ETAPA I Elaborarea de modele experimentale RAPORT STIINTIFIC SI TEHNIC

Transcription

1 Cen tt rru l de Biochi imi ie i Apl icai tta si Bioi ttehno logl ie i Bucu rres tt i Bd Marasti nr. 59 Sector 1 Bucuresti, cod , tel/fax: , cod fiscal: , Cont: RO23RNCB BCR WTC; CONTRACT 174/2014 INTRODUCEREA IN CULTURA CONTROLATA A UNOR SPECII SI TULPINI NOI DE MACROMICETE INDIGENE, COMESTIBILE SI/SAU MEDICINALE, CU VALOARE DE ALIMENT FUNCTIONAL (MYCOIND) ETAPA I Elaborarea de modele experimentale RAPORT STIINTIFIC SI TEHNIC RAPORT STIINTIFIC SI TEHNIC ETAPA I CONTRACT 174/2014 (MYCOIND) Page 1

2 I. REZUMATUL ETAPEI I In prezentul raport stiintific si tehnic sunt prezentate activitatile, obiectivele si rezultatele obtinute in cadrul etapei I cu titlul: Elaborarea de modele experimentale. Obiectivul general al etapei a fost: elaborarea modelelor experimentale pentru adaptarea metodelor de lucru si pregatirea cadrului experimental de realizare a proiectului. Pe parcursul etapei au fost realizate de catre partenerii consortiului un numar de 10 activitati cu urmatoarele obiective/partener: (1) Stabilirea tipului, a compozitiei mediilor de cultura in vitro si a conditiilor de incubare pentru obtinerea miceliului de macromicete izolate din diferite zone (CO - BIOTEHNOL); (2) Stabilirea metodelor moleculare pentru caracterizarea genetica a speciilor de Pleurotus (CO - BIOTEHNOL); (3) Metode de evaluare biochimica a biomasei de miceliu vegetativ si a corpilor de fructificare (CO - BIOTEHNOL); (4) Modele experimentale privind: compozitia chimica si potentialul farmacologic al speciilor de ciuperci selectate; metodele de obtinere a extractelor; metode moderne de analiza fizico-chimica a extactelor; metode de testare farmacotoxicologica a extractelor (P1 - ICCF); (5) Metode de testare a activitatii antimicrobiene a extractelor obtinute din macromicetele izolate (CO - BIOTEHNOL); (6) Proceduri de insamantare a inoculilor, de obtinere a compostului si de dezinfectie a acestuia (CO - BIOTEHNOL); (7) Model experimental la nivel de laborator de obtinere a unui extract selectiv imbogatit cu substante active de interes- testari preliminare (P1 - ICCF); (8) Colectie de germoplasma fungica din speciile de ciuperci selectate (CO - BIOTEHNOL); (9) Stabilirea in plantatie a substraturilor naturale pentru cultura ciupercilor selectate (P2 CAMI MAR); (10) Realizare website proiect ((CO - BIOTEHNOL)). In urma realizarii activitatilor acestei etape au fost indeplinite toate obiectivele, iar rezultatele au fost cele asteptate: (1) Stabilirea tipului, a compozitiei mediilor de cultura in vitro si a conditiilor de incubare pentru obtinerea miceliului de macromicete izolate din diferite zone; (2) Stabilirea metodelor moleculare pentru caracterizarea genetica a speciilor de Pleurotus.; (3) Stabilirea metodelor de evaluare biochimica a biomasei de miceliu vegetativ si a corpilor de fructificare; (4) Stabilirea unor metode de determinare a compozitiei chimice si a potentialului farmacologic ale speciilor de ciuperci selectate: metode de obtinere a extractelor, metode de analiza fizico-chimica a extactelor, metode de testare farmacotoxicologica a extractelor; (5) Stabilirea metodelor de testare a activitatii antimicrobiene a extractelor obtinute din macromicetele izolate; (6) Stabilirea procedurilor de insamantare a inoculilor, de otinerea a compostului din deseuri naturale si de dezinfectie a acestuia; (7) Realizarea unui model experimental, la nivel de laborator, de obtinere a unui extract selectiv imbogatit cu substante active de interes; (8) Realizarea unei colectii de germoplasma fungica din speciile de ciuperci selectate; (9) Stabilirea in plantatie a substraturilor naturale pentru cultura ciupercilor selectate; (10) Realizarea Website proiect cu adresa II. RAPORT DE ACTIVITATE ACTIVITATEA 1.1. Elaborarea modelelor experimentale de determinare in vitro a potentialului biologic de crestere a izolatelor pe diferite medii de cultura (solide/lichide) Studiu realizat de coordonatorul de proiect BIOTEHNOL. Obiectiv: Stabilirea tipului, a compozitiei mediilor de cultura in vitro si a conditiilor de incubare pentru obtinerea miceliului de macromicete izolate din diferite zone. Rezultate obtinute: in urma consultarii literaturii de specialitate s-a stabilit ca cele mai optime medii de cultura pentru obtinerea in vitro a inocului fungic sunt mediile solide PDA (potato dextrose agar) si MEA (malt extract agar 2 %) (Jonathan si colab., 2001; Daza si colab., 2006). Aceste medii vor fi folosite pentru initierea colectiei de germoplasma fungica (activitatea 1.8). Mediile lichide care se vor utiliza in realizarea diferitelor activitati vor fi mediile PD broth (potato dextroza) si ME broth (malt extract) la care se vor mai adauga, dupa caz si alte tipuri de medii de cultura lichide. Compozitia mediilor de cultura solide este urmatoarea: PDA (potato dextroza agar): 200 g cartof, 20 g dextroza, 20 g agar, 1 l de apa distilata;mea (Malt extract agar): 20 g malt extract, 15 g agar, 1 l de apa distilata. Compozitia mediilor de cultura lichide: PD broth: 200 g cartof, 20 g dextroza, 1 l de apa distilata; ME broth: 20 g malt extract, 1 l de apa distilata. Conditiile de temperatura si de ph optime pentru dezvoltarea miceliului variaza in functie de tulpina sau de specie. Conditiile de incubare vor fi alese in functie de tulpina sau specia de macromicete aleasa. Astfel, temperatura de incubare va avea valori cuprinse intre 25 si 30 0 C, iar perioada de incubare pentru dezvoltarea miceliului va fi cuprinsa intre 7, 12 pana la 20 de zile, in functie de RAPORT STIINTIFIC SI TEHNIC ETAPA I CONTRACT 174/2014 (MYCOIND) Page 2

3 tulpina sau specie. In cazul culturilor pe medii lichide conditiile de incubare vor fi: temperatura intre 25 si 30 0 C, perioada de incubare: de zile, in conditii de agitare (~ 140 rpm). Bibliografie A. Daza, J. L. Manjón, M. Camacho, L. R. de la Osa, A. Aguilar and C. Santamaría, Effect of carbon and nitrogen sources, ph and temperature on in vitro culture of several isolates of Amanita caesarea (Scop.:Fr.) Pers, Mycorrhiza, 2006, 16, S. G. Jonathan and I. O. Fasidi, Effect of carbon, nitrogen and mineral sources on growth of Psathyerella atroumbonata (Pegler), a Nigerian edible mushroom, Food Chem., 2001, 72, ACTIVITATEA 1.2. Elaborarea metodelor moleculare de caracterizare genetica a speciilor de Pleurotus recoltate din diferite areale din tara. Studiu realizat de coordonatorul de proiect BIOTEHNOL. Obiectiv: Stabilirea metodelor moleculare pentru caracterizarea genetica a speciilor de Pleurotus. Pentru cultivarea ciupercilor este necesara corecta identificare a speciilor, dar si o distingere corecta intre liniile unei singure specii. In ciuda tuturor eforturilor pentru clarificarea taxonomiei speciilor de Pleurotus, aceasta este inca confuza (Menolli Jr. si colab., 2010). Diversitatea morfologica a ciupercilor din diferite specii, in special a acelora raspandite in diferite regiuni sau zone din lume, precum si erorile de identificare au condus la aparitia de denumiri multiple pentru aceeasi specie (Menolli Jr. Si colab., 2010). Pentru rezolvarea acestor probleme s-a recurs la metodele de analiza moleculara (AFLP, RAPD etc). O metoda convenabila de determinare a variabilitatii genetice a speciilor de macromicete este analiza RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) o tehnică des folosită în studiile de diversitate genetică. (Marino si colab., 2003; Sunagawa si Magae, 2005; Vieira si colab., 2013). Tehnica RAPD (Williams si colab., 1990) are mai multe avantaje: necesita o cantitate mica de ADN, rapiditate, simplitate si reproductibilitate. Rezultate obtinute: au fost stabilite metodele moleculare de caracterizare a variabilitatii genetice a izolatelor de P. ostreatus native, recoltate din diferite zone din tara, in comparatie cu speciile de Pleurotus cultivate pentru comercializare (P. ostreatus var. Florida si P. eryngii). Speciile de Pleurotus vor fi caracterizate genetic prin metoda RAPD, care consta din parcurgerea a 3 etape: izolarea ADN total, reactia RAPD-PCR si analiza produsilor de reactie prin electroforeza in gel de agaroza. Bibliografie Marino RH, Eira AF, Kuramae EE, Queiroz, EC (2003). Morphomolecular characterization of Pleurotus ostreatus (Jacq. Fr.) Kummer strains in relation to luminosity and temperature of frutification. Sci. Agric. 60: Menolli Jr N, Asai T, Capelari M, Paccola-Meirelles LD (2010). Morphological and molecular identification of four Brazilian commercial Isolates of Pleurotus spp. and cultivation on corncob. Braz. Arch. Biol. Technol. 53: Sunagawa M, Magae Y (2005). Isolation of genes differentially expressed during the fruit body development of Pleurotus ostreatus by differential display of RAPD. FEMS Microbiol. Lett. 246: Vieira, F. R,, Pereira, D. M., Nogueira de Andrade M. C., Teixeira de Almeida Minhoni, Molecular characterization of Pleurotus ostreatus commercial strains by random amplified polymorphic DNA (RAPD). Afr. J. Agric. Res., Vol. 8(24), pp , 27. Williams, J.G.K., Kubelik, A.R., Livak, K.J., Rafalski, J.A., Tingey, S.V., DNA polymorphism amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Res. 18: RAPORT STIINTIFIC SI TEHNIC ETAPA I CONTRACT 174/2014 (MYCOIND) Page 3

4 ACTIVITATEA 1.3. Elaborare de modele experimentale privind metodele de evaluare biochimica a biomasei de miceliu vegetativ si a corpilor de fructificare. Studiu realizat de coordonatorul de proiect BIOTEHNOL. Obiectiv: Stabilirea metodelor de evaluare biochimica a biomasei de miceliu vegetative si a corpilor de fructificare. Studii extinse privind lacazele fungice au aratat ca acestea pot reprezenta o alternativa biologica pentru procesele de oxidare chimica fapt pentru care le fac atractive pentru aplicatiile industriale: industria textila, industria alimantara, in bioremediere sau in sectorul farmaceutic (Kunameni si colab., 2008b). Pentru determinarea continutului de lacaza din Agaricus campestris, Pleurotus ostreatus, Laetiporus sulphureus si Flammulina velutipes se vor examina extracte realizate din biomasa obtinuta in culturi submerse sau din mediile de cultura lichide in care s-a dezvoltat biomasa de miceliu vegetativ si corpii de fructificare. Se vor testa in acest sens mai multe medii de cultura lichide pentru a se determina mediul de cultura optim pentru producerea unei cantitati crescute de lacaza. Metodele de determinare a lacazei vor consta din analiza atat a mediilor solide pe care s-au dezvoltat speciile selectate, medii suplimentare cu un compus indicator de culoare pentru detectarea vizuala a productiei de lacaza, dar si din analiza activitatii enzimatice a mediilor de cultura lichide, prin metode spectrofotometrice. Unele ciuperci comestibile poseda activitate antioxidanta, acivitate care este bine corelata cu continutul lor total de fenoli (Barros si colab., 2007). Datorita acestor considerente, in etapa urmatoare va fi investigata activitatea antioxidanta corelata cu continutul total de fenoli, in cazul speciilor de ciuperci selectate in aceasta etapa,. In acest sens, biomasa vegetativa si corpii de fructificare dezvoltate in culturi submerse vor fi testate pentru determinarea continutului total de fenoli prin metoda Folin-Ciocalteu. Rezultate obtinute: au fost elaborate metodele de evaluare biochimica a biomasei de miceliu vegetativ si a corpilor de fructificare la speciile de ciuperci Agaricus campestris, Pleurotus ostreatus, Laetiporus sulphureus si Flammulina velutipes. Speciile selectate vor fi analizate pentru producerea de lacaza (metode cu un indicator de culoare si spectrofotometrice) si pentru determinarea continutului total de fenoli (prin metoda Folin -Ciocalteu). Bibliografie Barros L, Ferreira MJ, Queirơs B, Ferreira ICFR, Baptista P (2007) Total phenols, ascorbic acid, β-carotene and lycopene in Portuguese wild edible mushrooms and their antioxidant activities. Food Chem 103: Kunameni, A., Camarero, S., Garcia-Burgos, C., J-Plou, F., Ballesteros, A., Alcalde, M., Engineering and Applications of fungal laccases for organic synthesis. Microb Cell Fact.; 7: 32. ACTIVITATEA 1.4. Elaborare de modele experimentale privind: compozitia chimica si potentialul farmacologic al speciilor de ciuperci selectate; metodele de obtinere a extractelor; metode moderne de analiza fizico-chimica a extactelor; metode de testare farmacotoxicologica a extractelor. Studiu realizat de ICCF (P1). Obiectiv: Metode de determinare a compozitiei chimice si a potentialului farmacologic ale speciilor de ciuperci selectate: metode de obtinere a extractelor, metode de analiza fizico-chimica a extactelor, metode de testare farmacotoxicologica a extractelor. METODE EXPERIMENTALE PRIVIND COMPOZITIA CHIMICA SI POTENTIALUL FARMACOLOGIC AL SPECIILOR DE CIUPERCI SELECTATE Speciile care vor fi testate au fost caracterizate din punct de vedere chimic si al potentialului lor farmacotoxicologic (tabelul 1). RAPORT STIINTIFIC SI TEHNIC ETAPA I CONTRACT 174/2014 (MYCOIND) Page 4

5 Tabelul 1. Compozitia chimica si potentialul farmacotoxicologic al macromicetelor selectate Specia Compozitia chimica Potential farmacologic Potential toxicologic Autori Agaricus campestris Pleutorus ostreatus Laetiporus sulphureus Flamulina velutipes Proteine(fitohemaglutinina, calmodulina), Seleniu Polizaharide (chitina si chitosan),compusi polifenolici,aminoacizi (ergotioneina) Carbohidrati totali g/100 g, proteine g/ 100 g, fibre 4-20 g/100g si in cantitati mici minerale (Ca, K, Mg, Na, P, Cu, Fe and Mn) si vitamine ca B1, B2, B12, niacina, acidul ascorbic si acidul folic, lipide, vitamine, compusi fenolici cenusa, apa, grasimi, carbohidrati (manitolul,trehaloza) vitamine,proteine (lectine) compusi volatili polizaharide. (laminarin si fucomanogalactan),steroli compusi fenolici carbohidrati totali 58%, proteine 27,5%, grasimi 7% cenusa 7,4%.;Minerale: P, K,Ca, Mg, Na,Proteine (flamulin),aminoacizi Steroli (ergosterol) Antioxidant Hipoglicemiant Antimicrobian Antioxidant Imunomodulator Antitumoral Hipocolesterolemiant Hipotriglicemiant Antioxidant Antitumoral Antimicrobian Antioxidant Antiinflamator Antitumoral Imunomodulator Ciupercile salbatice, comestibile, colectate din diferite situri pot acumula metale (Pb, Cd, Mg, Cu, Ni, Ag si Cr) Pentru ciuperci de fag, ingerate, ocazional au fost raportate induceri de efecte adverse la animale si oameni, iar un extract apos administrat intravenos a fost toxic la soareci probleme gastrointestinale, reactii alergice, voma si febra Ashagrie Z. Woldegiorgis et al, 2014; Dilani D. De Silva et al. 2012; Subrata Giri et al. 2012; Hasan Hüseyin Dogan, et al T. Jayakumar, et al. 2011; Bhattacharya P.P. Srivastav H.N. Mishra, 2014 ; Jean Mary Facchini, et al. 2014; K.Sanjana P. Devi, et al. 2013; Olennikov DN, et al 2011; Klaus A, et al. 2013; Petrović J, et al. 2014; Ríos JL, et al 2012; Rabin Gyawali, Salam A. 2014; Ulrike Grienke, et al Kozhemiakina NV, et al. 2010; Fhernanda R. et al. 2008;Chengxue Yi, et al 2013, Huynh N.D. Bao, et al. 2010,Gunawardena,et al. 2014) Rezultate obtinute: au fost evidentiate compozitia chimica si potentialul farmacologic al speciilor selectate: Agaricus campestris, Pleurotus ostreatus, Laetiporus sulphureus si Flammulina velutipes. Dupa caracterizarea chimica si farmacotoxicologica, aceste specii vor fi testate din punct de vedere al continutului proteic prin metoda Bradford. MODEL EXPERIMENTAL PRIVIND METODE DE OBTINERE A EXTRACTELOR PREPARAREA EXTRACTELOR VEGETALE Produsul vegetal adus la gradul de maruntire prevazut in monografia respectiva este supus, daca este cazul, unei prealabile degresari. Solventii utilizati pentru extractie sunt: apa acidulata; apa alcalinizata; alcool diluat (uneori alcool acidulat), eter etc. Dupa consistenta extractele pot fi fluide, moi si uscate. Extractele fluide se obtin prin macerare, macerare repetata si percolare conform regulilor prevazute la monografia Tincturae. Extractele obtinute se lasa la temperatura de C timp de 6 zile si se filtreaza evitand pierderile prin evaporare. Extractele moi si uscate. In cazul extractelor moi solutiile extractive se concentreaza pana la obtinerea unei mase vascoase cu un continut de cel mult 20% materii volatile. In cazul extractelor uscate, dupa indepartarea solventului de extractie prin distilare, rezidul se usuca la vid la o temperatura care sa nu depaseasca 50 0 C iar extractul uscat sa contina cel mult 5% materii volatile. Extractele moi si uscate care contin principii puternic active si toxice se dozeaza si se aduc prin diluare cu pulberi inerte, solubile si nehigroscopice la concentratia in principii active prevazuta. (Farmacopeea Romana ed.x, Ed. Medicala, Bucuresti, 1993). Pentru concentrarea solutiilor extractive se utilizeaza diferite aparate (ex. bioreactor). Ambalarea si pastrarea extractelor. Dupa obtinere, produsele fitoterapeutice trebuie sa fie astfel pastrate incat o eventuala contaminare si orice alte modificari pe perioada de valabilitate a acestora sa fie evitate.materialele de ambalare nu trebuie sa cedeze din componenetele lor si nu trebuie sa interactioneze fizic sau chimic cu produsele RAPORT STIINTIFIC SI TEHNIC ETAPA I CONTRACT 174/2014 (MYCOIND) Page 5

6 continute si trebuie sa corespunda conditiilor de caliatate prevazute de normativele respective in vigoare. Extractele se vor conserva in recipiente de capacitate mica, bine inchise, ferite de lumina, la loc racoros ( C). MODEL EXPERIMENTAL PRIVIND METODE MODERNE DE ANALIZA FIZICO-CHIMICA A EXTRACTELOR Metodele de analiza calitativa și cantitativa selectate pentru identificarea si cuantificarea compusilor/claselor de compusi/ microelementelor sunt:calitative: identificare HPTLC si cantitative: dozare spectrofotometrica și HPLC, ICP-MS ANALIZA CALITATIVA A COMPUSILOR FENOLICI PRIN HPTLC Identificarea flavonozidelor prin metoda CSS (Ciulei I., Istudor V, 1995): Reactivi de identificare: UV 254 nm; toate flavonozidele prezinta fluorescenta albastra inchis pe fondul galben al placii; UV 365 nm: dependent de tipul structural fluorescenta flavonelor poate fi galbena, albastra sau verde;np/peg (R) - (difenil-boril-oxietil-amina / PEG ). Placile sunt pulverizate cu NP (R), urmata de pulverizare cu PEG (R). Fluorescenta este dependenta de structura compușilor flavonici. Identificarea acizilor polifenolcarboxilici (acidul cafeic si derivatii mono- di-cafeilchinici) prin CSS. -Reactivi de identificare: UV; acid sulfanilic diazotat (R); p-nitroanilina diazotata (R) reactiv Arnow (R); potasaalcoolica (R); vanilina sulfurica (R); dietildiaminodifenilborat (R); propilenglicol (R). In UV la 366 nm, se observa spoturi albastre sau verzi care prin pulverizare cu reactivii 2-4 se coloreaza in rosu. Dupa pulverizare cu reactivii 4a) și 6a) se usuca cromatogramele apoi se pulverizeaza cu 4b) sau 6b). Se obtin fluorescente galben -verzui. In solventul 2 pe placi de silicagel 60F 254, acidul cafeic se separa la Rf ~0,9 (Wagner. H. Bladt S. 1996). IDENTIFICAREA COMPUȘILOR POLIFENOLICI PRIN HPTLC (High performance thin layer chromatography) Pe linia de start a placii cromatografice se aplica solutiile proba și solutiile de referinta. Placa se introduce apoi in camera de developare saturata in prealabil cu solventul de migrare. Dupa migrarea compușilor, placa umeda se usuca cu ajutorului unui suflator de aer timp de 10 min. și se derivatizatizeaza conform condițiilor menționate mai sus la punctul detectie. Pentru fiecare spot evidentiat pe placuta cromatografica se calculeaza (soft) timpul de retentie (Rf). Distanta parcursa de component se masoara de la punctul de start pana la mijlocul zonei solutului, iar distanta parcursa de solvent de la locul de aplicare al spotului pana la frontul solventului. ANALIZA CANTITATIVA SPECTROFOTOMETRICA Dozarea conținutului in compuși flavonici totali se va efectua prin metoda colorimetrica bazata pe proprietatea flavonelor de a forma cu Al 3+ complecsi interni colorati in galben. Absorbantele solutiilor se citesc la = 430 nm. Conținutul de flavonozide se exprima in rutin cu ajutorul unei curbei etalon Dozarea conținutului in polifenoli totali se va determina prin metoda spectrometrica in vizibil, bazata pe proprietatea acestor compuși de a reduce fosfowolframatul de sodiu (reactiv Folin, conf.fr X) in mediu alcalin, la oxizi de wolfram de culoare albastra. Intensitatea acestor coloratii se determina la lungimea de unda de 740nm. Concentratia totalului de polifenoli se determina prin raportare la curbe etalon de acid galic. ANALIZA CANTITANTIVA PRIN HPLC - dozarea continutului in compusi polifenolici Metoda HPLC tine cont de necesitatea obtinerii unei separari cat mai eficiente a compusilor de interes și de aceea detectia acestora se face la lungimea de unda de 300nm (lungime de unda la care compușii de interes au coeficienti de absorbtie in UV convenabili și se micsoreaza eventualele interferente). Metoda HPLC - 2 : in acest caz, lungimea de unda pentru detectia compusilor de interes este de 245nm (lungimea de unda la care compușii de interes au coeficienti de absorbtie in UV convenabili și se micsoreaza eventualele interferente) ANALIZA CANTITATIVA SI CALITATIVA ICP-MS Metoda multielement de determinare a microelementelor toxice Pentru determinarea elementelor prin ICP-MS (spectrometrie de masa in plasma cuplata inductiv)probele trebuie sa fie aduse in stare lichida. Dozarea plumbului, cadmiului, arsenului si mercurului se efectueaza in conformitate cu RAPORT STIINTIFIC SI TEHNIC ETAPA I CONTRACT 174/2014 (MYCOIND) Page 6

7 prevederile F.Eur.7 prin spectrometrie de masa cu plasma cuplata inductiv (ICP-MS), utilizand pentru plumb masa 208, pentru cadmiu masa 111, pentru arsen masa 75 si respectiv pentru mercur masa 202. ANALIZA CALITATIVA SI CANTITATIVA AAS Metode de determinare a elementelor fier, cupru, zinc si mangan din bioproduse farmaceutice 1. Dozarea zincului: se efectueaza prin spectrofotometrie de absorbtie atomica in flacara, la lungimea de unda 213,9 nm. 2. Dozarea cuprului se efectueaza prin spectrofotometrie de absorbtie atomica in flacara, la lungimea de unda 324,8 nm. 3. Dozarea manganului se efectueaza prin spectrofotometrie de absorbtie atomica in flacara, la lungimea de unda 279,5 nm. 4. Dozarea fierului se efectueaza prin spectrofotometrie de absorbtie atomica in flacara, la lungimea de unda 248,3 nm. MODEL EXPERIMENTAL PRIVIND METODE DE TESTARE FARMACOTOXICOLOGICA A EXTRACTELOR STUDII FARMACOLOGICE "IN VITRO" IN SISTEM ACELULAR (CHIMIC) 1.Testarea potențialului de eliminare a radicalilor liberi prin metoda DPPH DPPH (1,1-difenil-2-picrilhidrazil) este un radical stabil organic cu azot avand maximul de absorbtie UV-VIS la 515nm. Solutia alcoolica DPPH este pusa in contact cu solutia proba; dupa reducere, culoarea solutiei scade, progresul reactiei fiind monitorizat prin citirea absorbantei la 515nm, timp de 30 minute, sau pana la stabilizarea absorbantei. 2 Evaluarea activitatii antioxidante totale prin metoda chemiluminiscentei. Intensitatea reactiei de chemiluminiscenta se masoara la Turner Biosystem 20/20 Analyzer comparativ cu un martor care nu a continut solutia proba. Toate determinarile se efectueaza in triplicat. Activitatea antioxidanta se calculeaza cu formula: AA% = [(Intensitatea martor Intensitatea proba) / Intensitatea martor] x Evaluarea activitatii antioxidante totale prin metoda fosfomolibdatului La 0,3 ml solutie proba se adauga 2,7 ml solutie reactiv fosfomolibdenic (0,6 M acid sulfuric, 28 mm fosfat de sodiu si 4 mm molibdat de amoniu). Amestecurile se incubeaza la 95 0 C timp de 90 min. Dupa racirea probelor la temperatura camerei, se masoara extinctia lor la 695 nm la un spectrofotometru UV-VIS. Capacitatea antioxidanta se exprima in echivalent acid ascorbic la 1 mg substanta activa. Curba de calibrare pentru acidul ascorbic este lineara in intervalul 0,001-1 mg/ml, n=5, r 2 =0,994. STUDII FARMACOLOGICE IN SISTEME BIOLOGICE "IN VIVO" Testarea toxicitații dupa doza unica: Probele de testat se administreaza in doza unica animalelor de laborator, pe cale orala, conform modului de administrare prevazut pentru uz uman. Acestea se tin sub observatie clinica timp de 14 zile pentru evaluarea potențialelor efecte toxice induse. Testarea activitații hipoglicemiante: Pentru testarea potentialului hipoglicemiant/hipololesterolemiant se utilizeaza sobolani, in numar de 10/lot. Inducerea diabetului se realizeaza prin adminstrarea de streptozotocina in doza unica de 60mg/Kg corp, in solutie de citrat de Na 10mM (ph = 4,5), pe cale intraperitoneala. Se determina glicemia de inaniție și nivelul colesterolului seric total. Testarea activitatii antiinflamatoare a) Modelul edemului urechii de soarece sau sobolan Pentru testarea actiunii antiinflamatoare se utilizeaza soareci sau sobolani, in numar de 10/lot si consta din producerea unei iritatii la nivelul pavilioanelor urechilor animalelor de experienta si din limitarea inflamatiei consecutive prin aplicarea produsului de testat. Efectul antiinflamator se evalueaza prin raportarea procentuala a rezultatelor lotului tratat, comparativ cu lotul animalelor iritate si netratate si cu lotul animalelor martor (neiritate si netratate). Intensitatea efectului antiinflamator (I) se apreciaza utilizand formula: I = 100 [1- (T-M/R-M)], unde: R - greutatea medie a probelor recoltate de la lotul iritat si netratat; T- greutatea medie a probelor recoltate de la lotul martor, iritat si tratat; M -greutatea medie a probelor recoltate de la lotul martor, neiritat si netratat. b) Modelul edemului labei de sobolan (prin diferiti agenti iritanti) RAPORT STIINTIFIC SI TEHNIC ETAPA I CONTRACT 174/2014 (MYCOIND) Page 7

8 Se utilizeza sobolani cu greutati intre 100 si 150g. Animalele sunt supuse injectarii subcutanate cu un volum de 0,05 ml din solutia de 1% de caragenina pe fata plantara a membrului posterior stang. Membrul respectiv este marcat vizual la nivelul maleolei laterale si intodus in lichidul de imersie al aparatului de masura pana la acest nivel. Volumul extremitatii este masurat pletismografic imediat dupa injectie si repetat la 3 si 6 ore, si chiar la 24 de ore de la provocare. BIBLIOGRAFIE 1. Ashagrie Z. Woldegiorgis, Dawit Abate, Gulelat D. Haki, Gregory R. Ziegler Antioxidant property of edible mushrooms collected from Ethiopia, Food Chemistry 157 (2014) Bhattacharya P.P. Srivastav H.N. Mishra Optimization of process variables for supercritical fluid extraction of ergothioneine and polyphenols from Pleurotus ostreatus and correlation to free-radical scavenging activity Aaccepted manuscript J. of Supercritical Fluids Chengxue Yi, Chaonan Suna, Shanshan Tonga, Xia Caoa, Yingshu Fenga, Caleb Kesse Firemponga, Xinyi Jianga, Ximing Xua, Jiangnan Yua; Cytotoxic effect of novel Flammulina velutipes sterols and its oral bioavailability via mixed micellar nanoformulation International Journal of Pharmaceutics 448 (2013) Dilani D. De Silva & Sylvie Rapior & Kevin D. Hyde & Ali H. Bahkali Medicinal mushrooms in prevention and control of diabetes mellitus Fungal Diversity (2012) 56: Gunawardena,D., Louise Bennett, Kirubakaran Shanmugam, Kerryn King, RoderickWilliams, Dimitrios Zabaras, Richard Head, Lezanne Ooi, Erika Gyengesi, Gerald Mnch Anti-inflammatory effects of ve commercially available mushroom species determined in lipopolysaccharide and interferon-c activated murine macrophages Food Chemistry 148 (2014) Etuk, E.U Animals models for studying diabetes mellitus Agric. Biol. J. N. Am., 2010, 1(2): Farmacopeea Romana ed.x, Ed. Medicala, Bucuresti, Hasan Hüseyin Dogan, Murad Aydıns Anda, Refik Uyanöz, Celaleddin Oztürk, and Ummühan Cetin Contents of Metals in Some Wild Mushrooms. Its Impact in Human Health Biol Trace Elem Res Apr;110(1): H. Gerhard Vogel Drug discovery and evaluation: pharmacological assays. Ed Springer , Huynh N.D. Bao, Yoshihiro Ochiai, Toshiaki Ohshima Antioxidative activities of hydrophilic extracts prepared from the fruiting body and spent culture medium of Flammulina velutipes Bioresource Technology 101 (2010) Inga Schneider, Gaby Kressel, Annette Meyer, Ulrich Krings, Ralf G Berger, Andreas Hahna Lipid lowering effects of oyster mushroom (Pleurotus ostreatus) in humans - JOURNAL OF FUNCTIONAL FOODS 3 (2011) Jayakumar, P.A. Thomas, J.R. Sheu, P. Geraldine In-vitro and in-vivo antioxidant effects of the oyster mushroom Pleurotus ostreatus Food Research International 44 (2011) Jean Mary Facchini, Endi Pricila Alvesb, Charlise Aguilerac, Regina Maria Miranda Gerna, Marcia Luciane Lange Silveira, ElisabethWisbeck, Sandra Aparecida Furlana Antitumor activity of Pleurotus ostreatus polysaccharide fractions on Ehrlich tumor and Sarcoma International Journal of Biological Macromolecules 68 (2014) Jimenez A.M.and. Novas M.J (2002)- Chemiluminescence Methods (Present and Future) Navas Grasas y AceitesVol. 53. Fasc. 1, León F, Quintana J, Rivera A, Estévez F, Bermejo J.Lanostanoid triterpenes from Laetiporus sulphureus and apoptosis induction on HL-60 human myeloid leukemia cells.j Nat Prod Dec;67(12): Klaus A, Kozarski M, Niksic M, Jakovljevic D, Todorovic N, Stefanoska I, Van Griensven LJ. The edible mushroom Laetiporus sulphureus as potential source of natural antioxidants. Int J Food Sci Nutr Aug;64(5): Kozhemiakina NV, Anan'eva EP, Gurina SV, Galynkin VA.[Conditions of cultivation, composition, and biological activity of mycelium of Flammulina velutipes (Fr.) P. Karst].Prikl Biokhim Mikrobiol Sep-Oct;46(5): Meghea, A, Iftimie, N, Giurginca, M, (2004).-The estimation of the antioxidant effect of plants extracts by chemiluminescence. REVISTA DE CHIMIE, 55 (12), pp Meghea, A; Iftimie, N; Giurginca, M; Papadopoulos, K, (2003). Oxidative stress quantifying in biosystems. I. Chemiluminescence testing of the antioxidant activity of some molecules of biological interest. Revista de chimie, 54 (11), pp RAPORT STIINTIFIC SI TEHNIC ETAPA I CONTRACT 174/2014 (MYCOIND) Page 8

9 20. Norton Nelson - A photometric adaptation of the somogyi method for the determination of glucose J. Biol. Chem : Olennikov DN, Agafonova SV, Stolbikova AV, Rokhin AV. Melanin of Laetiporus sulphureus (Bull.: Fr.) Murr sterile form, Prikl Biokhim Mikrobiol May-Jun;47(3): Parejo I, Codina C, Petrakis C, Kefalas P. (2000) Evaluation of scaveng-ing activity assessed by Co(II)/EDTA-induced luminol chemiluminescence and DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) free radical assay. J Pharmacol Toxicol Meth.; 44: Petrović J, Stojković D,Reis FS, Barros L, Glamočlija J, Ćirić A, Ferreira IC, Soković M. Study on chemical, bioactive and food preserving properties of Laetiporus sulphureus (Bull.: Fr.) Murr. Food Funct Jul 25;5(7): Prieto P., Pineda M., Aquilar M. 25. Spectrophotometric qantitation of antioxidant capacity through the formation of a phosphomolybdenum complex: specific application to the determination of vitamin E. //Analytical Biochemistry, 1999, p Rabin Gyawali, Salam A. Ibrahim Natural products as antimicrobial agents Food Control 46 (2014) Ríos JL, Andújar I, Recio MC, Giner RM. Lanostanoids from fungi: a group of potential anticancer compounds.j Nat Prod Nov 26;75(11): ; 27. Sanchez-Moreno, C. Larrauri, J.A., Saura-Calixto, F., (1998) A procedure to measure the antiradical efficiency of polyphenols. Journal of Agricultural adn Food Chemistry 76, Subrata Giri, Gunjan Biswas, Prakash Pradhan1 Subhash C. Mandal, Krishnendu Acharya1Antimicrobial Activities Of Basidiocarps Of Wild Edible Mushrooms Of West Bengal, India International Journal of PharmTech Research Vol.4, No.4, pp , ISSN : Oct-Dec Ulrike Grienke, Margit Zöll, Ursula Peintner, Judith M. Rollinger, European medicinal polypores A modern view on traditional uses, Journal of Ethnopharmacology 154 (2014) ACTIVITATEA 1.5. Elaborare de modele experimentale de testare a activitatii antimicrobiene a extractelor obtinute din macromicetele izolate. Studiu realizat de coordonatorul de proiect BIOTEHNOL Obiectiv: Metode de testare a activitatii antimicrobiene a extractelor obtinute din macromicetele izolate. Rezultate obtinute: s-au stabilit metodele de testare a activitatii antimicrobiene a unor extracte apoase si alcoolice realizate din cinci specii de macromicete recoltate din diferite zone: Agaricus campestris, Pleurotus ostreatus, Laetiporus sulphureus, Flammulina velutipes si Ganoderma lucidum. Pentru realizarea extractelor se va utiliza biomasa miceliana de la speciile de macromicete selectate, dezvoltata pe diferite tipuri de medii de cultura lichide (PD-potato-dextrose, ME-malt extract 2%, YPG - yeast peptone glucose). Inainte de efectuarea extractelor se va evalua influenta mediilor de cultura lichide asupra productiei de biomasa miceliana. Biomasa miceliana obtinuta pe fiecare varianta de mediu de cultura lichid va fi utilizata pentru realizarea extractelor. Pentru prepararea extractelor apoase la 1 g de biomasa miceliana se va adauga 1 ml de apa distilata, iar pentru prepararea extractelor alcoolice la aceeasi cantitate de biomasa se va adauga 1 ml de alcool etilic 70%. Aceste extracte vor fi utilizate pentru investigarea activităţii antimicrobiene a speciilor de macromicete luate in studiu. Culturile microbiene folosite pentru pentru determinarea activitatii antimicrobiene a extractelor fungice vor fi reprezentate din tulpini de drojdii patogene, precum Candida albicans, Candida parapsilopsis si specii de bacterii patogene, cum ar fi: Escherichia coli, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Pseudomonas fluorescens şi Pseudomonas aeruginosa. Din fiecare specie microbiana se vor realiza suspensii care se vor inocula pe suprafata unor medii de cultura solide specifice. Pe suprafata mediilor astfel inoculate cu suspensie microbiana se vor plasa discuri de hartie de filtru sterile imersate in prealabil in extractele apoase si respectiv alcoolice de Agaricus campestris, Pleurotus ostreatus, Laetiporus sulphureus, Flammulina velutipes si Ganoderma lucidum. Probele astfel pregatite vor fi incubate timp de 24 de ore la temperaturi optime pentru dezvoltarea culturilor microbiene (27 0 C pentru drojdiile patogene si 37 0 C pentru bacterii). Dupa perioada de incubare se va observa in jurul discurilor prezenta sau absenta halourilor de inhibitie a cresterii culturii microbiene. RAPORT STIINTIFIC SI TEHNIC ETAPA I CONTRACT 174/2014 (MYCOIND) Page 9

10 ACTIVITATEA 1.6. Elaborarea procedurilor:de insamantare a inoculilor obtinuti in vitro si de obtinere a compostului din deseuri naturale si de dezinfectie a acestuia Studiu realizat de coordonatorul de proiect BIOTEHNOL. Obiectiv: Stabilirea procedurilor de insamantare a inoculilor, de obtinerea a compostului din deseuri naturale si de dezinfectie a acestuia. Proceduri de insamantare Insamantarea se realizeaza prin incorporarea in substratul de cultura a miceliului crescut in flacoanele cu suport granulat (grau, orz) sau lemons (baghete, rumegus) inoculate cu tulpinile experimentale si incubate. Operatiunea se va executa intr-un spatiu inchis, perfect igienizat si dezinfectat, pentru a preveni orice posibila contaminare a miceliului si substratului cu microorganisme competitoare si/sau patogene. Pentru insamantarea cantitatilor mici de miceliu, in cazul testarilor din prima etapa la nivel de micropilot, insamantarea se va face in conditii de laborator, utilizand pentru aceasta hota sterila. Insamantarea cantitatilor mai mari de substrat, respectiv in etapa verificarii in ciupercarie a tulpinilor selectate, se va executa intr-o camera special amenajata, curata si dezinfectata in prealabil, prevazuta cu echipament de filtrare- conditionare a aerului. Miceliul pe suport granulat si cel pe rumegus se insamanteaza manual, fie prin metoda amestecarii in masa, fie prin cea a dispunerii in straturi alternative de miceliu-substrat lignocelulozic/compost. Ambele metode urmaresc o repartizare uniforma si un contact cat mai strans intre miceliu si substratul de cultura introdus in saci din polietilena/polipropilena. Pentru cantitatile mari de substrat, necesare in etapa finala a verificarilor din ciupercarie, insamantarea cu miceliul experimental se poate realiza mecanizat, in cadrul intreprinderii de la care se achizitioneaza in mod obisnuit substratul/compostul pentru productie. Norma de insamantare cu miceliu este de 1-2 % in cazul ciupercilor Agaricus si, respectiv, 2-4 % la Pleurotus si la celelalte specii lignicole studiate in cadrul proiectului. Miceliul pe suport de baghete se utilizeaza in cazul unora dintre tulpinile experimentale de ciuperci lignicole, la care substratul lignocelulozic necesita repartizarea in flacoane si sterilizarea inainte de a fi insamantate. Pentru fiecare flacon cu substrat de cultura se foloseste o singura bagheta lemnoasa impanzita cu miceliu, care va fi introdusa vertical in interiorul substratului din flacon, operatie executata la hota sterila. Pentru determinarea capacitatii de crestere a miceliului pe substraturile lignocelulozice (Pleurotus si celelalte speciile lignicole) si pe compost (Agaricus), cantitati mici din acestea vor fi repartizate in tuburi de sticla/eprubete (35x250 mm) inchise cu dopuri de vata. Dupa sterilizare in autoclav, 60 min la 121 C si racire, tuburile se inoculeaza la hota cu flux laminar cu miceliu pe suport granulat sau de rumegus, cate 4 repetitii/varianta. Ele vor fi apoi incubate in termostat, la C fara lumina. In perioada de incubare se vor efectua masuratori ale inaintarii frontului de miceliu in substrat la intervale de 3 zile si se va calcula media de crestere zilnica. Proceduri de obtinere a compostului din deseuri naturale si de dezinfectie a acestuia Substratul pentru speciile Agaricus si Pleurotus se prepara in general din paie de cereale si/sau alte deseuri/subproduse agricole lignocelulozice la care se adauga, ca principala sursa de azot, dejectii de cabaline si de pasari. In functie de sistemul de cultura aplicat si de materiile prime folosite, substratul pentru ciupercile Agaricus poate fi clasic-natural (gunoi de cal - balegar si asternut) si sintetic (gunoi de pasari si paie). Materiile prime sunt umectate si supuse unei prelucrari prin fermentatie autointretinuta in platforma, sub actiunea unor populatii de microorganisme aerobe (compostare). Populatiile microbiene din platforma se dezvolta si se inlocuiesc succesiv pe parcursul desfasurarii procesului. Succesiunea lor este in stransa legatura cu temperatura crescanda, cu umiditatea si gradul de oxigenare al compostului. La temperaturi crescute (peste 30 C), se dezvolta o microflora termofila care modifica substratul prin metabolismul lor. La un anumit stadiu al transformarii substratului, procesul este oprit prin intoarceri ale platformei, in scopul reoxigenarii, racirii si omogenizarii materialelor componente. Microflora termofila este inactivate astfel, la temperaturi mai mici (15-30 C), dar ramane ca o prezenta masiva in compost pe parcursul etapelor urmatoare, contribuind la selectivitatea finala a acestuia. La incheierea procesului de preparare, compostul poseda caracteristici care incurajeaza cresterea miceliului ciupercilor Agaricus si franeaza dezvoltarea fungilor concurenti. Dupa pasteurizare si conditionare, compostul avantajeaza selectiv miceliul ciupercii cultivate, asigurand predominanta acestuia in detrimentul potentialilor competitori (mucegaiuri). Rezultate obtinute: s-au stabilit procedurile de insamantare si de obtinere a compostului pentru ciupercile genului Agaricus, substratul de cultura pentru ciupercile Pleurotus si substraturile de cultura pentru alte ciuperci lignicole (xilofage), modul de preparare a compostului si procedurile de dezinfectie. RAPORT STIINTIFIC SI TEHNIC ETAPA I CONTRACT 174/2014 (MYCOIND) Page 10

11 Bibliografie 1. Zăgrean, A.V., Mateescu, N. (1994): Suport de crestere pentru miceliu intermediar-inocul de Pleurotus sp. si procedeu de realizare a acestuia. Brevet OSIM nr / ACTIVITATEA 1.7. Realizarea unui model experimental de obtinere la nivel laborator de extracte cu continut in substante active cu potential farmacologic (continuare in 2015) Studiu realizat de ICCF (P1). Obiectiv: Model experimental la nivel de laborator de obtinere a unui extract selectiv imbogatit cu substante active de interes. Testari preliminare MATERIAL SI METODA Pentru efectuarea modelului experimental la nivel laborator s-a utilizat ca materie prima vegetala macromiceta Agaricus campestris - uscata si macinata. Metoda de obtinere a extractelor a constat in: extractia principiilor active din 100g material vegetal cu 2000 ml cu apa/alcool etilic 50%(v/v) / alcool metilic 7-% (v/v), pentru fiecare extractie, raport planta / solvent = 1/20 (m/v) la reflux, cu agitare continua, timp de 2 ore, indepartarea deseului de planta prin filtrare, cand s-au obtinut solutii extractive apoase/hidroalcoolice. Aceaste solutii s-au concentrat la 60 C și presiune scazuta (72-75 mm Hg), la 100 ml solutii apoase/hidroalcoolice concentrate și s-au completat pana la 150 ml cu alcool etilic concentrat cand au precipitat substantele insolubile. Solutiile s-au lasat in repaos 24 ore. indepartarea substantelor insolubile s-a realizat prin centrifugare 30 minute la 3000rpm cand au rezultat extracte fluide ce au fost concentrate la 60 C și presiune scazuta (72-75 mm Hg), pana la 100 ml și apoi atomizate (fig.1). Extractele obtinute si caracteristicele acestora sunt prezentate in tabelul nr. 1. Solvent de extractie Apa Alcool etilic 50% Alcool etilic 70% Tabel nr. 1. Caracteristicile extractelor obtinute Masa atomizat 17,8g pulbere de culoare maro -deschis (bej) higroscopic cu gust si miros caracteristic 12,98g pulbere de culoare maro -deschis (bej) higroscopic cu gust si miros caracteristic 6,3g pulbere de culoare maro -deschis (bej) higroscopic cu gust si miros caracteristic In etapa a II-a a proiectului acest model experimental fi aplicat in activitatile ce implica obtinerea de extracte din speciile de macromicete selectate. Extractele obtinute vor fi analizate pentru determinarea compusilor de interes din punct de vedere farmacologic. In functie de rezultate se vor efectua separari specifice pentru clasa/clasele de compusi activi. RAPORT STIINTIFIC SI TEHNIC ETAPA I CONTRACT 174/2014 (MYCOIND) Page 11

12 Figura1. Model experimental de obtinere a unui extract ACTIVITATEA 1.8. Realizarea unei colectii de germoplasma fungica din speciile de ciuperci selectate Studiu realizat de BIOTEHNOL (CO). Obiectiv: Colectie de germoplasma fungica din speciile de ciuperci selectate. Rezultate obtinute. In urma desfasurarii acestei activitati s-a reusit realizarea unei colectii de germoplasma fungica din speciile de ciuperci selectate din diferite regiuni din tara. Aceasta colectie va fi imbogatita cu noi specii si varietati de macromicete indigene si va constitui baza urmatoarelor investigatii. Pe parcursul desfasurarii proiectului, dintre speciile de macromicete incluse in colectie, speciile Agaricus campestris, Pleurotus ostreatus, Laetiporus sulphureus si Flammulina velutipes vor fi investigate pentru proprietatle lor nutritionale si medicinale. Pentru capacitatea lor de a RAPORT STIINTIFIC SI TEHNIC ETAPA I CONTRACT 174/2014 (MYCOIND) Page 12

13 creste in cultura controlata se vor testa speciile de Agaricus campestris, Pleurotus ostreatus si Flammulina velutipes. MATERIALE SI METODE Pentru realizarea colectiei de germoplasma fungica, pentru inceput, au fost recoltate din diferite zone (Sinaia, Chitila, Teleorman, Voinesti si Bucuresti) 18 specii de ciuperci comestibile si/sau medicinale, urmand ca, ulterior, colectia sa se imbogateasca cu alte specii de ciuperci. Ciupercile au fost identificate si caracterizate de specialisti (tabelul 1). Tabelul 1.Speciile indigene de ciuperci comestibile si/sau medicinale si proprietatile lor utilizate pentru initierea colectiei de germoplasma fungica Specia Provenienta Proprietati Aspect morfologic Agaricus campestris Padurea Voinesti Comestibila Medicinala:Creste secretia de insulina; utilizata in tratamentul ulcerelor. Armillaria mellea Fundata Chitila Comestibila Medicinala (Sindrom Meniere, ameteala, epilepsie, neurastenii si hipertensiune), antioxidanta si antimicrobiana (Jiangsu Journal of TCM. 1980; Donnelly et al, 1985 Obuchi et al., 1990; Kalyoncu et al., 2010) Boletus edulis Fundata Comestibila Medicinala (proprietati antivirale, antiinflammatorii, antimicrobiene, antioxidante) (Chang and Miles, 2004; Shu-Yao T, 2007) Bovista plumbea Fundata Comestibila Medicinala (afectiuni ale capului, diabet, chisturi ovariene, acnee) (Jain, 1997) Coprinus sp. Bucuresticampus USAMV Comestibila dar cu precautie (otravitoare daca este consumata dupa alcool) Medicinala anti-tumorala (Ohtsukaet al., 1973), anti-fungica (Florianowicz, 2000) Fistulina hepatica Chitila Comestibila Medicinala- antibacteriana, antioxidanta (Ribeiro et al., 2007) RAPORT STIINTIFIC SI TEHNIC ETAPA I CONTRACT 174/2014 (MYCOIND) Page 13

14 Flammulina velutipes (Enokitake) Fundata Comestibila Medicinala- regleaza sistemul imunitar, antitumorala, antioxidanta (Bao et al., 2009) Ganoderma applanatum Chitila Medicinala - antibacteriana (inclusiv E. coli si Staphylococcus aureus), anti-inflamatoare, antitumorala, stimuleaza sistemul imunitar, homeostazie, carcinom esofagian, antireumatic, antivirala pentru HIV, etc. (Acharya et al., 2005). Ganoderma lucidum Teleorman Medicinala antioxidanta, regleaza sistemul imunitar si cardiovascular, hepatoprotectiv, anticancer, antibacterian (Clinical Biochemistry and Nutrition, 2007) Hericium coralloides Fundata Lepista nebularis (Clitocybe nebularis) Fundata Comestibila Medicinala-proprietati antibacteriane si nematicidale, anti-inflamatorii, anti- tumorale, regenerator ai nervilor, regenerator in distrofie musculara, Parkinson, Alzheimer si dementa (Mori et al., 2008; Mizuno et al, 1992; Mizuno and Takashi, 1995). Comestibila Medicinala- stopeaza proliferarea celulelor T (leucemie), are activitate antimicrobiana (Kim et al, 2008) Lepista nuda (Clitocybe nuda) Fundata Comestibila Medicinale- proprietati antioxidante si antimicrobiene (Dulger et al., 2002), efecte imunologice (Lyn et al., 2011) Laetiporus sulphureus Parcul Carol - Bucuresti Comestibila Medicinala activitati hemolitice si hemaglutinare (Mancheño et al., 2005), antimicrobiene si antioxidante (Turkoglu et al., 2007) Macrolepiota procera Chitila Comestibila Medicinala- proprietati antioxidante RAPORT STIINTIFIC SI TEHNIC ETAPA I CONTRACT 174/2014 (MYCOIND) Page 14

15 Pleurotus ostreatus Chitila Voinesti Comestibila Medicinala- proprietati cardiovasculare, hipertensive, hipercolesterolemice (Wasser, 2002), antioxidante si antimicrobiene (Vamanu, E., 2013) Trametes versicolor Sinaia Medicinala in a diverse forme de cancere (gastric, pulmonar, de san si de colon), hepatoprotectiv, herpes, Sindrom cronic de oboseala (Medicinal Mushrooms - A Clinical Guide by Martin Powell) Stropharia sp. Fundata Comestibila dar se consuma rar datorita gustului iute Medicinala- antitumorala (Ohtsuka et al., 1973), efecte neuromodulatrii (Moldavan et al., 2001) Xylaria polymorpha (Dead Man's Fingers) Fundata Medicinala- citotoxica asupra liniilor celulare canceroase (Shiono et al., 2009), activitate antibacteriana (Ramesh, 2012). Ciupercile proaspat recoltate au fost cultivate in vitro. Pentru cultivarea in vitro, intr-o prima etapa, corpul de fructificare al ciupercii a fost spalat cu apa distilata sterila. Cu ajutorul unui scalpel, din interiorul ciupercii au fost detasate segmente de miceliu care au fost apoi transferate in placi petri cu mediu PDA sau cu MEA (malt extract agar), dupa caz. Placile astfel inoculate au fost incubate la 25 0 C, la intuneric. Dupa cresterea miceliului pe suprafata mediului s-au detasat segmente de mediu cu miceliu (10x10 mm) care au fost transferate pe acelasi tip de mediu de cultura. Culturile pure astfel obtinute, reprezentand diferite specii de ciuperci, vor constitui colectia de gemoplasma fungica care va fi imbogatita, ulterior, cu alte specii si varietati de macromicete indigene. REZULTATE In functie de specia de macromicete, dupa 5-10 zile de incubare, pe ambele tipuri de medii de cultura utilizate, s-a dezvoltat miceliu (fig. 1). Mai mult, in cazul unor specii de macromicete, de la miceliul crescut pe suprafata mediului de cultura s-au dezvoltat primordii de corpi de fructificare (de ex. in cazul speciei Trametes versicolor, fig.1t ). De asemenea, s-a observat ca, in functie de specie, miceliul acestora dezvoltat pe suprafata mediilor de cultura prezenta culori si caracteristici morfologice diferite (fig. 1). RAPORT STIINTIFIC SI TEHNIC ETAPA I CONTRACT 174/2014 (MYCOIND) Page 15

16 A. Agaricus B. A. mellea C. A. mellea D. Boletus edulis E. Bovista plumbea F. Coprinus G. Flammulina velutipes H. Fistulina hepatica I. Ganoderma lucidum J. G. lucidum K. G. applanatum L. Hericium coralloides M. Lepista nuda N. Lepista nebularis O. Laetiporus sulphureus P. Macrolepiota procera R. Pleurotus ostreatus S. Strophoria aeruginosa T. Trametes versicolor U. Xylaria polymorpha Fig. 1. Colectie de germoplasma fungica RAPORT STIINTIFIC SI TEHNIC ETAPA I CONTRACT 174/2014 (MYCOIND) Page 16

17 CONCLUZII In urma desfasurarii acestei activitati s-a reusit realizarea unei colectii de germoplasma fungica din speciile de ciuperci selectate din diferite regiuni din tara. Aceasta colectie va fi imbogatita cu noi specii si varietati de macromicete indigene si va constitui baza urmatoarelor investigatii. Pe parcursul desfasurarii proiectului, dintre speciile de macromicete incluse in colectie, speciile Agaricus campestris, Pleurotus ostreatus, Laetiporus sulphureus si Flammulina velutipes vor fi investigate pentru proprietatle lor nutritionale si medicinale. Pentru capacitatea lor de a creste in cultura controlata se vor testa speciile de Agaricus campestris, Pleurotus ostreatus si Flammulina velutipes. Totodata, cultivarea in vitro a ciupercilor comestibie si/sau medicinale ar putea avea mai multe avantaje cum ar fi: cresterea ciupercilor este mai rapida in conditii in vitro decat in conditii naturale si nu depinde de sezon; miceliul obtinut pe mediile agarizate poate fi folosit in plantatie pentru inocularea diferitelor substraturi (busteni, diferite substraturi vegetale); metoda ofera posibilitatea pentru obtinerea de material biologic pentru tehnicile de genetica moleulara. ACTIVITATEA 1.9. Prepararea compostului din deseuri naturale: paie, rumegus, etc- pentru cultura ciupercilor selectate (continuare in 2015) Studiu realizat de CAMI MAR SRL- P2. Obiectiv: Stabilirea in plantatie a substraturilor naturale pentru cultura ciupercilor selectate. Rezultate obtinute: prin aceasta activitate, care va continua in etapa urmatoare, au fost redate cateva dintre retetele de substrat utilizate pentru cultivarea ciupercilor lignicole (xilofage), la noi in tara si in intreaga lume. Materiile prime sunt de natura lignocelulozica. In urmatoarea etapa, in plantatie, din substraturile de cultura a ciupercilor se vor alege si vor fi optimizate cele corespunzatoare culturii speciilor Agaricus campestris, Pleurotus ostreatus si Flammulina velutipes: Prepararea compostului din deseuri naturale: paie, rumegus, etc- pentru cultura ciupercilor selectate Reziduurile lignocelulozice rezultate in urma taierilor din plantatiile de vita de vie si cele de pomi fructiferi (corzi, crengi, ramuri), in culturile de plante leguminoase (vrejuri si teci de mazare, fasole, bob), precum si cele din procesarea legumelor, strugurilor (tescovina) si fructelor (samburi) constituie surse regenerabile importante de biomasa vegetala utilizabila pentru obtinerea de biocombustibili si/sau de hrana pentru oameni si animale. Biomasa lignocelulozica reprezentata de toate aceste deseuri si subproduse solide, provenite din exploatatiile agro-forestiere si din industriile procesatoare conexe, are o matrice structurala comuna constituita din macromoleculele celor mai raspanditi biopolimeri din natura: celuloza, hemiceluloze si lignina. Acestora li se adauga, in diferite proportii si minerale, pectina si proteine, in functie de provenienta materialului (Baldrian si Valaskova, 2008; Chang, 2010; Sanchez, 2010). Prepararea compostului pentru cultura in plantatie a speciilor de Agaricus Substratul pentru ciupercile champignon se prepara din paie de cereale si/sau alte deseuri/subproduse agricole lignocelulozice la care se adauga, ca principala sursa de azot, dejectii de cabaline si de pasari (Zagrean, 2008). In functie de sistemul de cultura aplicat si de materiile prime folosite, substratul pentru ciupercile Agaricus poate fi clasic-natural (gunoi de cal - balegar si asternut) si sintetic (gunoi de pasari si paie). Paiele de cereale reprezintă materialul vegetal care intră, practic, în compoziţia oricărui tip de compost pentru cultivarea ciupercilor champignon. Ele constituie principala sursă de celuloză, hemiceluloze şi lignină compusi pe care ciuperca îi utilizează în perioada creşterii miceliului şi a fructificării. Prin conţinutul lor în fosfor, potasiu, calciu şi magneziu, paiele asigură o nutriţie minerală eficientă a miceliului ciupercii în compost (tabel 1). Paiele contribuie la obţinerea unei structuri fizice corespunzătoare a compostului, atunci când sunt adăugate apa şi celelalte ingrediente. Prin elasticitatea lor, paiele participă la formarea spaţiilor cu aer din masa compostului. Acestea sunt necesare pentru asigurarea condiţiilor de aerobioză în timpul compostării, dar şi în timpul cresterii miceliului în compost. Pe de altă parte, prin capacitatea lor de a reţine apa, mai ales dacă sunt tasate în cursul operaţiei de îmbibare, paiele au un rol determinant în asigurarea umidităţii optime a compostului. Cele mai potrivite sunt paiele de grâu şi cele de secară, datorită faptului că fiind mai rezistente, pot menţine o textură mai fermă a compostului, în timpul prelucrărilor. Paiele de orz şi orez (material folosit cu predilecţie în Extremul Orient) pot constitui o alternativă bună. Mai puţin recomandată este utilizarea paielor de ovăz şi a fânului component al unor reţete de compost din S.U.A. Acestea au o fermitate redusă, absorb rapid apa şi îşi pierd textura foarte uşor în timpul prelucrărilor, ceea ce duce de cele RAPORT STIINTIFIC SI TEHNIC ETAPA I CONTRACT 174/2014 (MYCOIND) Page 17