Zb., O SPOTREBNÝCH DANIACH Časť druhá: Zvláštne ustanovenia Hlava IV: Daň z vína a medziproduktov 93 Predmet dane z vína a medziproduktov (1) Predmetom dane pre účely tohto zákona sú vína a fermentované nápoje (ďalej iba "vína") a medziprodukty uvedené pod kódy nomenklatúry 2204, 2205, 2206, ktoré obsahujú viac ako 1,2 % objemových alkoholu, najviac však 22 % objemových alkoholu (3) Tichým vínom sa pre účely tohto zákona rozumejú výrobky, ktoré nie sú šumivým vínom vymedzeným v odseku 2 a ktoré sú uvedené pod nasledujúcimi kódmi nomenklatúry: a) 2204 a 2205, ktorých skutočný obsah alkoholu presahuje 1,2 % objemových, ale nepresahuje 15 % objemových, ak je alkohol, ktorý je obsiahnutý v hotovom výrobku, plne kvasného pôvodu bez prídavku liehu, b) 2204 a 2205, ktorých skutočný obsah alkoholu presahuje 15 % objemových, ale nepresahuje 18 % objemových, pokiaľ boli vyrobené bez akéhokoľvek obohacovania a ak je alkohol, ktorý je obsiahnutý v hotovom výrobku, plne kvasného pôvodu bez prídavku liehu, c) 2204 a 2205, ak nie sú uvedené v písmene a) alebo b), a 2206, ak nepodliehajú dani z piva, ak skutočný obsah alkoholu u takých výrobkov presahuje 1,2 % objemových, ale nepresahuje 10% objemových, alebo d) 2206, pokiaľ nepodliehajú dani z piva, ktorých skutočný obsah alkoholu presahuje 10 % objemových, ale nepresahuje 15 % objemových, ak je alkohol, ktorý je obsiahnutý v hotovom výrobku, plne kvasného pôvodu bez prídavku liehu. (4) Medziproduktmi sa pre účely tohto zákona rozumejú všetky výrobky, ktoré sú uvedené pod kódmi nomenklatúry 2204, 2205 a 2206, ktorých skutočný obsah alkoholu presahuje 1,2 % objemových, ale nepresahuje 22 % objemových, ktoré nie sú šumivým ani tichým vínom, alebo nepodliehajú dani z piva. 96 Sadzby dane z vína a medziproduktov: Sadzby dane sú stanovené takto: Medziprodukty podľa 93 odsek. 4-2340 kč/hl

PRÍLOHA č.2 100 - bodová tabuľka hodnotenia vín (podľa OIV) PRÍLOHA č.3 Vyrobené vzorky fortifikovaných vín v označovanom poradí