NGHIÊN CỨU CHỌN TẠO CÁC GIỐNG ĐẬU TƯƠNG BIẾN ĐỔI GEN KHÁNG RUỒI ĐỤC THÂN VÀ SÂU ĐỤC QUẢ

Transcription

1 Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ nhất NGHIÊN CỨU CHỌN TẠO CÁC GIỐNG ĐẬU TƯƠNG BIẾN ĐỔI GEN KHÁNG RUỒI ĐỤC THÂN VÀ SÂU ĐỤC QUẢ Trần Thị Cúc Hòa, Nguyễn Trần Hải Bằng, Trần Thanh Hải, Hồ Thị Huỳnh Như, Hà Minh Luân, Nguyễn Quang Vinh, Trần Như Ngọc, Võ Thị Kiều Trang, Đoàn Thị Mến, Phạm Thị Hường và Nguyễn Đức Cương Viện Lúa đồng bằng sông Cửu Long SUMMARY Studies on development of transgenic soybean varieties resistant to the lesser cornstalk borer and the pod borer The lesser cornstalk borer (Elasmopalpus lignosellus) and pod borer (Etiella zinckenella) are insect pests causing severe damage to soybean, therefore the application of genetic transformation to develop transgenic soybean lines highly tolerant to these pests are needed. This study was undertaken to transfer the insect resistant genes, from the vector pptn791 and vip3a from the vector phoa21 into the variety Williams 82. As a result, T2 transgenic soybean lines carrying the gene or vip3a were developed and confirmed by the Southern blot analysis. ELISA analysis of T2 lines carring showed the significant expression of the protein Cry1Ac ranging from to ng/g of green leaves. The insect resistant test in the net house under natural conditions showed that some transgenic lines having a very low infestation of the pod borer, as lowest as 7.98% compared to the check variety of 66.51%. To increase the materials for developing transgenic soybean lines resistant to the lesser cornstalk borer and pod borer, new vectors carrying the genes- cry2aa, cry4a, cry2aa+, cry4a+ were constructed to continue transform into the soybean plants. Keywords: Agrobacterium, genetic transformation, insect resistance, lesser cornstalk borer, soybean pod borer. I. ĐẶT VẤN ĐỀ ** Sản lượng đậu tương nước ta hiện không đáp ứng đủ nhu cầu trong nước, hàng năm phải nhập khẩu số lượng lớn khô dầu đậu tương. Để tăng sản lượng đậu tương, tăng năng suất là giải pháp quan trọng và rất cấp thiết vì hiện nay năng suất đậu tương ở nước ta rất thấp, chỉ đạt 1,5 tấn/ha (Tổng cục Thống kê/website) so với năng suất bình quân thế giới 2,5 tấn/ha (FAOSTAT, 211). Sâu hại là yếu tố quan trọng nhất hạn chế năng suất đậu tương. Tại Việt Nam, các sâu hại chính đậu tương gồm ruồi đục thân (Elasmopalpus lignosellus), sâu đục quả (Etiella zinckenella), sâu xanh da láng (Spodoptera exigua). Tỷ lệ cây đậu tương bị ruồi đục thân hại rất biến động, phụ thuộc vào mùa vụ, có thể từ vài phần trăm trong vụ Hè tới trên 7% trong vụ Đông, sâu đục quả gây giảm từ vài phần trăm đến 27,4-31% năng suất đậu tương. Các loài sâu hại chính như ruồi Người phản biện: TS. Trần Ngọc Thạch. đục thân, sâu đục quả, sâu khoang, sâu cuốn lá, rệp muội xanh có thể làm giảm năng suất đậu tương tới 74,3-81,2% (Lương Minh Khôi và Phạm Thị Vượng, 1989). Trên thế giới, đậu tương biến đổi gen chiếm diện tích lớn nhất, với 8 triệu ha trong tổng diện tích 17,3 triệu cây trồng biến đổi gen trong năm 212 (ISAAA, 212). Việc nhập các giống đậu tương biến đổi gen kháng sâu từ nước ngoài vào Việt Nam bị lệ thuộc vào các công ty nước ngoài cũng như các rào cản về sở hữu trí tuệ. Vì vậy, cần có các nỗ lực trong nước để tự tạo giống đậu tương biến đổi gen kháng các được các sâu hại chính. Từ yêu cầu nêu trên, Viện Lúa đồng bằng sông Cửu Long đã thực hiện đề tài cấp Nhà nước Nghiên cứu chọn tạo các giống đậu tương biến đổi gen kháng ruồi đục thân và sâu đục quả. Mục tiêu của đề tài nhằm tạo ra giống đậu tương biến đổi gen mang gen kháng ruồi đục thân và sâu đục quả, có năng suất và chất lượng cao. 441

2 VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu Giống đậu tương dùng cho chuyển nạp là Williams 82, đây là giống nhập nội được dùng phổ biến để chuyển nạp gen ở đậu tương trên thế giới. Các vector mang gen kháng sâu dùng chuyển nạp gen gồm: - Vector ptn791 mang gen kháng sâu và gen đánh dấu chọn lọc kháng thuốc diệt cỏ bar, mỗi gen nằm trên một T-DNA (hình 1). - Vector phoa21 (pptn-vip3a) mang gen kháng sâu vip3a và gen đánh dấu chọn lọc bar, mỗi gen nằm trên một T-DNA (hình 1). Hình 1. Vector pptn791 mang gen và vector phoa21 mang gen vip3a 2.2. Phương pháp nghiên cứu Thiết kế vector Việc thiết kế gen kháng sâu dùng cho biến nạp cây đậu tương được tiến hành trên cơ sở của vector kép pub14 mang 2 T-DNA trong đó một T-DNA mang gen bar được điều khiển bởi promoter 2X35S và terminator Tvsp. Cloning gen hữu dụng vào T-DNA thứ hai.. Các promoter và gen kháng sâu sẽ được thay thế trên vector này bằng các enzyme cắt giới hạn tương ứng Chuyển nạp gen Quy trình chuyển nạp gen vào đậu tương bằng phương pháp Agrobacterium tumefaciens được thực hiện theo quy trình của Olhoft và ctv. (23), Zeng và ctv. (24) và Trần Thị Cúc Hòa (28). Phương pháp lây nhiễm được cải tiến bằng cách dùng dao đặt vuông góc với trụ hạ diệp tạo 7-1 vết thương tại mặt trong của nốt lá mầm ngay trong dung dịch lây nhiễm có chứa vi khuẩn A. tumefaciens. Chuyển 5 mẫu tử diệp đã được gây vết thương vào 5ml môi trường lây nhiễm lỏng mới có chứa vi khuẩn A. tumefaciens. Mẫu được ủ ở nhiệt độ phòng thời gian 3 phút, lắc 5-7 vòng/phút. Mẫu được lây nhiễm ở 25 o C thời gian 5 ngày (Trần Thị Cúc Hòa, 28). Phương pháp trích DNA cơ bản dựa theo phương pháp của Dellaporta và ctv. (1983), phân tích PCR, phân tích Southern blot theo quy trình của Southern (1975), phân tích ELISA: Nồng độ protein Cry1Ac của các dòng đậu nành biến đổi gen được đánh giá (định lượng) bằng phương pháp Sandwich ELISA sử dụng bộ kít Cry1Ac Quantiplate kit (Envirologix, Portland, OR, USA). Đánh giá tính kháng sâu trong điều kiện tự nhiên (hoàn toàn không phun thuốc trừ sâu) trong nhà lưới. III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Thiết kế vector mới Trên cơ sở plasmid pub14 và tổng hợp hai gen cry2aa và cry4a, bốn vector mới đã được thiết kế (hình 2) chuyển nạp tạo giống đậu tương ruồi đục thân và sâu đục quả, gồm: (1) Vector phoa4 (14.36 bp) chứa hai T-DNA, một T-DNA mang gen đánh dấu 2X35Sbar-Tvsp, một T-DNA mang gen kháng ruồi đục thân, E35S-cry4A-Tvsp. (2) Vector phoa6 ( bp) chứa hai T-DNA, một T-DNA mang gen đánh dấu 2X35Sbar-Tvsp, một T-DNA mang gen kháng ruồi đục thân, E35S-cry2Aa-Tvsp. (3) Vector phoa1 ( bp) chứa hai T-DNA, một T-DNA mang gen đánh dấu 2X35Sbar-Tvsp, một T-DNA mang hai gen kháng sâu, E35S-soycry1ac + 2A-cry4Aa-Tvsp. 442

3 Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ nhất (4) Vector phoa13 ( bp) chứa 2 T-DNA, một T-DNA mang gen đánh dấu 2X35S-bar-Tvsp, một T-DNA mang hai gen kháng sâu, E35S-soycry1ac + 2A-cry2Aa-Tvsp. Hình 2 trình bày sơ đồ của một vector mới, phoa13. Hình 2. Sơ đồ của 4 vector mới được thiết kế 3.2. Tạo dòng biến đổi gen kháng ruồi đục thân và sâu đục quả Kết quả tạo dòng đậu tương mang gen Tạo dòng T: Vector pptn791 mang gen và gen bar và được chuyển nạp vào giống William 82. Bốn thí nghiệm được thực hiện với tổng số 8 mẫu lây nhiễm, kết quả thu được 4 dòng tái sinh T. Các dòng tái sinh được phân tích Southern blot (hình 3) để xác định là dòng biến đổi gen mang gen. Kết quả phân tích Southern blot xác định 3 dòng T mang gen và gen bar. Tuy nhiên chỉ có 2 dòng mang gen cho thấy tỷ lệ đồng chuyển nạp là 66,66%. Hình 3. Phân tích Southern blot các dòng đậu tương T giống Williams 82 chuyển nạp gen. DNA được cắt đoạn bằng HindIII và SacI. Màng được lai với DNA có mang gen. Phương pháp đánh dấu DIG. Mũi tên chỉ chiều dài 2985 bp mang gen. (-): đối chứng (không biến đổi gen) ; (+): pptn791 plasmid DNA. 443

4 VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM Tạo dòng T1: Hạt dòng T (mang gen và gen bar) được trồng để cho ra dòng T1. Khả năng mang gen của các dòng T1 gồm: mang cả hai gen và bar; chỉ mang gen bar, chỉ mang gen, không mang hai gen và bar. Hình 4 cho thấy qua phân tích Southern blot đối với gen của 9 dòng T1 phát triển từ dòng T- HCW4-1 cho thấy 7 dòng có gen (hiện diện của băng bp của gen ), 2 dòng không có (không có băng bp). Hình 4. Phân tích Southern blot các dòng đậu tương T1 giống Williams 82 chuyển nạp gen (pptn791) phát triển từ T - HCW4-1. DNA được cắt đoạn bằng HindIII và SacI. Màng được lai với DNA có mang gen. Phương pháp đánh dấu DIG. Mũi tên chỉ chiều dài 2985 bp của gen -: đối chứng (không biến đổi gen); +: pptn791 plasmid DNA Kết quả của dòng đậu tương cho phản ứng kháng hoặc nhiễm khi lá được phết thuốc trừ cỏ Liberty cung cấp thông tin sơ khởi dòng đậu tương đó có mang gen bar hay không. Kết quả phân tích Southern blot 21 dòng T1 phát triển từ 2 dòng T (HCW3-2, HCW4-1) đối với gen bar và gen (bảng 1) ghi nhận 13 dòng mang cả hai gen và gen bar, 3 dòng chỉ mang gen, 5 dòng không mang gen và gen bar. Kết quả này cho thấy ở thế hệ T1 đã có sự phân ly gen bar khỏi gen, tạo điều kiện chọn dòng chuyển gen chỉ mang gen mà không mang gen chọn lọc bar, đây là ưu điểm của chuyển gen bằng vector kép chứa hai T-DNA. Bảng 1. Phân tích Southern blot các dòng T1 chuyển nạp gen với vector pptn791 mang gen bar và gen vào giống Williams 82 Dòng T mang gen bar và Số dòng T1 Kết quả phết Liberty (K/N) và Kết quả phân tích Southern blot (số dòng T1) Có gen Không có gen bar và 1 HCW / HCW / Tổng Ghi chú: K/N: Số dòng kháng Liberty/số dòng nhiễm Liberty (thuốc diệt cỏ). Tạo dòng T2: Tổng số 34 dòng T2 phát triển từ 3 dòng T1 HCW3-2-12, HCW3-2-8 và HCW4-1-8 được phân tích Southern blot. Hình 5 cho thấy qua phân tích Southern blot đối với gen của 9 dòng T2 phát triển từ dòng T1 HCW có 7 dòng mang gen, 2 dòng không mang gen nào ( và bar). Kết quả phân tích Southern blot của 34 dòng T2 đối với gen và gen bar ghi nhận (bảng 2) 1 dòng mang cả hai gen và bar, 19 dòng mang gen và 5 dòng không mang gen và bar. 444

5 Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ nhất Hình 5. Phân tích Southern blot các dòng đậu tương T2 giống Williams 82 phát triển từ dòng T1 (HCW ) chuyển nạp gen Mũi tên chỉ chiều dài 2.985bp của gen. (-): đối chứng (không biến đổi gen). (+): pptn 791 plasmid DNA, K: Kháng Liberty, N: Nhiễm Liberty Bảng 2. Phân tích Southern blot các dòng T2 chuyển nạp gen với vector pptn791 mang gen bar và gen vào giống Williams 82 Dòng T1 mang gen bar và Số dòng T2 Kết quả phết Liberty (K/N) và Kết quả phân tích Southern blot (số dòng T2) Có gen Không có gen bar và 1 HCW / HCW / HCW / Tổng Kết quả tạo dòng đậu tương mang gen vip3a Tạo dòng T: Vector phoa21 mang gen vip3a và gen bar và được chuyển nạp vào giống Williams 82 với 12 thí nghiệm trên tổng số 2.4 mẫu lây nhiễm. Kết quả thu được 15 dòng tái sinh T. Các dòng tái sinh được phân tích Southern blot (hình 6) để xác định là dòng biến đổi gen mang gen vip3a. Kết quả phân tích Southern blot xác định 7 dòng T mang gen vip3a và gen bar. Hình 6. Phân tích Southern blot các dòng đậu tương T giống Williams 82 chuyển nạp gen vip3a. DNA được cắt đoạn bởi EcoRI. Màng được lai với DNA có mang gen vip3a. Phương pháp đánh dấu DIG. Mũi tên chỉ chiều dài 1,8kb mang gen vip3a. (-): đối chứng (không biến đổi gen) ; (+): pptn-vip3a plasmid DNA. 445

6 VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM Tạo dòng T1: Từ 7 dòng T mang gen vip3a và gen bar đã phát triển 39 dòng T1 để phân tích Southern blot. Hình 7 cho thấy kết quả phân tích Southern blot của 13 dòng T1 phát triển từ dòng T- HVW5-8 có 1 dòng mang gen vip3a, 3 dòng không mang gen vip3a (tên dòng nằm trong khung hình 7). Kết quả phân tích Southern blot đối với gen vip3a của 17 dòng T1 phát triển từ 5 dòng Tđ.ã ghi nhận 14 dòng mang gen vip3a (bảng 3). Hình 7. Phân tích Southern blot các dòng đậu tương T1 giống Williams 82 chuyển nạp gen vip3a. DNA được cắt đoạn bởi EcoRI. Mũi tên chỉ chiều dài 1,8 kb của gen vip3a (-): đối chứng (không biến đổi gen) (+): phoa (pptn-vip3a) plasmid DNA, K: Kháng Liberty, N: Nhiễm Liberty Bảng 3. Phân tích Southern blot các dòng T1 chuyển nạp gen với vector ph OA21 mang gen bar và gen vip3a vào giống Williams 82. Dòng T mang gen Số dòng Kết quả phết Liberty Kết quả phân tích Southern blot* (số dòngt1) bar và T1 (K/N) Có gen 1 HVW4-4 1 /1 1 2 HVW6-1 1 /1 1 3 HVW / 1 4 HVW /4 1 5 HVW5-6 1 /1 1 Tổng Ghi chú: *: Chưa phân tích gen bar. Trong nghiên cứu này bước đầu chúng tôi chọn một số dòng/cây T1 nhiễm Liberty để phân tích Southern blot trước nhằm tìm ra dòng biến đổi gen không mang gen bar nhưng có mang gen kháng sâu tức loại gen đánh dấu (marker gene) ra khỏi dòng biến đổi gen, đây là hướng khắc phục sự lo ngại về tính an toàn của cây biến đổi gen do gen đánh dấu chọn lọc gây ra. Tạo dòng T2: Tổng số 19 dòng T2 phát triển từ 2 dòng T1 (HVW5-8-1, HVW5-2-2) được phân tích Southern blot. Hình 8 cho thấy kết quả phân tích Southern blot đối với gen vip3a của 6 dòng T2 phát triển từ dòng T1 HVW5-2-2 có 5 dòng mang gen vip3a, 1 dòng không mang gen vip3a và bar (tên dòng nằm trong khung). Phân tích Southern blot 19 dòng T2 đối với gen vip3a và gen bar ghi nhận (bảng 4) có 15 dòng mang gen vip3a và 5 dòng không có gen vip3a và gen bar. 446

7 Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ nhất Hình 8. Phân tích Southern blot các dòng đậu tương T2 giống Williams 82 phát triển từ dòng (HVW5-2-2) chuyển nạp gen vip3a DNA được cắt đoạn bởi EcoRI. Mũi tên chỉ chiều dài 1,8 kb của gen vip3a (-): đối chứng (không biến đổi gen) (+): phoa (pptn-vip3a) plasmid DNA, K: Kháng Liberty, N: Nhiễm Liberty Bảng 4. Phân tích Southern blot các dòng T1 chuyển nạp gen với vector phoa21 mang gen bar và gen vip3a vào giống Williams 82 Kết quả phân tích Southern blot* (số dòng T1) Dòng T1 Số mang gen dòng Kết quả phết Liberty bar và T2 (K/N) và Có gen Không có gen bar và 1 HVW / HVW / 5 1 Tổng Kết quả phân tích ELISA các dòng đậu tương mang gen Phân tích ELISA các dòng T2 mang gen cho thấy có sự biểu hiện đáng kể của protein Cry1Ac (hình 9). Phân tích định lượng hàm lượng protein Cry1Ac, số liệu ghi nhận như sau: Trong tổng số 25 dòng được phân tích, có 19 dòng có hàm lượng protein được xác định. Hàm lượng protein Cry1Ac các dòng biến đổi gen dao động từ 325,3 đến 677,83 ng/g lá tươi. Dòng có hàm lượng protein Cry1Ac cao nhất là dòng T2 HCW (bảng 5). Hình 9. Kết quả phân tích ELISA các dòng đậu tương mang gen (A) Các giếng ELISA của cây chuyển gen đổi sang màu xanh sau khi thêm substrate (B) Giếng ELISA của cây chuyển gen đổi sang màu vàng sau khi thêm HCl 1N. Các giếng trong khung là đối chứng theo thứ tự từ trên xuống gồm 1 giếng trống (blank), 1 giếng đối chứng dương (antibody), 2 giếng đối chứng cây không chuyển gen. 447

8 VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM Bảng 5. Hàm lượng protein cry1ac (ng/g lá tươi) trên lá của các dòng đậu tương chuyển gen mang gen Dòng đậu tương Hàm lượng protein Dòng đậu tương Hàm lượng protein 1 T3HCW ,25 11 T3HCW ,82 2 T3HCW ,4 12 T3HCW ,38 3 T2HCW ,3 13 T3HCW ,82 4 T2HCW ,38 14 T3HCW ,4 5 T2HCW ,59 15 T3HCW ,61 6 T2HCW ,83 16 T3HCW ,48 7 T2HCW ,94 17 T3HCW ,7 8 T2HCW ,38 18 T3HCW ,5 9 T2HCW ,39 19 T3HCW ,5 1 T2HCW , Thử nghiệm tính kháng sâu đục quả của các dòng đậu tương biến đổi gen Thời gian tiến hành thí nghiệm từ ngày 12/12/212 đến ngày thu hoạch đậu 13/3/213. Ghi nhận kết quả kháng sâu đục trái của 2 dòng biến đổi gen T2 và T3 chuyển nạp với vector phoa21 mang gen vip3a vào giống Williams 82 được trồng trong điều kiện tự nhiên (nhà lưới Viện Lúa ĐBSCL) như sau: Tỷ lệ bị sâu đục quả của các dòng biến đổi gen dao động từ 7,8-61,39% so với đối chứng Williams 82 là 66,51% (hình 1). Dòng T3 HVW có tỷ lệ bị sâu đục quả thấp nhất (7,8%). Các dòng có tỷ lệ sâu đục quả tương đối thấp so với đối chứng dao động từ 16,77-19,42% gồm: T3HVW , T2HVW5-6-2, T2HVW Đây là các dòng kháng sâu triển vọng. Hình 11 cho thấy sự khác biệt về mức độ sâu hại trên quả của dòng đậu tương biến đổi gen T2 HVW5-2-1 so với giống đối chứng không chuyển gen Williams 82. Hình 1. Biểu đồ tỷ lệ sâu đục quả các dòng đậu tương biến đổi gen mang gen vip3a (phoa 21) trồng tại nhà lưới Bộ môn Công nghệ sinh học, Viện Lúa ĐBSCL Ngày thu hoạch: 13/3/

9 Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ nhất IV. KẾT LUẬN Nghiên cứu chọn tạo giống đậu tương kháng ruồi đục thân và sâu đục quả đã thu được các kết quả: - Đã thiết kết 4 vector mới mang gen kháng sâu cry2aa, cry4a, cry2aa+, cry4a+. - Đã tạo được các dòng biến đổi gen từ giống Williams đến thế hệ T2 được xác định qua phân tích Southern blot mang gen hoặc vip3a. Phân tích ELISA các dòng T2 mang gen ghi nhận sự biểu hiện đáng kể của protein Cry1Ac. Thí nghiệm tính kháng sâu đục quả của các dòng T2, T3 mang gen vip3a trong điều kiện tự nhiên trồng trong nhà lưới cho thấy một số dòng biến đổi gen có tỷ lệ sâu hại rất thấp so với giống đối chứng không biến đổi gen. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Dellaporta SL, Wood J and Hicks JB (1983). A plant DNAminipreparation: Version II. Plant Mol. Biol. Rep. 4: FAOSTAT(211). PageID=567#ancor 3. ISAAA (212). Report on Global Status of Biotech/GM Crops lides/brief44slides.pd 5. Olhoft PM, Flagel LE, Donovan CM and Somers DA (23). Efficient soybean transformation using hygromycine B selection in the cotylendonary-node method. Planta 216: Southern E M (1975). J. Mol. Biol. 98, Trần Thị Cúc Hoà (28). Tối ưu hóa quy trình chuyển nạp gen đậu tương bằng cải tiến phương pháp lây nhiễm với Agrobacterium tumefaciens. Tạp chí Khoa học - Công nghệ của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn. 9: Tổng cục Thống kê: mid= Zeng P, Vadnais D, Zhang Z andpolacco J (24). Refined glufosinate selection in Agrobacteriummediated transformation of soybean [Glycine max (L.) Merr.]. Plant Cell Rep 22: