TẠO CHỦNG Aeromonas hydrophila ĐỘT BIẾN NHƯỢC ĐỘC BẰNG PHƯƠNG PHÁP KNOCK-OUT GEN aroa

Transcription

1 TẠP CHÍ SINH HỌC 04, 6(se): 5- TẠO CHỦNG Aeromonas hydrophila ĐỘT IẾN NHƯỢC ĐỘC ẰNG PHƯƠNG PHÁP KNOCK-OUT GEN aroa Trương Ngọc Thùy Liên *, Vũ Thị Thanh Hương, Trần Thanh Tiếng, Nguyễn Quốc ình Trung tâm Công nghệ sinh học tp Hồ Chí Minh, TÓM TẮT: Với mục tiêu phát triển vaccine kháng lại sự xâm nhiễm của Aeromonas hydrophila trên cá, chủng A. hydrophila đột biến được tạo ra bằng phương pháp knock-out gen aroa, gen mã hóa 5- enolpyruvylshikimate -phosphate synthase. Đoạn giữa dài 68 bp của gen này được thay thế bằng gen kháng Kanamycin Km R tạo tổ hợp gen (cassette) aroa:km R. Chủng E. coli Sm0λpir chứa vector pgp704 có mang cassette aroa:km R được sử dụng để tiếp hợp với A. hydrophila hoang dã tạo chủng đột biến. Độc lực của chủng A. hydrophila đột biến được kiểm tra bằng phương pháp tiêm vào cá tra giống. Kết quả cho thấy LD50 của chủng đột biến lớn hơn 0 7 CFU/ml, trong khi chủng hoang dã có LD50 thấp hơn 0 CFU/ml. Như vậy, chủng M5 A. hydrophila đột biến bất hoạt gen aroa có độc lực thấp hơn nhiều (>.000 lần) so với chủng hoang dã ban đầu. Từ khóa: Aeromonas hydrophila, đột biến, knock-out gen, nhược độc, vaccine. MỞ ĐẦU Trong các bệnh thường gặp ở cá tra, bệnh nhiễm trùng huyết do Aeromonas hydrophila gây thiệt hại thứ hai, chỉ sau bệnh gan thận mủ, tỷ lệ gây chết có thể lên đến 80%. Hiện nay, người nuôi cá tra chủ yếu sử dụng kháng sinh để chữa bệnh cho cá, để giảm thiểu việc sử dụng kháng sinh việc nghiên cứu tạo vaccine rất cần thiết. Trong các phương pháp tạo vaccine, phương pháp knock-out gen tạo vaccine sống nhược độc là phương pháp phổ biến và rất hữu hiệu. Với chiến lược lựa chọn gen mục tiêu cho phương pháp knock-out gen, có hướng là loại bỏ yếu tố gây độc hoặc gây đột biến khuyết dưỡng. Trong đó, đột biến gen aroa là một đột biến khuyết dưỡng được nhiều nghiên cứu lựa chọn. Gen aroa mã hóa cho enzyme 5- enolpyruvylshikimate -phosphate synthase, là enzyme cần thiết cho sinh tổng hợp folate; các dòng đột biến gen aroa bị mất độc tính do không thể phát triển được trong mô vì không thể tự tổng hợp folate đồng thời không thể thu nhận được folate từ bên ngoài []. Thune et al. (999) [] đã sử dụng phương pháp knock-out để tạo chủng E. ictaluri đột biến gen aroa. Vaughan (99) [4] đã nghiên cứu về độc tính của Aeromonas salmonicida đột biến aroa trên cá hồi Atlantic (0 đến 5 g) kết quả ở nồng độ 0 6 CFU dòng đột biến không gây chết cá trong khi dòng hoang dại gây chết 00% cá ở cùng nồng độ. Priebe et al. (00) [] tạo đột biến loại bỏ gen aroa trên đối tượng Pseudomonas aeruginosa. Dòng đột biến được chứng minh nhược độc khi chủng qua cả đường mũi và màng bụng chuột với liều lên đến CFU đều không gây bệnh. Moral et al. (998) [] đã nghiên cứu gây đột biến khuyết dưỡng loại bỏ gen aroa làm mất độc tính của vi khuẩn A. hydrophila và dùng như vaccine cho cá hồi. Kết quả khi tiêm với nồng độ 0 8 CFU/ml vào cá hồi, chủng đột biến không gây bệnh, trong khi đó, 50% LD của dòng hoang dã là 0 6 CFU/ml. Ngoài đặc tính nhược độc, dòng đột biến gen aroa còn thể hiện tính an toàn khi đưa ra môi trường tự nhiên, điều này được chứng minh trong nghiên cứu của Vivas et al. (004) [5], dòng đột biến có khả năng sống sót trong nước thấp hơn so với dòng hoang dã và không tồn tại lâu trong môi trường nuôi cá. Từ những vấn đề trên, nghiên cứu này được tiến hành với mục tiêu tạo ra chủng Aeromonas hydrophila đột biến gen aroa (GeneID: ) nhược độc có thể ứng dụng làm vaccine cho cá tra và an toàn khi đưa ra môi trường tự nhiên. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Chủng Aeromonas hydrophila hoang dã được phân lập từ cá bệnh ở An Giang. Vi khuẩn được cấy trên môi trường RS (Rimler Shott) 5

2 Truong Ngoc Thuy Lien et al. (HiMedia) là môi trường đặc hiệu để phân lập A. hydrophila. Các dòng vi khuẩn thu nhận được sẽ được định danh bằng cách giải trình tự đoạn gen 6S ribosomal. Cá tra được ương nuôi từ giai đoạn noãn hoàng đến 7-0 g trong bể composite. Trước khi tiến hành thử nghiệm, cá (n=0) được kiểm tra sự hiện diện của A. hydrophila bằng cách cấy mẫu máu trên môi trường RS. Tạo chủng A. hydrophila nhược độc Tạo plasmid mang cassette aroa::km R Đoạn đầu HaroA và đoạn cuối TaroA của gen aroa được khuếch đại từ bộ gen A. hydrophila, gen kháng kháng sinh Kanamycin Km R được khuếch đại từ pcamia (Canada) bằng các cặp mồi (bảng ), chuyển vào pjet. lunt (Fermentas) và nhân dòng E. coli DH5α (Invitrogen). a đoạn gen này sau đó được cắt và nối với nhau bằng các enzyme cắt hạn chế SacI,, XbaI (New England iolabs) để tạo thành cassette aroa::km R có thứ tự nối như sau: HaroA-Km R -TaroA. Cassette có vùng đầu và cuối tương đồng với gen aroa, đoạn giữa là marker chọn lọc Km R. Casstte được chuyển vào plasmid pgp704 (Đại học Harvard) và được biến nạp E. coli Sm0 λpir (iomedal). Gen kháng Kanamycin được dùng với mục đích knockout đoạn gen aroa đồng thời là marker chọn lọc các dòng đột biến tạo thành ở các thí nghiệm tiếp theo. Tuy nhiên, do tính an toàn của vi khuẩn biến đổi gen, tránh sự phát tán gen kháng kháng sinh ra môi trường bởi hiện tượng chuyển gen ngang, các chủng đột biến sau khi tạo thành cần được loại bỏ gen kháng Kanamycin trong các nghiên cứu tiếp theo. Đó là lý do cặp mồi khuếch đại gen Km R được chèn thêm đoạn trình tự FRT 5 GAAGTTCCTATT CtctagaaaGtATAGGAACTTC là trình tự nhận biết của hệ thống λ Red Recombinase. ảng. Danh sách các cặp mồi sử dụng trong quá trình tạo cassette S TT Tên mồi Gen Trình tự aroa -F aroa -R aroa -F aroa -R FKm RKm HaroA TaroA Kanamycin (Km R ) 5 - AAGAGCTCTTGTGCCACCCGCAGTCTTGC AAGGATCCTTCACCGCGAAGCTGCG AAGGATCCATGCGGCCATGACCATCG AATCTAGATCACGCGCGCTGACTGAT - 5 AAGGATCCGAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATA GGAACTTCGGAATAGGAACTTCCCAGCCAGCCAA- 5- AAGGATCCAGTTCCTATTCCGAAGTTCCTATTC TCTAGAAAGTATAGGAACTTCCTAAAACAATTCATC CAGT- 4 aroa_f4 aroa 5 - GGAGCCGGTCAATCTGTTCC- 5 aroa_r4 aroa 5 - CGGGGATGTGGTTCATGTCC- 6 aroa_f5 aroa 5 - GCTGGTCAGCTTTATGGATGGC- 7 aroa_r5 aroa 5 - ATCTAGCCCGCACGGGCAG- 8 FpJET. 5'-CGACTCACTATAGGGAGAGCGGC-' 9 RpJET. 5'-AAGAACATCGATTTTCCATGGCAG-' Enzyme cắt hạn chế SacI XbaI Tiếp hợp E. coli Sm0 λpir mang cassette (chủng cho) và chủng A. hydrophila hoang dã (chủng nhận) được tăng sinh trong môi trường L đến giữa pha tăng trưởng (OD 600 =), sau đó dịch tăng sinh được bổ sung SA mg/ml và 0 mm MgSO 4. Chủng cho và chủng nhận được trộn chung theo tỷ lệ : 9, đưa hỗn hợp lên màng nitrocellulose (Whatman) có đường kính lỗ màng 0,45 µm. Màng được chuyển lên môi trường L agar bổ sung SA mg/ml và 0 mm MgSO 4 và phủ lên bằng L agar cùng loại, ủ ở 8 o C, 4 giờ. Vi khuẩn sau đó được thu nhận, trộn đều dịch vi khuẩn (resuspension) và cấy trải trên môi trường L agar bổ sung kanamycin và colistin, chọn lọc các dòng A. hydrophila mang cassette. Các khuẩn lạc thu nhận được sẽ được kiểm tra kiểu gen bằng PCR. 6

3 TẠP CHÍ SINH HỌC 04, 6(se): 5- với trình tự của gen aroa và gen kháng kanamycin (AAF657.) được công bố trên Genbank (không trình bày) chứng tỏ các đoạn gen đã được nhân dòng thành công. Thử nghiệm độc lực Chủng đột biến và hoang dã được tăng sinh trong môi trường L lỏng đến khi OD600 đạt,45 (khoảng 09 CFU/ml). Sinh khối vi khuẩn được ly tâm ở.00 g trong 5 phút ở 4oC, sau đó trộn đều dịch vi khuẩn và pha loãng trong NaCl 0,65% []. Cá được bố trí thí nghiệm trong bể plastic 00 lít, mỗi bể 0 cá. Nồng độ vi khuẩn tiêm vào cá, đối với chủng A. hydrophila hoang dã là 0, 04, 05, 06 CFU/ml, đối với chủng đột biến là 04, 05, 06, 07 CFU/ml, đối chứng âm tiêm nước muối 0,65%. Mỗi công thức lặp lại lần. Theo dõi và ghi nhận số lượng cá chết trong tuần. Các đoạn gen này được nối với nhau theo thứ tự ở hình. Cassette tạo thành được chuyển vào vector pgp704 và nhân dòng trong E. coli Sm0λpir. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm cắt plasmid nhân dòng với enzyme glii (hình d) cho thấy đã tạo được cassette và nhân dòng thành công plasmid pgp704 trong E. coli Sm0λpir. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Tạo cassette mang gen aroa đột biến Kết quả nhân dòng các đoạn HaroA (kích thước 54 bp), TaroA (kích thước 6 bp) được kiểm tra bằng cặp mồi FpJET./RpJET. cho sản phẩm kích thước lần lượt là 47 bp và 48 bp; cũng như kết quả nhân dòng gen KmR (kích thước 7 bp) được trình bày lần lượt ở hình A,, C. Các đoạn gen được giải trình tự và đối chiếu cho thấy có sự trùng khớp 99-00% A Hình. Sơ đồ cassette và các cặp mồi dùng cho phản ứng PCR kiểm tra chủng A. hydrophila đột biến bp C D 4 kb kb 500 bp 000 bp Hình. Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose % A: -6. Các dòng E. coli DH5α chứa plasmid pjet::haroa,. thang DNA, 7. đối chứng(-); : 5. Các dòng E. coli DH5α chứa plasmid pjet::taroa. 7. Thang DNA, 6. Đối chứng(-); C:. Khuẩn lạc E. coli DH5α chứa pjet::kmr,. thang DNA,. đối chứng (-); D:. Kết quả cắt plasmid pgp704 chứa cassette với glii,. Thang DNA,. pgp704 chứa cassette. 7

4 Truong Ngoc Thuy Lien et al. Tiếp hợp tạo chủng đột biến Do plasmid pgp704 có yếu tố di động mobrp4 cần thiết cho quá trình tiếp hợp, tuy nhiên, do mang vùng khởi đầu sao chép R6K nên để tự nhân lên trong tế bào, pgp704 cần có sự hiện diện của protein pi, mã hóa bởi gen pir. Do đó, pgp704 mang cassette aroa::kmr được biến nạp vào E. coli Sm0λpir, điều này giúp kiểm soát việc tái tổ hợp cassette từ pgp704 vào bộ gen của A. hydrophila. Chủng E. coli Sm0λpir mang cassette được tiếp hợp với A. hydrophila hoang dã để tạo chủng đột biến. Trong quá trình tiếp hợp, nhờ vào mobrp4, plasmid pgp704 mang cassette đột biến từ tế bào E. coli sẽ di chuyển vào tế bào A. hydrophila. Do có sự tương đồng giữa HaroA và TaroA với gen aroa, sẽ có sự trao đổi chéo tương đồng diễn ra giữa cassette trên plasmid pgp704 và gen aroa trên genome của A. hydrophila, kết quả là gen aroa bị knock-out và thay thế bằng cassette. ên cạnh đó, do A. hydrophila không có gen pir nên pgp704 không thể tự sao chép và nhân lên trong các thế hệ tế bào. A C Hình. Kết quả điện di trên gel agarose % sản phẩm PCR các khuẩn lạc thu nhận được sau tiếp hợp bằng cặp mồi aroa-f/r. Giếng - hình A,, C. Các khuẩn lạc sau tiếp hợp; giếng hình A,, C. Thang DNA; giếng hình A,, C. Đối chứng (-) Sau khi tiếp hợp, vi khuẩn được cấy trải trên L-kanamycin-colistin, kết quả thu được khuẩn lạc. khuẩn lạc này được PCR kiểm tra với cặp mồi aroa-f/aroa-r khuếch đại gen aroa, với dòng hoang dã sẽ cho băng kích thước,4 kb, dòng đột biến sẽ cho băng kích thước khoảng, kb. Kết quả điện di ở hình cho thấy, 8 có khuẩn lạc ở giếng hình A và giếng 4 hình C đều cho một băng duy nhất và có kích thước tương đồng với dòng đột biến dự kiến. Hai dòng vi khuẩn, kí hiệu lần lượt là M0 và M5, được tiếp tục kiểm tra bằng PCR với các cặp mồi 6S-F/6S-R, aroa-f4/aroa-r4, aroa-f5/aroa-r5, FKm/RKm, F-pGP704/R-

5 TẠP CHÍ SINH HỌC 04, 6(se): 5- pgp704 như ở hình và kết quả được trình bày ở hình 4. Kết quả PCR dòng M0 và M5 với cặp mồi 6S-F/6S-R, đều cho băng DNA kích thước 686 bp đặc hiệu cho A. hydrophila (giếng,, hình 4A). Tương tự khi sử dụng cặp mồi aroaf/aroa-r khuếch đại gen mục tiêu aroa, A D M0 và M5 (giếng, 4, hình 4) đều cho băng có kích thước khoảng, kb tương đương với kích thước cassette trong khi chủng hoang dã (giếng, hình 4) chỉ cho băng kích thước khoảng,4 kb. Hơn nữa, khi sử dụng cặp mồi FKm/RKm kiểm tra sự hiện diện của gen KmR, dòng M0 và M5 đều cho kết quả dương tính (giếng,4, hình 4E). Điều này cho thấy có sự hiện diện của cassette trong M0 và M5. C E F Hình 4. Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose %. A:. M0; 4. M5;.Thang DNA;. A. hydrophila hoang dã (+); 5. Chứng (-); :. M0; 4. M5; 5.Thang DNA;. A. hydrophila hoang dã (+);. Chứng (-); C:. M0;. M5;.Thang DNA; 4. A. hydrophila hoang dã (+); 5. Chứng (-); E:. M0; 4. M5; 5.Thang DNA;. pgp704::cassette (+);. Chứng (-); D:. M0; 4. M5; 5.Thang DNA;. A. hydrophila hoang dã (+);. Chứng (-); F:. M0; 4. M5; 5. Thang DNA;. pgp704::cassette (+);. Chứng (-). Đồng thời, khi sử dụng cặp mồi aroaf4/aroa-r4 khuếch đại đoạn giữa của gen aroa kích thước 68 bp, cả dòng dòng M0 và M5 (giếng,, hình 4C) đều cho kết quả âm tính, trong khi dòng hoang dã (giếng 4, hình 4C) cho kết quả dương tính chứng tỏ ở dòng M0 và M5, đoạn gen này đã bị loại bỏ. ên cạnh đó, khi kiểm tra với cặp mồi aroaf5/aroa-r5 phía ngoài gen aroa, dòng M0 và M5 (giếng, 4, hình 4D) cho băng DNA kích thước khoảng, kb lớn hơn so với dòng hoang dã (giếng, hình 4D) có kích thước khoảng,7 kb. Điều này chứng tỏ ở vị trí của gen aroa trong genome M0 và M5, đã có đột biến knock-out đoạn DNA kích thước 68 bp và thay thế bằng gen KmR kích thước khoảng, kb. Cuối cùng, cặp mồi F-pGP704/R-pGP704 đặc hiệu được sử dụng để kiểm tra sự tồn tại của plasmid pgp704, cả dòng M0 và M5 (giếng 9

6 Truong Ngoc Thuy Lien et al., 4, hình 4F) đều cho kết quả âm tính, điều này chứng tỏ plasmid pgp704 không tồn tại trong dòng vi khuẩn này. Những kết quả PCR kiểm tra trên cho thấy M0 và M5 là dòng A. hydrophila đột biến bất hoạt gen (knock-out gen) aroa. Đánh giá độc lực chủng đột biến gen aroa bằng phương pháp tiêm Kết quả thử nghiệm độc lực của chủng A. hydrophila hoang dã và đột biến M5 được trình bày ở bảng. Chủng hoang dã được tiêm vào cá với các nồng độ 0, 0, 0 4, 0 5 CFU/cá còn chủng đột biến được tiêm với các nồng độ 0, 0 4, 0 5 và 0 6 CFU/cá. Kết quả ở với nồng độ 0 CFU/cá, chủng hoang dã gây chết 77% cá, trong khi đó chủng đột biến với nồng độ 0 4 CFU/cá vẫn không gây chết cá. Chủng đột biến chỉ bắt đầu gây chết 0% cá ở nồng độ tiêm 0 5 CFU/cá và 40% cá ở nồng độ tiêm 0 6 CFU/cá. Cá chết đều có biểu hiện bệnh và có sự hiện diện của A. hydrophila trong máu. Rõ ràng kết quả trên cho thấy, chủng đột biến có độc lực thấp hơn hơn.000 lần so với chủng hoang dã. ảng. Kết quả thử nghiệm độc lực chủng A. hydrophila hoang dã và đột biến A. hydrophila hoang dã A. hydrophila đột biến Đối chứng (-) Nồng độ tiêm (CFU/cá) NaCl 0,65% Cá chết (%) Khi so sánh với kết quả của Moral (998) [], LD50 của dòng hoang dã là 0 6 CFU/ml còn với dòng đột biến gen aroa, 0 8 CFU/ml vẫn chưa gây chết cá, ở đây có sự chênh lệch độc lực khoảng 00 lần ở dòng đột biến và hoang dã. Tuy nhiên, chủng A. hydrophila hoang dã phân lập ở trên có độc lực cao hơn (LD50<0 CFU/ml) chủng hoang dã trong thí nghiệm của Moral (LD50=0 6 CFU/ml), vì vậy, chủng nhược độc ở 0 6 CFU/ml (tương ứng với 0 5 CFU/cá) đã gây chết 0% cá. Điều này đặt ra vấn đề là khi dùng làm vaccine, với nồng độ 0 5 CFU/ml có đủ để kích thích đáp ứng miễn dịch trên cá hay không và có nên dùng chủng có độc lực cao để tạo vaccine nhược độc hay không. KẾT LUẬN Chủng M5 A. hydrophila đột biến bất hoạt gen aroa có độc lực thấp hơn nhiều (>.000 lần) so với chủng hoang dã ban đầu. Tuy nhiên, cần đánh giá khả năng gây đáp ứng miễn dịch của dòng đột biến này kháng lại bệnh nhiễm trùng huyết trong hướng sử dụng làm vaccine. TÀI LIỆU THAM KHẢO. Moral C. H., del Castillo E. F., Fierro P. L., Cortés A. V., Castillo J. A., Soriano A. C., Carrasco G. N., 998. Molecular characterization of the Aeromonas hydrophila aroa gene and potential use of an auxotrophic aroa mutant as a live attenuated vaccine. Infect. Immun., 66(5): Priebe G. P., Mary M.., Hatano K., Grout M., Fadie T. C., Gerald. P., Joanna. G., 00. Construction and characterization of a live, attenuated aroa deletion mutant of Pseudomonas aeruginosa as a candidate intranasal vaccine. Virginia. USA.. Thune R. L., Fernandez D. H., attista J. R., 999. An aroa mutant of Edwardsiella ictaluri is safe and efficacious as a live, attenuated vaccine. J. Aquat. Anim. Health, (4): Vaughan L. M., Smith P. R., Foster T. J., 99. An aromatic dependent mutant of the fish pathogen Aeromonas salmonicida is attenuated in fish andis effective as a live vaccine against the salmonid disease furunculosis. Infect. Immun., 6: Vivas J., Carracedo., Riaño J., Razquin. E., López-Fierro P., Acosta F., Villena A. J., 004. ehavior of an Aeromonas hydrophila aroa live vaccine in water microcosms. Appl. Environ. Microbiol., 70(5):

7 TẠP CHÍ SINH HỌC 04, 6(se): 5- A STUDY ON CREATING AN ATTENUATED Aeromonas hydrophila MUTANT STRAIN Y KNOCKING OUT aroa GENE Truong Ngoc Thuy Lien, Vu Thi Thanh Huong, Tran Thanh Tieng, Nguyen Quoc inh SUMMARY iotechnology Center of Ho Chi Minh City In order to develop live attenuated vaccine against Aeromonas hydrophila infection in fish, Aeromonas hydrophila mutant strain was created by knocking out the aroa gene, encoding 5-enolpyruvylshikimate - phosphate synthase. A 68 bp middle fragment of this gene was replaced by kanamycin resistance gene Km R to make the cassette aroa::km R. The E. coli Sm0 λpir strain carrying suicide pgp704 plasmid with aroa::km R was used as donor in conjugation with A. hydrophila wild type to create the mutant. The toxicity of the mutant strain was determined by intra-peritoneal injection into Tra catfish fingerlings. The results showed that the LD50 of the mutant strain was >0 7 CFU/ml, whereas that of the wild type strain was <0 CFU/ml. Keywords: Aeromonas hydrophila, attenuated, knockout gene, mutant, vaccine. Ngày nhận bài: 5-7-0