VRIJEDNOSTI GLUKOZE I UKUPNIH PROTEINA LABORATORIJSKIH PACOVA U USLOVIMA KRATKOTRAJNOG GLADOVANJA GLUCOSE AND TOTAL PROTEIN LEVEL IN LABORATORY RATS UNDER CONDITIONS OF SHORT-TERM FASTING Suljević D., Hasković E., Mitrašinović Maja Abstract Glucose level (UV enzymatic method) and total protein level (Biuret method) were measured in the blood samples of the rats exposed to short-term starvation. We found a statistically significant increase in the glucose level in experimental animals during starvation, which is also evident in males and females in the experimental group (p <0.05), while decrease in the total protein level was not statistically significant. During starvation, more significant weight loss was observed in females compared to males. Key words: glucose, total protein, serum, Rattus Kratak sadrţaj - Vrijednosti koncentracije glukoze (UV enzimatska metoda) i totalnih proteina (Biuret metoda) odreċene su u krvi pacova podvrgnutih kratkotrajnom gladovanju. Konstatovano je statistiĉki znaĉajno povećanje koncentracije glukoze kod eksperimentalnih jedinki za vrijeme gladovanja, koje je takoċer evidentno kod muţjaka i ţenki eksperimentalne grupe (p <0,05), dok smanjenje koncentracije ukupnih proteina nije statistiĉki signifikantno. Prilikom gladovanja zabiljeţen je veći gubitak mase tijela kod ţenki u odnosu na muţjake. Kljuĉne rijeĉi: glukoza, ukupni proteini, serum, Rattus Mr. sc. Suljević Damir, biolog, asistent; suljevic.damir@gmail.com; dr. sc. Hasković Edhem, vanredni professor; mr. sc. Mitrašinović Maja, biolog, viši asistent: Odsjek za biologiju, Prirodno-matematiĉki fakultet, Univerzitet u Sarajevu Suljević Damir, MSc, Biologist, Assistant; Hasković Edhem, PhD, Associate Professor; Mitrašinović Maja, Biologist, Senior Assistant: Department of Biology, Faculty of Science, University of Sarajevo Veterinaria 58 (3-4),191-199, Sarajevo 2009. 191
Uvod Svako odstupanje od normalnog reţima ishrane dovodi u pitanje normalno odvijanje metaboliĉkih procesa u organizmu ţivotinja i ĉovjeka. Faktori neophodni za ishranu dijele se na nespecifiĉne materije (sluţe za proizvodnju energije, rast i razvoj) i specifiĉne, koje organizam ne sintetiše u adekvatnim koliĉinama i one moraju biti nadopunjene zbog neophodnosti za metabolizam, rast i razvoj (4). Glad se moţe opisati kao nepovoljno tjelesno stanje koje ţivotinje i ljude nagoni na uzimanje hrane. Regulacija gladi i sitosti kod ljudi, a i kod ţivotinja je vrlo kompleksan proces u kojem uĉestvuju brojni faktori, meċu kojima mnogi nisu istraţeni (7). Jedinke koje su izloţene gladovanju imaju znatno intezivniju razmjenu vode izmeċu tkivnih stanica iscrpljenih nutritivnim defektom i ekstracelularnog prostora. OdreĊivanje proteina u plazmi je od velikog znaĉaja za ocjenjivanje stanja metabolizma proteina. Nagli gubitak tjelesne mase i jaĉe izraţena mršavost predstavljaju znakove koji snaţno govore u prilog postojanju proteinske deficitarnosti. Ako je unos hrane preobilan, pa prema tome unos energije veći od potrošnje, suvišak energije se pohranjuje u obliku masti, pri ĉemu se povećava tjelesna masa. Ako je unos energije nedovoljan za metaboliĉke potrebe tijela, organizam gladuje, tjelesna masa se smanjuje (9). Gladovanje se moţe podijeliti na akutno i hroniĉno (2). Prema lipostatskoj teoriji, hormon leptin, koji se stvara u masnom tkivu ima znaĉajnu ulogu u procesu gladovanja i što je manje leptina u krvi, javlja se izraţeniji osjećaj gladi. Prema glikostatskoj teoriji, biohemijske promjene u krvi signaliziraju glad i sitost (8). Tokom gladovanja troše se tjelesne zalihe: prvo se troše rezerve glikogena iz jetre i mišića u toku nekoliko sati, a zatim rezerve masti i na kraju proteina. Lipidi se razgraċuju do ketonskih tijela koja postaju glavno staniĉno energetsko gorivo. Bazalni metabolizam se smanjuje i do 40% kao posljedica smanjenog luĉenja hormona, prvenstveno hormona štitnjaĉe. Osim ovoga, kao posljedica akutnog gladovanja javlja se: smanjenje plazmatske koncentracije K, Mg i P, smanjenje srĉane i bubreţne mase, smanjen je i minutni volumen srca kao i smanjenje glomerularne filtracije (3). Hroniĉno gladovanje se naziva i opća pothranjenost koja nastaje kao primarna bolest, ali i sekundarno zbog neprimjerenog iskorištavanja hranjivih tvari. U ovom sluĉaju ĉesto dolazi i do hipovitaminoze (2). Istraţivanja sprovedena na miševima pokazala su da hormon leptin ima vaţnu ulogu u nastanku osjećaja gladi izmeċu obroka (8). Osnovni cilj ovoga eksperimenta je usmjeren na utvrċivanje vrijednosti koncentracije glukoze i ukupnih proteina tokom gladovanja u serumu laboratorijskih pacova u kontrolisanim uvjetima. 192
Materijal i metode Glodari se smatraju najbrojnijom skupinom u okviru klase sisara i imaju široko rasprostranjenje na planeti Zemlji. Zahvaljujući snaţnim evolucionim faktorima veoma su divergirali. Odlikuju se izrazitom plodnošću. Ţenke raċaju nekoliko puta godišnje po više mladunaca. Rattus norvegicus (soj Wistar) u Evropu se doselio iz Azije prije dva vijeka. Ova vrsta je odliĉan plivaĉ zbog ĉega ga nazivaju vodeni pacov. Prekriveni su bijelom bojom krzna, a ima varijateta sa smeċom i crnom bojom krzna. Ţivotni vijek u kavezu je ĉetiri godine. Jedinke korištene u ovom eksperimentu uzgajane su u vivariju Odsjeka za biologiju Prirodno-matematiĉkog fakulteta, Univerziteta u Sarajevu. U ovom radu koristili smo 29 jedinki pacova, od ĉega je deset individua korišteno kao kontrolna grupa (5 i 5 ) i 19 jedinki eksperimentalne grupe (10 i 9 ). Sve jedinke su bile starosne dobi sedam mjeseci. OdreĊivanje mase tijela. Prije izvoċenja eksperimenta sve jedinke su razvrstane po spolovima u namjenski pripremljene kaveze. OdreĊivanje spola izvršeno je vizuelnim prepoznavanjem. Masa tijela odreċena je pomoću precizne digitalne vage. Mjerenja su izvoċena dva puta: prvi put nakon odabira i razvrstavanja jedinki, a drugi put nakon tri dana totalnog gladovanja. Priprema jedinki za uzimanje krvi. Kod svih jedinki krv je uzimana direktnom metodom punkcije krvi iz srca bez korištenja antikoagulansa. Krv dobivena ovom metodom prenesena je u centrifugalne epruvete i nakon stajanja 60 min. pri sobnoj temperaturi izvršeno je centrifugiranje na 3.500 rpm u trajanju od 10 min. Nakon centrifugiranja izdvojen je krvni serum i pristupilo se biohemijskoj analizi (5). Biohemijska analiza. U krvnom serumu smo odredili koncentraciju glukoze i ukupnih proteina spektrofotometrijski. OdreĊivanje koncentracije glukoze izvršeno je UV metodom sa heksokinazom pri valnoj duţini od 340 nm, dok je koncentracija ukupnih proteina u serumu odreċivana spektrofotometrijski Biuret metodom pri 546 nm. Statistiĉka obrada podataka. Svi rezultati istraţivanja su obraċeni metodama deskriptivne i analitiĉke statistike (1, 6), uz primjenu statistiĉkog programa Microsoft Excel. Rezultati Nakon biohemijske analize i dobivenih rezultata za vrijednosti koncentracije glukoze i ukupnih proteina izvršena je statistiĉka obrada podataka, a rezultati su prikazani u tabelama, kako slijedi. Posmatrajući srednje vrijednosti glukoze u serumu pacova moţemo vidjeti da je ona iznosila 3,48 mmol/l, što je niţa vrijednost od donje referentne vrijednosti za ĉovjeka i većinu drugih sisara (tab. 1). Gledano po spolnoj strukturi muţjaci imaju nešto niţu vrijednost koncentracije glukoze (3,16 mmol/l), u odnosu na ţenke, gdje je zabiljeţena Veterinaria 58 (3-4),191-199, Sarajevo 2009. 193
srednja vrijednost od 3,8 mmol/l. Kada su u pitanju ukupni proteini, prosjeĉna vrijednost jedinki iz kontrolne grupe iznosila je 74,05 g/l, pri ĉemu muţjaci imaju veću vrijednost (75,84 g/l) u odnosu na ţenke gdje je srednja vrijednost koncentracije proteina iznosila 72,25 g/l. Tabela 1. Vrijednosti koncentracije glukoze i ukupnih proteina u serumu kontrolne grupe pacova Table 1. Glucose and total protein level in serum of control group rats Glukoza Proteini (mmol/l) (g/l) Parametar (n=10) (n=5) (n=5) (n=10) (n=5) (n=5) X 194 3,48 3,16 3,80 74,05 75,84 72,25 Min 2,37 2,37 2,37 60,70 60,70 65,55 Max 4,75 3,96 4,75 94,20 89,30 94,20 Std 0,76 0,56 0,86 11,62 12,03 12,28 V % 21,83 17,72 22,63 15,69 15,86 16,31 Tabela 2. Vrijednosti koncentracije glukoze i ukupnih proteina u serumu eksperimentalne grupe pacova Table 2. Glucose and total protein level in serum of experimental group rats Glukoza Proteini (mmol/l) (g/l) Parametar X (n=19) (n=10) (n=9) (n=19) (n=10) (n=9) 5,98 6,15 5,79 66,87 73,10 59,95 Min 4,44 4,90 4,44 45,39 46,73 45,39 Max 7,77 7,40 7,77 106,44 106,44 71,05 Std 1,01 0,97 1,07 17,73 21,14 10,10 V % 16,88 15,77 18,48 26,51 28,91 16,84 Analizom rezultata iz tabele 2., moţe se vidjeti da je srednja vrijednost koncentracije glukoze kod eksperimentalne grupe ţivotinja iznosila 5,98 mmol/l. Kod muţjaka srednja vrijednost koncentracije glukoze je iznosila 6,15 mmol/l, što je znatno veće u odnosu na istu kod ţenki koja je iznosila 5,79 mmol/l. Srednja vrijednost koncentracije ukupnih proteina iznosila je 66,87 g/l, sa znatno većim vrijednostima kod muţjaka (73,10 g/l) u odnosu na ţenke (59,95 g/l). Nakon toga dobivene rezultate smo komparirali i analizirali preko studentovog t-testa signifikantnosti dobijenih razlika. Rezultati su prikazani u tabeli 3. Kako se moţe konstatovati na osnovu rezultata predstavljenih u tabeli 3., vrijednosti koncentracije glukoze rastu kod eksperimentalne grupe pacova u odnosu na kontrolnu, o ĉemu govori vrijednost p (p<0,05). Muţjaci iz eksperimentalne grupe kao i ţenke imaju takoċer signifikantno veće vrijednosti koncentracije glukoze u odnosu na muţjake i ţenke iz kontrolne grupe. Kada su u pitanju vrijednosti proteina, kontrolna
grupa jedinki ima veću vrijednost koncentracije proteina u odnosu na eksperimentalnu grupu, ali razlika nije signifikantna, o ĉemu govori vrijednost p (p 0,05). Muţjaci iz eksperimentalne grupe imaju neznatno manju vrijednost koncentracije ukupnih proteina u odnosu na muţjake iz kontrolne grupe i ta razlika takoċer nije statistiĉki znaĉajna. S druge strane, kod ţenki iz eksperimentalne grupe zabiljeţen je znatan pad vrijednosti koncentracije ukupnih proteina (59,95 g/l) u odnosu na ţenke iz kontrolne grupe gdje je srednja vrijednost iznosila 72,25 g/l. Razlika nije statistiĉki znaĉajna, što se moţe pripisati vjerovatno veliĉini uzorka. Tabela 3. Komparativni pregled analiziranih biohemijskih parametara u serumu kontrolne i eksperimentalne grupe pacova u uslovima gladovanja Table 3. Comparative overview of analyzed biochemical parameters in serum of control and experimental group rats under conditions of starvation Parametar Glukoza (mmol/l) Proteini (g/l) Kontrolna grupa ( X ) 3,48 3,16 3,80 74,05 75,84 72,25 Eksp. grupa ( X ) 5,98 6,15 5,79 66,87 73,10 59,95 T test p < 0,05 p < 0,05 p < 0,05 p 0,05 p 0,05 p 0,05 Pored ovih biohemijskih parametara analizirali smo i razlike u tjelesnoj masi kontrolne i eksperimentalne grupe po spolovima. Rezultati su prikazani u tabeli 4. Tabela 4. Komparativni pregled mase tijela po spolovima Table 4. Comparative review of body mass by gender Grupa Spol Prvo mjerenje Σ (g) Drugo mjerenje Σ (g) Razlika Σ (g) Kontrola n = 5 1221 1398 + 177 n = 5 1241 1362 + 121 n = 10 2462 2760 +298 n = 10 2832 2440-392 Eksperiment n = 9 2170 1620-550 n = 19 5002 4060-942 U tabeli 4., date su vrijednosti mase tijela kontrolne i eksperimentalne grupe. Mjerenja su izvršena dva puta u vremenskom razmaku od tri dana. Sve jedinke su bile iste uzrasne kategorije. Ukupna masa tijela jedinki kontrolne grupe na poĉetku eksperimenta iznosila je 2462 g, a nakon tri dana 2760 g. Dobijena razlika iznosila je 298 g. Ukupna masa tijela muţjaka kontrolne grupe na poĉetku eksperimenta iznosila je 1221 g, a nakon tri dana 1398 g. Dobijena razlika iznosila je 177 g. Masa tijela ţenki kontrolne grupe na poĉetku eksperimenta iznosila je 1241 g, a nakon tri dana 1362 g. Dobijena razlika iznosila je 121 g. Ukupna masa eksperimentalne grupe iznosila je 5002 g, a nakon tri dana gladovanja 4060 g, što predstavlja gubitak od 942 g. Masa tijela muţjaka iznosila Veterinaria 58 (3-4),191-199, Sarajevo 2009. 195
je 2832 g, a nakon tri dana 2440 g, što ĉini ukupni gubitak od 392 g. Na poĉetku eksperimenta ţenke su imale manju masu u odnosu na muţjake (2170 g), a nakon tri dana 1620 g, dok je ukupni gubitak iznosio 550 g. TakoĊer smo analizirali moguću korelaciju izmeċu mase tijela i ispitivanih biohemijskih parametara kod eksperimentalne grupe pacova. Ti rezultati su prikazani u tabeli 5. Tabela 5. Korelacija biohemijskih parametara i mase tijela eksperimentalne grupe pacova Table 5. Correlation of biochemical parameters and body mass of experimental group rats Spol Masa Σ (g) Glukoza (mmol/l) Proteini (g/l) - 430 6.15 73.10 + + -550 5.79 59.95 - + Gubitak mase tijela je u pozitivnoj korelaciji sa koncentracijom glukoze i proteina kod muţjaka, dok kod ţenki imamo negativnu korelaciju glukoze, a pozitivnu proteina. Ovakva reakcija je razumljiva: gubitak mase tijela uvjetovan je razgradnjom glikogena i povećanom lipolizom da bi se nadoknadila glukoza, što je uvjetovalo povećanje koncentracije glukoze u krvi i to znaĉajnije u odnosu na iste vrijednosti kod ţenki. Kod ţenki dolazi do većeg gubitka mase tijela, što je u negativnoj korelaciji sa vrijednostima glukoze, a pozitivnoj u odnosu na vrijednosti proteina. Ţenke su izgubile veću masu tijela, što je posljedica intezivnije glikogeneze i lipolize. Zbog manjka glukoze u organizmu ţenki usljed intezivnijeg metabolizma (gravidnost) dolazi do pojaĉane glukoneogeneze, odnosno razgradnje proteina da bi se nadoknadile potrebe glukoze, a što ima za posljedicu pad koncentracije proteina kod ţenki. Diskusija Kako smo već spomenuli, pacovi imaju veoma nisku koncentraciju glukoze u serumu. S druge strane, muţjaci pacova imaju niţe vrijednosti glukoze u serumu i s obzirom na niţe vrijednosti V% individualne razlike su ujednaĉenije kod muţjaka u odnosu na ţenke. Ovo moţe biti posljedica razliĉitog metabolizma ţenki u odnosu na muţjake, jer ţenke ostaju nekoliko puta godišnje u gravidnom stanju, što je vjerovatno posljedica ovakve vrijednosti koncentracije glukoze. Vrijednosti koncentracije ukupnih proteina su u granicama referentnih vrijednosti za sisare i spolne specifiĉnosti nisu toliko izraţene kao što je sluĉaj sa vrijednostima za glukozu. U uslovima kratkotrajnog gladovanja dolazi do porasta koncentracije glukoze u odnosu na kontrolnu grupu, a takoċer evidentan je porast kada je u pitanju razlika u odnosu na spol. Kod muţjaka u gladovanju konstatovan je veći porast koncentracije glukoze u odnosu na ţenke, dok u normalnim uslovima, kako smo već rekli, ţenke imaju 196
veće vrijednosti koncentracije glukoze u serumu. Ta razlika je statistiĉki signifikantna što se moţe objasniti većim intenzitetom metabolizma kod ţenki. Koncentracija ukupnih proteina u serumu pacova u gladovanju pada u odnosu na kontrolnu grupu, pri ĉemu je posebno izraţen pad kod ţenki. Kod muţjaka su zabiljeţene nešto niţe vrijednosti ukupnih proteina u odnosu na kontrolne muţjake, ali ta razlika je neznatna. Glukoza 6,15 5,79 3,48 3,8 3,16 3,8 Kontrola Eksperiment Grafikon 1. Vrijednosti glukoze kod ispitivanih pacova Graph 1. Glucose level in the tested rats Pad koncentracije proteina u uslovima gladovanja evidentan je, prvenstveno kod ţenki, kod kojih dolazi do naglog pada ovog ispitivanog parametra. U uslovima gladovanja evidentne su razlike u gubitku mase muţjaka i ţenki koje su izgubile znaĉajno više mase u odnosu na muţjake. Ovakva posljedica gubitka mase tijela kod ţenki više nego kod muţjaka moţe biti posljedica razlika u intenzitetu metabolizma ili gravidnosti. Na osnovu grafiĉkog prikaza evidentno je povećanje koncentracije glukoze u uslovima gladovanja. Ovo je posljedica mobilizacije glukoze iz depoa (jetra i mišići) kao i trošenja zaliha masti iz adipocita kako bi organizam imao na raspolaganju dovoljnu koliĉinu glukoze što je poznata pojava. Smanjenje koncentracije proteina je vjerovatno uslovljeno korištenjem proteina u kataboliĉke procese kako bi organizam u vrijeme kratkotrajnog gladovanja mogao imati na raspolaganju potrebne aminokiseline za sintezu regulatornih supstanci kao što su hormoni i enzimi, ali i drugih fiziološki aktivnih materija. Na osnovu rezultata prikazanih na grafikonu moţe se konstatovati smanjenje koncentracije proteina u serumu pacova u uslovima kratkotrajnog gladovanja. Ovo je rezultat pojaĉanog katabolizma bjelanĉevina, o ĉemu smo već diskutovali. Veterinaria 58 (3-4),191-199, Sarajevo 2009. 197
Ukupni proteini 74,05 75,84 66,87 73,1 72,25 59,95 Kontrola Eksperiment Grafikon 2. Vrijednosti ukupnih proteina kod ispitivanih pacova Graph 2. Total proteins level in the tested rats Zakljuĉci Na osnovu dobivenih rezultata istraţivanja moţe se zakljuĉiti: Vrijednosti koncentracije glukoze u serumu pacova su znatno niţe u odnosu na iste vrijednosti u serumu sisara, dok je koncentracija ukupnih proteina u intervalu referentnih vrijednosti za sisare. Muţjaci imaju niţe vrijednosti glukoze u odnosu na ţenke, dok se vrijednosti ukupnih proteina ne razlikuju po spolovima. Tokom gladovanja evidentan je i statistiĉki signifikantan porast koncentracije glukoze, što se takoċer moţe uoĉiti kada se posmatraju vrijednosti glukoze po spolovima. Vrijednosti koncentracije ukupnih proteina su mnogo niţe tokom gladovanja, a posebno niske vrijednosti evidentne su u serumu ţenki u periodu kratkotrajnog gladovanja, meċutim, dobiveni rezultati nisu statistiĉki znaĉajni. Za vrijeme gladovanja evidentan je rapidan gubitak mase tijela posebno karakteristiĉan za ţenke koje brţe gube masu u odnosu na muţjake. Kod muţjaka kontrolne grupe koji su redovito hranjeni zabiljeţeno je veće povećanje mase tijela u odnosu na ţenke, dok ţenke za vrijeme gladovanja brţe gube masu tijela. LITERATURA 1. Fowler J, Cohen L, Jarvis P. Practical Statistics for Field Biology. 2 izd. England;1998. 198
2. Gamulin S, Martušić M. Patofiziologija. Zagreb: Medicinska naklada; 1998. 3. Guyton i Hall. Medicinska fiziologija. Zagreb: Medicinska naklada; 2003. 4. Hasković E. Uticaj gladovanja na koncentraciju proteina i aktivnost enzima u serumu stanovnika Dobrinje (magistarski rad), Sarajevo; 1997. 5. Hasković E, Ivanc A, Mitrašinović M. Praktikum iz Uporedne fiziologije ţivotinja i ĉovjeka. Sarajevo: Odsjek za biologiju Prirodno-matematiĉkog fakulteta; 2004. 6. Petz B. Osnovne statistiĉke metode za nematematiĉare. Drugo izdanje, Zagreb: SNL;1985. 7. Pollmer U, Warmuth S. Lexikon der populären Ernährungsirrtümer. München; 2006. 8. Provencher L, Reichart SE. 1991: Short-Term Effects of Hunger Conditioning on Spider Behavior, Predation, and Gain of Weight Oikos.1991; 62: 160-166. 9. Stojić V. Veterinarska fiziologija. Beograd: Nauĉna knjiga,; 1996. Uredništvo primilo rukopis 26. 10. 2009. Veterinaria 58 (3-4),191-199, Sarajevo 2009. 199