CHƯƠNG 4 BẢO VỆ QUÁ TRÌNH LÊNMEN

CHƯƠNG 4 BẢO VỆ QUÁ TRÌNH LÊNMEN Hầu hết các quá trình lên men công nghiệp được tiến hành các nuôi cấy thuần khiết trong đó chỉ có các chủng chọn lọc được phép sinh trưởng. Nếu một cơ thể vi sinh vật ngoại lai hiện diện trong môi trường hoặc trong bất kỳ một bộ phận thiết bị nào đó, thì chúng sẽ làm nhiễm bẩn môi trường, sản xuất ra các sản phẩm có hại có thể hạn chế sinh trưởng của các chủng sản xuất. Vì thế, trước khi bắt đầu quá trình lên men, môi trường và các thiết bị lên men phải được tiệt trùng để loại bỏ tất cả các nguy cơ gây nhiễm và các điều kiện vô trùng này phải được duy trì trong suốt quá trình lên men. Muốn cho quá trình lên men được kết quả, ta cần tạo mọi điều kiện cho chủng vi sinh vật nuôi cấy được phát triển và hoạt động tối ưu. Muốn vậy, việc trước tiên và gần như tất cả là phải ngăn cản sự xâm nhập và phát triển của các vi sinh vật lạ. Trong nhiều quá trình lên men như sản xuất các acid amin, enzyme, các chất kháng sinh thì cần phải vô trùng gần như tuyệt đối, nhất là trong giai đoạn nhân giống và sinh trưởng. Còn trong các quá trình sản xuất sinh khối, như sinh khối nấm men chăn nuôi, men bánh mì, sinh khối vi khuẩn, tảo thì không cần vô trùng. Lên men rượu bia cùng không đòi hỏi vô trùng tuyệt đối. Sự phát triển lạ bị ngăn cản bằng cách tạo ra những điều kiện thuận lợi cho sinh trưởng của chủng sản xuất. Các điều kiện đó thường là các cơ chất đặc hiệu hoặc ph của môi trường. Muốn có điều kiện nuôi cấy vô trùng phải tiến hành tiệt trùng môi trường, thiết bị và toàn bộ hệ thống van, đường ống, các thiết bị phụ trợ trong dây chuyền sản xuất. Nhiệm vụ tiệt trùng là diệt hết vi sinh vật có mặt trong môi trường do có sẵn từ trong thành phần như nước, nguyên liệu, không khí và trên bề mặt các thiết bị tiếp xúc với môi trường. Những vi sinh vật này còn sống sót sẽ phát triển cạnh tranh với chủng sản xuất, làm hỏng quá trình lên men. Các vi sinh vật thường có sức bền với nhiệt, một số có mặt trong nguyên liệu dưới dạng bào tử, muốn diệt được chúng phải gia nhiệt tới 120 121 0 C trong vài chục phút. I Các phương pháp tiệt trùng Tiệt trùng môi trường lên men hoặc các thiết bị có thể thực hiện bằng cách phá hủy tất cả các cơ thể sống hoặc bằng phương thức nhiệt (ẩm hoặc khô), hoặc các tác nhân hóa học, chiếu xạ (tia cực tím hoặc tia X) và bằng các phương pháp cơ học (siêu âm). Một hướng khác là loại các cơ thể sống bằng phương pháp lọc. 1. Nhiệt Nhiệt là phương thức được sử dụng rộng rãi nhất để tiệt trùng, có thể sử dụng cho cả hai loại môi trường rắn và lỏng. Nó có thể được ứng dụng dưới dạng nhiệt khô hoặc ẩm (hơi nước). Nhiệt ẩm thường hiệu quả hơn nhiệt khô, do khả năng kháng nhiệt ở bên trong của các tế bào vi khuẩn được tăng lên mạnh trong trạng thái khô hoàn toàn. Kết quả là tỷ lệ chết của tế bào khô thấp hơn nhiều so với tế bào ẩm. Sự dẫn nhiệt trong không khí khô cũng có tốc độ kém hơn trong không khí ẩm. Vì thế, nhiệt khô chỉ được dùng để tiệt trùng dụng cụ thủy tinh hoặc các vật liệu rắn chịu nhiệt. Bằng cách tăng áp suất lên bình nuôi cấy, nhiệt độ hơi nước có thể tăng lên một cách đảng kể trên cả 48

điểm sôi của nước. Nồi tiệt trùng áp suất (autoclave) ở phòng thí nghiệm thường được hoạt động 121oC, các bào tử vi khuẩn bị giết nhanh ở 121oC. Hiện nay phương pháp tiệt trùng trong công nghệ vi sinh phổ biến dùng là hơi nước quá nhiệt do nồi hơi cung cấp. Nồi hấp tiệt trùng: Nồi hấp tiệt trùng dùng để tiệt trùng các loại dụng cụ, môi trường nuôi cấy và một số nguyên liệu khác 4 9 5 8 2 6 1 7 3 10 Hình 1. Cấu tạo nồi hấp tiệt trùng (1) Thùng tiệt trùng, (2) ngăn chứa hơi nước, (3) Vỏ nồi, (4) nắp nồi, (5) khóa nắp nồi, (6) bộ phận cấp nước, (7) van xả nước, (8) áp kế, (9) van an toàn, (10) van xả hơi. Tiệt trùng liên tục Ngoài ra, người ta còn dùng phương pháp tiệt trùng bằng hơi liên tục: cho môi trường chảy qua thiết bị tiệt trùng chuyên dùng ở nhiệt độ 140oC trong vài phút. Một thiết bị tiệt trùng liên tục bao gồm ba bộ phận chính: đun nóng, giữ và làm lạnh. Bộ phận đun nóng Phương pháp đun nóng có thể chia làm hai loại: phun hơi nước trực tiếp và làm nóng gián tiếp trong các thiết bị trao đổi nhiệt ống lồng ống (shell-and-tube) hoặc có khung đĩa (plate-and-frame). Làm nóng trực tiếp hiệu quả hơn gián tiếp do không có vật cản (barrier) giữa môi trường và nguồn nhiệt. Dụng cụ phun hơi nước làm nóng nhanh môi trường tới một nhiệt độ tiệt trùng tối đa. Vì thế, sự tiệt trùng trong suốt thời gian đun nóng là đáng kể. Đối với làm nóng gián tiếp, bộ phận trao đổi nhiệt có khung đĩa thường hiệu quả hơn loại truyền nhiệt ống lồng ống. Tuy nhiên, bộ phận đầu bị hạn chế đối với các áp lực thấp (thường dưới 20 atm) do cường lực cấu trúc yếu của nó so với bộ phận sau. Loại có khung đĩa cũng thuận lợi cho các hệ thống có độ nhớt cao. 49

Bộ phận giữ nóng Môi trường được đun nóng đi qua bộ phận giữ nhiệt bao gồm một ống dài. Bộ phận giữ được duy trì trong các điều kiện đoạn nhiệt. Bộ phận làm lạnh Đối với bộ phận làm lạnh, dùng một buồng làm mát có khả năng loại nhiệt là rất hiệu quả. Một kỹ thuật khác là đưa môi trường nóng qua một van mở rộng vào trong buồng chân không được xem là quá trình làm lạnh nhanh (flash cooling). Cả hai kỹ thuật này ít tốn thời gian, vì thế thời gian làm lạnh trong suốt quá trình tiệt trùng được cho là không đáng kể. 2. Hóa chất Các tác nhân hóa học có thể được dùng để giết vi sinh vật bằng khả năng oxy hóa hoặc alkyl hóa. Tuy nhiên, chúng không được dùng để tiệt trùng môi trường bởi vì các hóa chất này có thể ức chế sinh trưởng của các cơ thể lên men. Các tác nhân hóa học được sử dụng thường xuyên cho việc xử lý để loại bỏ hoặc làm giảm mức độ nguy hại của các tác nhân gây bệnh. Một số tác nhân hóa học kháng khuẩn chính là: phenol và các hợp chất phenol (phenol, cresol), alcohol (ethyl, methyl), các halogen (iodine, hypochlorite, chloramine), các chất tẩy, thuốc nhuộm, các hợp chất ammonium bậc bốn, các acid, kiềm và các tác nhân dạng khí (ethylene oxide, β-propiolactone, formadehyde). Đối với những chất kém bền nhiệt dễ bị phân huỷ ở nhiệt độ cao thì việc tiệt trùng có thể bằng cách lọc qua phin lọc hoặc bằng các hoá chất diệt khuẩn. Nhưng việc sử dụng các hoá chất diệt khuẩn cần phải cân nhắc kĩ càng về tính gây độc cho vi sinh vật nuôi cấy, cho người sử dụng sản phẩm cũng như về vệ sinh an toàn lao động. Một số hoá chất được dùng để tiệt trùng trong một số trường hợp ngoại lệ, như etylenoxyl, propiolacton rất thích hợp cho việc tiệt trùng các chất kém bền nhiệt như enzyme chẳng hạn. Ethylenoxyl hỗn hợp với không khí theo tỉ lệ 3-8 % sẽ gây nổ, vì vậy khi dùng phải trộn lẫn với CO 2 hoặc N 2. β - propiolacton có tác dụng mạnh hơn nhưng có độc tính (có thể gây ung thư đối với người). 3. Tia cực tím Nhiều nguyên liệu tế bào hấp thụ ánh sáng cực tím, dẫn đến gây nguy hiểm cho gen và sau đó giết chết tế bào. Bước sóng khoảng 256 nm có hiệu quả diệt khuẩn cao nhất. Tuy nhiên, tia cực tím có rất ít khả năng xuyên qua vật chất. Vì thế, việc sử dụng chúng bị hạn chế đối với việc làm giảm quần thể vi sinh vật trong phòng nơi mà điều kiện vô trùng cần thiết được duy trì thường xuyên, chẳng hạn như các phòng mổ của bệnh viện hoặc các buồng làm việc sạch trong phòng thí nghiệm. Tia X gây chết cơ thể vi sinh vật và có khả năng xuyên qua vật chất. Tuy nhiên, chúng không thực tế như các công cụ tiệt trùng khác do chi phí đắt cũng như sự lo lắng về an toàn lao động. 4. Sóng siêu âm Sóng âm thanh hoặc siêu âm có cường độ đủ mạnh cũng có thể phá vỡ và giết chết tế bào. Kỹ thuật này thường được sử dụng để phá vỡ tế bào nhằm tách chiết các thành phần của nội bào (protein, enzyme...) hơn là để tiệt trùng. 50

5. Lọc Là kỹ thuật được sử dụng hiệu quả nhất trong việc loại bỏ các vi sinh vật trong không khí hoặc trong các loại khí khác. Trong trường hợp dung dịch lỏng, nó được dùng cho các sản phẩm hoặc các loại môi trường không bền nhiệt, dễ dàng bị phá hủy như các huyết thanh người và động vật, các loại enzyme. Trong số các kỹ thuật được giới thiệu ở trên, nhiệt ẩm có hiệu quả và kinh tế nhất cho các yêu cầu tiệt trùng nói chung của hệ lên men. Không khí dùng để cung cấp oxy được tiệt trùng bằng cách lọc tiệt trùng. Nguyên liệu lọc thường dùng là bông đá, bông thủy tinh hoặc bông. Hiện nay trong công nghệ vi sinh còn phổ biến loại lọc màng. Lọc tiệt trùng có thể sử dụng để làm sạch không khí. Cung cấp khí sạch cho nuôi cấy bề mặt là một bộ phận những máy điều hoà và làm sạch khí đặt ở bên trên hoặc bên cạnh phòng nuôi cấy. Trong các xí nghiệp sản xuất quy mô lớn có thể thiết kế để sử dụng khí tuần hoàn. Không khí sau khi qua phòng nuôi cấy được đưa trở lại các máy điều hoà riêng chỉ bay ra khí quyển khoảng 10%. Đồng thời với việc cung cấp khí sạch còn có bộ phận điều nhiệt và điều ẩm để đảm bảo nhiệt độ và độ ẩm tối ưu cho quá trình nuôi cấy tránh làm khô môi trường. Cung cấp khí sạch cho môi trường nuôi cấy chìm khá phức tạp. Đó là hệ thống các máy nén khí và phin lọc, ngoài ra còn có các bộ phận khác như lọc sơ bộ, làm nguội khí, thùng chứa khí. Không khí sạch vô trùng được đưa vào nồi lên men qua các bộ phận phun tia kết hợp với khuấy đảo hoặc ống hồi lưu để tăng thêm độ hoà tan của ôxy trong môi trường. II. Tiệt trùng trong công nghệ lên men 1. Tiệt trùng thiết bị và hệ thống truyền dẫn Trong phương pháp nuôi cấy bề mặt cần phải tiệt trùng thiết bị, dụng cụ có liên quan đến giống vi sinh vật ( thùng gieo cấy, khay, thùng chứa nước, bơm, hoặc đường ống dẫn.) Các thiết bị này có thể dùng các dịch sát khuẩn để ngâm hoặc lau rửa, sông SO2 hoặc đem sấy ở nhiệt độ cao (Khay dụng cụ thủy tinh có thể sấy khô ở 160 0 C trong thời gian là 60 phút). Môi trường, thiết bị máy móc và hệ đường ống truyền dẫn tiệt trùng bằng hơi ở nhiệt đô105-120oc với áp suất dư 0,05 0,1 Mpa. Mặt bàn để cấy giống, các miệng bình nhân giống đều phải tráng rửa bằng cồn ethanol. Trong phương pháp lên men bề sâu việc tiệt trùng thiết bị và hệ thống truyền dẫn là vô cùng quan trọng. Nếu công việc này không được tiến hành nghiêm ngặt thì quá trình lên men sẽ hoàn toàn bị phá hỏng, không thu được kết quả gì. Tiệt trùng thiết bị bằng hơi nóng ở nhiệt độ cao cũng chưa chắc đạt được độ tiệt trùng. Khi gia nhiệt không khí có thể tách ra khỏi hỗn hợp hơi- khí làm thành lớp màng khí. Điều đó làm giảm hiệu quả tiệt trùng. Ngoài ra, các bộ phận, các dụng cụ để tiếp giống, tiếp thêm chất dinh dưỡng, chất điều chỉnh ph đều phải tiệt trùng. Đa số trường hợp vẫn phải tiệt trùng bằng hơi nước, chỉ có những trường 51

hợp các chất dinh dưỡng dễ bị phân huỷ ở nhiệt độ cao thì phải tiệt trùng bằng cách lọc qua phin lọc vô trùng hoặc dùng các hoá chất diệt khuẩn. Việc dùng các hoá chát diệt khuẩn phải cân nhắc kỹ càng về tính gây độc cho vi sinh vật nuôi cấy, cho người và an toàn lao động. 2. Tiệt trùng và làm sạch không khí Trong quá trình nuôi cấy các chủng vi sinh vật hiếu khí việc cung cấp không khí vô trùng là một việc làm phức tạp và khó khăn. Trong không khí luôn luôn có một lượng tương đối lớn các vi sinh vật từ khoảng vài trăm đến vài ngàn, thậm chí vài vạn tế bào hoặc hơn nữa trong một lít. Trong đó có bào tử nấm mốc, xạ khuẩn theo gió bay, bào tử vi khuẩn cùng với bụi bẩn. Thông thường mùa rét số lượng vi sinh vật ít hơn mùa hè, ở trên cao ít hơn ở gần mặt đất và trời lặng ít hơn khi trời gió bụi. Vì vậy, không khí trước khi đưa vào lên men cần phải làm sạch để đạt độ vô khuẩn gần như tuyệt đối. Cung cấp khí sạch cho nuôi cấy bề mặt là một bộ phận đặt những máy điều hoà và làm sạch không khí thường ở trên và bên cạnh phòng nuôi cấy. Quá trình làm sạch qua các giai đoạn : không khí qua lọc sơ bộ để loại các bụi bẩn cơ học và phần lớn các vi sinh vật; vào điều hoà tổng có điều chỉnh nhiệt (nếu cần) vào qua quạt chung; học vi sinh vật và cuối cùng cấp cho các máy điều hoà riêng. Cũng có thể bố trí hệ thống cấp và lọc khí như sau : không khí từ cột hút qua phin lọc sơ bộ vào quạt hút, qua lọc vào máy điều hoà, rồi cấp cho buồng nuôi cấy. Cung cấp khí sạch cho nuôi cấy chìm là cả một hệ thống tương đối phức tạp. Trọng tâm của hệ thống này là các máy nén khí và phin lọc. Ngoài ra còn có các bộ phận khác, như lọc sơ bộ, làm nguội khí, tách dầu nước, thùng chứa khí. Hệ thống nén và làm sạch không khí theo sơ đồ sau: Không khí qua cột hút lọc sơ bộ nén khí làm nguội tách dầu nước lọc chung (tổng lọc) lọc riêng nồi lên men (hoặc nồi nhân giống, nồi tiếp dầu, nồi tiếp dịch cơ chất dinh dưỡng) Cấp cho buồng nuôi cấy vô trùng. Lọc sơ bộ được cấu tạo bởi hai lớp lưới thép inốc đặt ở mặt trước và mặt sau hộp chữ nhật có vỏ tôn, ở giữa xếp các chuỗi vòng kim loại chồng khít với nhau và được đặt khít vào hộp tôn, đầu kia của hộp tôn được làm nhỏ lại để sao cho lắp vừa cửa vào máy nén, còn đầu lưới và đầu kim loại được nối với ống hút gió, ống hút gió có thể có chiều cao tới 10m hoặc hơn nữa để tránh đưa không khí gần mặt đất có nhiều tạp khuẩn và bụi vào máy nén. Phin lọc không khí là những bình làm bằng thép thường, hình trụ có hai vỏ, bên trong được xếp vật liệu lọc (bông mỡ, bông thuỷ tinh, vải, amiăng, tấm lọc từ các loại sợi đặc biệt ). những phin đầu tiên được dùng cho lọc không khí để nuôi cấy chìm thường dùng bông mỡ. Bông phải tơi và sợi càng dài càng tốt. Bông được xếp chặt bên trong phin và có thể xếp giữa cột bông theo chiều cao một lớp than hoạt tính dầy. 52

Không khí sạch vô trùng được đưa vào nồi lên men qua các bộ phận phun tia kết hợp với khuấy đảo hoặc ống hồi lưu để tăng thêm độ hoà tan của oxy vào dịch, nhằm cung cấp tối đa nhu cầu oxy của chúng nuôi cấy để đạt được năng suất lên men cũng như hiệu suất chuyển hóa cao. Đối với lên men hiếu khí (aerobic fermentations), thì cần cung cấp không khí liên tục. Tốc độ sục khí đặc trưng cho lên men hiếu khí khoảng 0,5-1,0 vvm (thể tích khí/thể tích chất lỏng/phút). Điều này đòi hỏi một lượng lớn không khí. Vì thế, không chỉ môi trường mà không khí cũng phải vô trùng. Tất cả những kỹ thuật vô trùng dùng cho môi trường cũng có thể áp dụng cho không khí. Tuy nhiên, tiệt trùng theo phương thức nhiệt không thực tế về mặt kinh tế và cũng không hiệu quả do hiệu suất truyền nhiệt thấp của không khí so với chất lỏng. Kỹ thuật tiệt trùng có hiệu quả nhất cho không khí là phương pháp lọc bằng cách dùng bộ lọc màng (membrane filter) hoặc bộ lọc sợi (fibrous filter). Nút bông, thường được dùng như là nắp đậy cho ống nghiệm hoặc bình tam giác đựng dung dịch vô trùng, là một ví dụ tốt để loại vi sinh vật ra khỏi không khí bằng sợi lọc. Một bộ lọc đơn giản được làm bằng cách nhồi bông trong cột. Tuy nhiên, với các bộ lọc làm bằng bông thì sự giảm áp lớn và sự ẩm ướt có thể là điều kiện thuận lợi cho sự nhiễm bẩn. Vì thế, các sợi thủy tinh thích hợp khi lọc môi trường do chúng tạo ra một sự giảm áp thấp hơn và ít có khả năng ẩm ướt hoặc cháy. Hệ thống lọc hiện đại bằng sợi là các ống hình trụ làm từ các vi sợi borosilicate liên kết, chúng được bao bọc trong mạng lưới đã gia cố polypropylene. Loại thiết kế này có thể phân phối hơn 3 m3/s không khí vô trùng ở sự giảm áp suất 0,1 bar. 3. Tiệt trùng môi trường nuôi cấy bề mặt Môi trường nuôi cấy bề mặt thường là các hợp chất rắn, xốp, gồm có cám, bột và các chất dinh dưỡng được tiệt trùng bằng hơi nóng trong thiết bị chuyên dùng với áp suất dư 0,05 Mpa để đạt được nhiệt độ 104 110oC. Để tăng hiệu quả tiệt trùng người ta cho vào môi trường trước khi gia nhiệt một chất kháng sinh là furaxin với tỷ lệ 1,5g cho 100g môi trường hoặc dung dịch formalin 40% với tỷ lệ 0,2% trong nước làm ẩm môi trường. Tiệt trùng bằng hơi nóng có thể qua hai giai đoạn: nâng nhiệt tới 100oC và đảo khối môi trường liên tục trong 15 20 phút; sau đó nâng tới 110oC khoảng 60 90 phút và cứ sau 15 phút lại đảo môi trường 3 5 phút. Phòng nuôi và các khay đựng môi trường cũng được tiệt trùng. Môi trường sau khi tiệt trùng chia vào các khay coi như môi trường vô trùng, được làm nguội và được tiếp giống cho vào lên men. 4. Tiệt trùng môi trường lỏng để lên men bề sâu Tiệt trùng môi trường lỏng có thể chọn một trong những phương pháp gián đoạn và liên tục. Phương pháp gián đoạn thường dùng trong trường hợp khối dịch không lớn, các nồi nhân giống và ở các nồi lên men không quá lớn. - Tiệt trùng nồi lên men và hệ thống đường ống tiếp xúc với môi trường bằng hơi nóng trực tiếp hoặc gián tiếp. 53

- Cho dịch môi trường đã pha chế vào nồi (lượng dịch bằng ¾ V của nồi và phải tính thêm phần nước ngưng khi cho hơi trực tiếp vào môi trường) - Gia nhiệt tới nhiệt độ tiệt trùng. Phương pháp này tương đối dài và để tránh biến đổi trong thành phần dinh dưỡng của môi trường nên chỉ tiến hành ở áp suất 0.05 0.1 Mpa với nhiệt đô10 120 o C trong khoảng 1 1,5giờ từ lúc đạt được nhiệt độ tới hạn. Tiệt trùng liên tục ở nhiệt độ cao hơn (140 145oC) và giữ ở thời gian ngắn hơn ở nhiệt độ này. Thiết bị dùng vào việc này có ba bộ phận: bộ phận khử khuẩn là cột được gia nhiệt bằng hơi khi môi trường lỏng chảy qua, bộ phận tiếp theo là bình giữ dịch ở nhiệt độ xác định trong khoảng thời gian gần bằng thời gian để diệt tối đa số vi sinh vật. Phần thiết bị này có thể là thùng hình trụ hoặc cột có các vách ngăn hoặc các tầng đĩa để phân tán nhiệt cho đồng đều cả khối môi trường hoặc ở dạng ống xoắn trao đổi nhiệt. Phần thiết bị thứ ba là bộ phận làm nguội dịch môi trường có hệ trao đổi nhiệt với nước làm việc với áp suất dư 0,03 0,05 Mpa. 5. Tiệt trùng dầu mỡ phá bọt Các chất phá bọt thường là dầu thực vật, các hợp chất hoạt động bề mặt,vì các bào tử vi khuẩn ở trong những chất này có độ bền nhiệt cao gấp 2 3 lần so với trong nước, nên việc tiệt trùng cần phải thận trọng. Nhiệt độ tiệt trùng là 120 125oC trong khoảng 1-1,5 giờ. Dầu và bình chứa dầu sau khi tiệt trùng làm nguội được giữ ở điều kiện áp suất dư 0,03-0,04 Mpa bằng khí nén vô trùng. Khi phá bọt dùng khí nén vô trùng đẩy qua hệ van đường ống nối với nồi lên men. 6. Kiểm tra trạng thái vô trùng Kiểm tra trạng thái vô trùng của môi trường cũng như cả hệ thống thiết bị trước khi bắt đầu và trong quá trình lên men, đặc biệt là pha sinh trưởng, là việc làm rất cần thiết. Vì nếu tạp nhiễm thì cả quá trình nuôi cấy có thể bị phá huỷ hoàn tòan. Trong lên men bề mặt cần kiểm ta vô trùng môi trường sau khi khử khuẩn và nước làm ẩm bổ sung vào môi trường. Lấy mẫu và cấy vào các hộp petri có môi trường thạch- thịt- pepton hoặc thạch- malt. Sau đó gói hộp bằng giấy sạch và để vào tủ ấm 30-37 o C trong 24 giờ. Xem kết quả. 54

Filename: CHƯƠNG 4 khu trung.doc Directory: C:\Documents and Settings\welcome\Desktop\New Folder Template: C:\Documents and Settings\welcome\Application Data\Microsoft\Templates\Normal.dot Title: CHƯƠNG 5 Subject: Author: User Keywords: Comments: Creation Date: 8/3/2011 3:17:00 PM Change Number: 4 Last Saved On: 9/9/2011 8:46:00 AM Last Saved By: User Total Editing Time: 3 Minutes Last Printed On: 9/9/2011 8:46:00 AM As of Last Complete Printing Number of Pages: 7 Number of Words: 4,087 (approx.) Number of Characters: 14,594 (approx.)