ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG TẠO FLOC VÀ XỬ LÝ AMMONIA CỦA VI KHUẨN Pseudomonas spp. PHÂN LẬP TỪ AO NUÔI TÔM CÔNG NGHIỆP

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG TẠO FLOC VÀ XỬ LÝ AMMONIA CỦA VI KHUẨN Pseudomonas spp. PHÂN LẬP TỪ AO NUÔI TÔM CÔNG NGHIỆP Phan Công Hoàng*, Lê Bảo & Hoàng Tùng Khoa Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Quốc Tế - ĐHQG TPHCM TÓM TẮT Công nghệ biofloc là giải pháp tiên tiến cho nghề nuôi tôm trên toàn thế giới. Nhờ việc bổ sung cơ chất carbon vào hệ thống nuôi với tỉ lệ C/N được duy trì ở mức thích hợp, giúp vi khuẩn dị dưỡng phát triển vừa xử lý chất thải trong môi trường nuôi vừa tạo nguồn thức ăn bổ sung cho đối tượng nuôi. Nghiên cứu này phân lập Pseudomonas spp. từ hệ thống biofloc, đánh giá khả năng tạo floc và xử lý ammonia của Pseudomonas pseudoalcaligenes và Pseudomonas stutzeri trong 3 môi trường nuôi cấy khác nhau (DD1, DD2 và DD3). Các chủng được chọn để kiểm tra khả năng tạo floc thông qua hoạt tính lắng cho kết quả không khác nhau ý nghĩa (>53%). Kết quả cho thấy 2 chủng P. pseudoalcaligenes xử lý ammonia tốt hơn P. stutzeri (84% so với 54,7% sau 6 giờ) (P<0,05). Ngoài ra, trong môi trường DD3 cả 3 chủng vi khuẩn đều xử lý ammonia tốt hơn so với môi trường DD1 và DD2 (P<0,05). Các kết quả của nghiên cứu này cung cấp thêm thông tin hữu ích cho việc sử dụng Pseudomonas pseudoalcaligenes và Pseudomonas stutzeri làm probiotic trong hệ thống nuôi tôm theo công nghệ biofloc. Từ khóa: khả năng tạo floc, Pseudomonas pseudoalcaligenes, Pseudomonas stutzeri, xử lý ammmonia MỞ ĐẦU Nghề nuôi tôm của Việt Nam đang đóng góp tích cực vào sự phát triển kinh tế. Năm 2012, tổng kim ngạch xuất khẩu tôm là 2,25 tỉ đô la Mỹ, trong đó 32,8% là tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) (VASEP, 2013). Tôm thẻ chân trắng phần lớn được nuôi theo mô hình công nghiệp, với mật độ cao, và lượng chất thải lớn, do đó dễ dẫn đến ô nhiễm môi trường và nguy cơ bùng phát dịch bệnh. Công nghệ biofloc hiện được xem là một giải pháp hữu hiệu để khắc phục các hạn chế của nuôi tôm thẻ chân trắng ở qui mô công nghiệp (Avnimelech, 2009; Crab và cộng sự, 2012). Công nghệ này cho phép giảm thiểu việc thay nước, tạo điều kiện phát triển hệ vi khuẩn dị dưỡng thông qua đó xử lý chất thải hữu cơ, tạo nguồn thức ăn bổ sung và ức chế sự phát triển của các nhóm vi khuẩn gây bệnh (De Schryver và cộng sự, 2008, Taw và cộng sự, 2008, Avnimelech, 1999). Theo công nghệ biofloc, các cơ chất có chứa carbon hữu cơ rẻ tiền như mật rỉ đường, bột sắn, bột mì hay cám gạo được bổ sung vào nước ao cân đối với lượng chất thải sao cho tỉ lệ C/N ở mức tối thiểu là 10/1 để vi khuẩn dị dưỡng có thể phát triển. Việc nghiên cứu, xác định các chủng vi khuẩn có khả năng tạo floc, xử lý chất thải và điều kiện thuận lợi cho chúng phát triển vì thế hết sức quan trọng. Pseudomonas spp. là nhóm vi khuẩn đa dạng, phổ biến và có ý nghĩa về mặt sinh thái. Chúng đóng vai trò quan trọng trong chu trình chuyển hóa carbon và nitrogen nhờ vào hệ enzyme phong phú (Spiers và cộng sự, 2000). Đây là nhóm vi khuẩn di động hiếu khí, có hình que và gram âm được tìm thấy trong môi trường sống tự nhiên như đất, nước ngọt, môi trường biển. Theo Tripathy và cộng sự (2007), một số chủng Pseudomonas có khả năng kiểm soát sinh học và làm sạch môi trường. Ngoài ra, nhu cầu dinh dưỡng của chúng cũng khá đơn giản. Trong nghiên cứu này chúng tôi phân lập Pseudomonas spp. từ mẫu nước ao nuôi tôm áp dụng công nghệ biofloc, sau đó đánh giá khả năng tạo floc (flocculating activity FA) và xử lý nitrogen dạng ammonium (NH 4-N) của các chủng phân lập được. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Thu mẫu nước và tạo biofloc Nước ao nuôi tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) ở tháng thứ 2 tại Xuyên Mộc, Bà Rịa Vũng Tàu được dùng để xử lý tạo biofloc bằng cách cho 10 lít nước ao vào bình nhựa hình trụ, thể tích 20 lít. Thí nghiệm tạo biofloc có 2 nghiệm thức khác nhau về nguồn cơ chất carbon là mật rỉ đường kết hợp với đường sucrose theo tỉ lệ 1:1 (nghiệm thức 1) và bột mì (nghiệm thức 2). Tỉ lệ C/N trong các nghiệm thức được tính xấp xỉ 20/1 và được bổ sung khi bắt đầu thí nghiệm (được tính là thời điểm 0 giờ). Độ ph và hàm lượng oxy hòa tan của môi trường nước được duy trì ở mức thích hợp là 7,5 8,5 và >4 ppm. Thể tích floc hình thành (floc volume FV) được xác định bằng phễu lắng Imhoff. Khi floc được hình thành và FV tăng, hỗn hợp mẫu được thu và trải trên đĩa môi trường Zobell s Marine Agar (Himedia) ở 30 o C trong 5 ngày. Các thông số môi trường được thu thập và trình bày trong Bảng 1. Bảng 1: Điều kiện môi trường để biofloc hình thành Thông số Nghiệm thức Kết hợp Bột mì ph 8,1 ± 0,1 7,9 ± 0,1 Nhiệt độ ( o C) 27,7 ± 0,9 28,2 ± 0,5 DO (ppm) 6,6 ± 0,3 5,9 ± 0,4 Độ kiềm (ppm) 126,7 ± 5,2 135,0 ± 5,5 Độ mặn (ppt) 2,7 ± 0,1 2,8 ± 0,1 Tổng chất rắn hòa tan (TDS, mg/l) 3263,0 ± 91,1 3366,5 ± 76,3 Hàm lượng TAN ban đầu (ppm) 2,0 ± 0,1 1,0 ± 0,4 Lượng C bổ sung (g/10 L) 0,48 ± 0,02 (rỉ), 0,85 ± 0,01 (bột) 6,91 ± 0,01

Phân lập định danh Pseudomonas spp. Dựa vào hình thái khuẩn lạc được mô tả bởi Schaad và cộng sự (1978) và Lalucat và cộng sự (2006), các chủng vi khuẩn được cấy thuần. Vi khuẩn sau đó được nhuộm gram, thử nghiệm oxidase, catalase và nuôi cấy trên môi trường Pseudomonas CFC Selective media (Oxoid) ở 25 o C trong 3 ngày. Kết quả các chủng mọc trên CFC agar, gram âm, oxidase và catalase dương tính được chọn để định danh sinh học phân tử 16S rrna (Desouky và cộng sự, 2008; Zheng và cộng sự, 2008). Đánh giá khả năng tạo floc Các chủng vi khuẩn chọn lọc được nuôi tăng sinh trong môi trường lỏng sucrose, 20 g/l; cao nấm men, 2,5 g/l; KH 2PO 4, 2 g/l; K 2HPO 4, 5g/L và NaCl, 0,1 g/l nước cất, ph 7 ở 30 o C trong máy ủ lắc 150 rpm, 48 giờ. Dịch tăng sinh được ly tâm ở 10.000 rpm trong 30 phút để thu dịch nổi. FA sẽ được đo bằng phương pháp điều chỉnh sử dụng cao lanh (Himedia) là chất rắn lơ lửng (Yokoi và cộng sự, 1997). 3 ml dung dịch CaCl 2 1% và 2 ml dịch sau ly tâm được cho vào 100 ml dung dịch cao lanh lơ lửng (4 g/l). Khuấy mạnh hỗn hợp này rồi để yên trong 5 phút. Mật độ quang học (OD) của dung dịch cách bề mặt 2 cm được đo bằng máy quang phổ tại bước sóng 550 nm. Mẫu đối chứng được chuẩn bị tương tự và thay dịch ly tâm bằng môi trường chuẩn bị mới (B). Kết quả được tính theo phương trình: FA (%) = (B A) / B 100% Trong đó, A là mật độ quang học của mẫu thí nghiệm và B là mật độ quang học của mẫu đối chứng ở 550 nm. So sánh khả năng xử lý ammonia Lần lượt các chủng vi khuẩn được nuôi cấy mẻ ở 30 o C, 150 rpm trong 3 loại môi trường lỏng có thành phần được trình bày trong Bảng 2. Bên cạnh việc xác định mật độ vi khuẩn trong môi trường tăng sinh bằng phương pháp trải đĩa, 25 ml mẫu được thu tại các thời điểm 0 h (bổ sung NH 4Cl), 3 h và 6 h để xác định hàm lượng nitrogen tổng cộng (TAN) bằng phương pháp Phenate tại bước sóng 640 nm (Greenberg và cộng sự, 1992). Phân tích số liệu Bảng 2: Môi trường dinh dưỡng nuôi cấy Pseudomonas spp. DD1 DD2 DD3 Thành phần Lượng Thành phần Lượng Thành phần Lượng NH 4Cl 1 mgnh 4-N NH 4Cl 1 mgnh 4-N NH 4Cl 2 mgnh 4-N Nước cất 1 L Sucrose 4 mgc Sucrose 20 g ph 6.98 ± 0.04 Nước cất 1 L KH 2PO 4 8.2 g ph 7.00 ± 0.02 MgSO 4.7H 2O 0.5 g CaCl 2.2H 2O 0.5 mg ZnSO 4.H 2O 0.5 mg FeCl 3.6H 2O 0.5 mg CuSO 4.5H 2O 0.5 mg NaOH 2 g NaCl 15 g Nước cất 1 L ph 7.02 ± 0.05 Các nghiệm thức trong mỗi thí nghiệm đều được lặp lại 3 lần. Số liệu thí nghiệm được xử lý bằng phân tích phương sai một yếu tố và hai yếu tố (ANOVA) ở mức ý nghĩa 0,05 trên SPSS 16.0. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Tạo floc, phân lập và định danh Pseudomonas spp. Với mật độ vi khuẩn tăng từ 10 4 cfu/ml khi bắt đầu thí nghiệm lên 10 7 cfu/ml sau 24 giờ, FV của mẫu bột mì cao hơn so với mẫu kết hợp mật rỉ đường và đường sucrose (P<0,05). Sau 6 giờ, lượng TAN trong nước đã bị loại bỏ hoàn toàn. Tổng cộng đã có 15 chủng vi khuẩn được phân lập từ 2 nghiệm thức tạo floc. Trong số này có 3 chủng thuộc nhóm Pseudomonas (1 chủng trong nghiệm thức kết hợp mật rỉ đường với đường sucrose và 2 chủng trong nghiệm thức sử dụng bột mì làm cơ chất carbon), lần lượt kí hiệu là BF11, BF21 và BF22. Đối chiếu trình tự 16S rrna của các vi khuẩn này với GenBank (NCBI) cho thấy chúng gồm: Pseudomonas pseudoalcaligenes và P. stutzeri (Bảng 2). Theo Chaudhary và cộng sự (2008), Abdelkarim và cộng sự (2010) thì cả hai chủng này đều được coi là có tiềm năng sử dụng làm chế phẩm sinh học để làm sạch môi trường và cố định nitrogen. Zhang và cộng sự (2006) cho biết nguồn carbon bổ sung khác nhau sẽ có ảnh hưởng đến quần xã vi khuẩn trong nước ao. Cấu trúc và khả năng kết lắng của các hạt floc cũng bị ảnh hưởng. Kết quả của nghiên cứu này phù hợp với công bố của Diep và cộng sự (2009) là Pseudomonas stutzeri phát triển tốt khi nguồn carbon sử dụng có nguồn gốc từ tinh bột. So sánh khả năng tạo floc Hình 2 trình bày kết quả đánh giá khả năng tạo floc của 3 chủng vi khuẩn Pseudomonas phân lập được. Khả năng tạo floc của các biopolymer do vi khuẩn sản sinh được xác định khi bổ sung ion dương Ca 2+ vào dung dịch huyền phù vô cơ. Các ion dương này kích thích sự lắng kết bằng cách trung hòa và ổn định điện tích âm còn lại của gốc carboxyl trong amino acid có tính acid và galacturonic acid trong chuỗi biopolymer giúp kết nối các thành phần lơ lửng trong dung dịch lại với nhau. Kết quả nghiên cứu cho thấy FA (>53%) không có sự khác biệt giữa các chủng phân lập được là Pseudomonas pseudoalcaligenes và P. stutzeri (P>0,05).

Hình 1: Thể tích floc và mật độ vi khuẩn của 2 nghiệm thức (kết hợp rỉ đường + sucrose và bột mì) tại thời điểm 24 giờ Hình 2: Khả năng tạo floc của 3 chủng vi khuẩn Pseudomonas phân lập được So sánh khả năng xử lý ammonia Bảng 3: Các chủng Pseudomonas spp. được định danh sinh học phân tử Phân loại khoa học Giới Bateria Bacteria Ngành Proteobacteria Proteobacteria Lớp Gamma Proteobacteria Gamma Proteobacteria Bộ Pseudomonadales Pseudomonadales Họ Pseudomonadacease Pseudomonadacease Chi Pseudomonas Pseudomonas Loài P. pseudoalcaligenes P. stutzeri Chủng (kí hiệu) P. pseudoalcaligenes BF11, BF12 P. stutzeri BF22 Hình 3 trình bày kết quả thí nghiệm đánh giá khả năng loại bỏ ammonia của 3 chủng vi khuẩn BF11, BF21 và BF22 trong 3 loại môi trường tổng hợp DD1, DD2 và DD3. Kết quả cho thấy tốc độ loại bỏ ammonia của 2 chủng P. pseudoalcaligenes (BF11 và BF21) không khác nhau khi sử dụng môi trường DD1 và DD2 (P>0,05), đạt 28,5% ± 2,8 sau 24 giờ với mật độ vi khuẩn không tăng duy trì ở 10 8 cfu/ml. Riêng đối với chủng BF22 thì môi trường DD2 cho kết quả xử lý ammonia tốt hơn môi trường DD1 sau 24 giờ (33.1% so với 24.9%) (P<0,05). Tuy nhiên, khả năng xử lý ammonia của cả 3 chủng vi khuẩn đều tốt nhất trong môi trường tổng hợp DD3. Hình 3: Tốc độ loại bỏ ammonia của 3 chủng vi khuẩn (a) BF11, (b) BF21 và (c) BF22 trong 3 môi trường nuôi DD1 ( ), DD2 ( ) và DD3 ( ) Hình 4: Khả năng xử lý ammonia của 3 chủng vi khuẩn Pseudomonas trong môi trường tổng hợp DD3 Hình 4 cho thấy sự khác biệt ý nghĩa giữa chủng P.stutzeri BF22 so với 2 chủng còn lại. Sau 3 giờ, BF11 và BF21 đã loại bỏ khoảng 25% lượng NH 4Cl bổ sung vào môi trường DD3 và >80% dư lượng này sau 6 giờ nuôi lắc ở 30 o C, 150

rpm. Trong khi đó, tốc độ xử lý ammonia chuyển hóa thành năng lượng và sinh khối vi khuẩn của chủng BF22 chỉ đạt lần lượt 17,2% và 54,7% sau 3 và 6 giờ. Các kết quả trên cho thấy, thành phần của môi trường ảnh hưởng đáng kể đến khả năng sinh trưởng của Pseudomonas spp. được khảo sát dẫn đến ảnh hưởng khả năng loại bỏ ammonium trong môi trường nuôi. Trong đó vai trò của nguồn và lượng C cũng như các muối khoáng (trace elements) là không nhỏ. Đã có các nghiên cứu trước đây khẳng định khả năng chuyển hóa nitrate thành N 2 của các chủng vi khuẩn Pseudomonas (Smil, 2001). Kết quả từ nghiên cứu này đóng góp thêm thông tin hữu ích về khả năng loại bỏ NH 4-N độc tố xuất hiện thường xuyên trong hệ thống nuôi của các chủng Pseudomonas pseudoalcaligenes và Pseudomonas stutzeri khi được kiểm soát trong điều kiện thích hợp. KẾT LUẬN + Có thể sử dụng cả 2 loại cơ chất (kết hợp mật rỉ đường với đường sucrose và bột mì) để tạo floc ở tỉ lệ C/N là 20/1. Tuy nhiên, nghiệm thức bột mì cho khả năng phân lập được Pseudomonas spp. cao hơn. Ba chủng Peudomonas phân lập được gồm 2 chủng P. pseudoalcaligenes và 1 chủng P. stutzeri. + Các chủng phân lập được có khả năng tạo floc cao với FA trên 53%. + Khả năng xử lý ammonia của P. pseudoalcaligenes tốt hơn P. stutzeri; và trong môi trường DD3 tốt hơn trong môi trường DD1 và DD2. + Cần có nghiên cứu tiếp theo về giá trị dinh dưỡng, khả năng đối kháng với các tác nhân gây bệnh và khả năng nuôi tăng sinh của các chủng đã phân lập được. TÀI LIỆU THAM KHẢO Abdelkarim M, Kamel C, Fathi K, Amina B (2010). Use of Pseudomonas stutzeri and Candida utilis in the improvement of the conditions of Artemia culture and protection against pathogens. Brazilian Journal of Microbiology, 41(1), 107-115. Avnimelech Y (2009). Biofloc Technology A Practical Guide Book. The World Aquaculture Society, Baton Rouge, Louisiana, United States. Avnimelech Y (1999). C/N ratio as a control element in aquaculture systems. Aquaculture, 176, 227 235. Crab R., Defoirdt T., Bossier P., & Verstraete W., 2012. Biofloc technology in aquaculture: Beneficial effects and future challenges. Aquaculture. Chaudhary A, & Qazi JI (2008). The probiotic potential of two Pseudomonads against Vibrio anguillarum and Pseudomonas fluorescens in Labeo rohita fingerlings. In Proceedings of Pakistan Congress of Zoology, 28, 88-89. De Schryver P, Crab R, Defoirdt T, Boon N, Verstraete W (2008). The basics of bio-flocs technology: The added value for aquaculture. Aquaculture 277, 125 137. Desouky AM, Abd-El-Haleem, Roda FA, Thourya A (2008). Isolation and characterization of extracellular bioflocculants produced by bacteria isolated from Qatari Ecosystems. Polish Journal of Microbiology, 57, 231 239. Diep CN, Cam PM, Vung NH, Lai TT (2009). Isolation of Pseudomonas stutzeri in wastewater of catfish fish-ponds in the Mekong Delta and its application for wastewater treatment. Bioresource technology, 100, 16, 3787-3791. Greenberg AE, Clesceri LS, Eaton AD (1992). Standard methods for the examination of waste and wastewater. Washington: American Public Health Society. Lalucat J, Bennasar A, Bosch R, García-Valdés E, Palleroni NJ (2006). Biology of Pseudomonas stutzeri. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 70(2), 510-547. Schaad NW, Sowell G, Goth RW, Colwell RR, Webb RE (1978). Pseudomonas pseudoalcaligenes subsp. citrulli subsp. nov. International Journal of Systematic Bacteriology, 28(1), 117-125. Smil V (2001). Enriching the Earth. Cambridge: The MIT Press. Spiers AJ, Buckling A, Rainey PB (2000). The causes of Pseudomonas diversity. Microbiology, 146(10), 2345-2350. Taw N, Fuat H, Tarigan N, Sidabutar K (2008). Partial harvest/ biofoc system: Promising for Pacific white shrimp. Global Aquaculture Advocate, September, 84-86. Tripathy S, Kumar N, Mohanty S, Samanta M, Mandal RN, Maiti NK (2007). Characterisation of Pseudomonas aeruginosa isolated from freshwater culture systems. Microbiological research, 162(4), 391-396. Yokoi H, Yoshida T, Mori S, Hirose J, Hayashi S, Takasaki Y (1997). Biopolymer flocculant produced by an Enterobacter sp. Biotechnol. Lett., 19, 569 573. Zheng Y, Ye ZL, Fang XL, Li YH, Cai WM (2008). Production and characteristics of a bioflocculant produced by Bacillus sp. F19. Bioresource Technology, 99, 7686 7691. EVALUATION OF FLOCCULATING ACTIVITY AND AMMONIA REMOVAL RATE OF Pseudomonas spp. ISOLATED FROM INDUSTRIAL SHRIMP POND Hoang Phan C.*, Bao Le & Tung Hoang School of Biotechnology, International University - VNU HCMC SUMMARY Biofloc technology is an advanced solution for shrimp farming worldwide. The addition of carbon substrates into culture systems with appropriate C/N promotes heterotrophic bacterial growth to handle waste and create supplemented feed for the cultured shrimps. This study isolated Pseudomonas spp. from biofloc system, evaluated flocculating activity and

ammonia removal rate of Pseudomonas pseudoalcaligenes and Pseudomonas stutzeri in three different culture media (DD1, DD2 and DD3). The result of flocculating activity among strains did not differ significantly (>53%). Two strains of P. pseudoalcaligenes showed better ammonia removal rates in comparison to P. stutzeri (84% and 54.7% after 6 hrs, respectively) (p < 0.05). In addition, the three strains of bacteria handled ammonia in medium DD3 better than those in DD1 and DD2 (p < 0.05). The results of this study provide useful information for the use of Pseudomonas pseudoalcaligenes and Pseudomonas stutzeri as probiotics in shrimp farming systems applied biofloc technology. Keywords: Pseudomonas pseudoalcaligenes, Pseudomonas stutzeri, flocculating activity, ammonia removal rate Author for correspondence: Tel: +84-933968650; Email: pchoang@hcmiu.edu.vn