و eae( انتروپاتوژنیک کلی اشریشیا و )eae و Stx2 Stx1( انتروهموراژیک کلی اشریشیا )STa F41 )K99 انتروتوکسیژنیک ژن

Transcription

1 b DOI: b 1396 تابستان 115 شماره سازندگی و پژوهش DOI: /vj سه کلی اشریشیا حدت فاکتورهای مولکولی شناسایی برههای و گوسالهها EPEC و ETEC EHEC سویه شیراز اسهال به مبتال ارجمندپور پریسا دانشگاه علوم دانشکده شناسی زیست گروه ارشد کارشناسی دانشجوی تحقیقات علوم واحد سیرجان اسالمی آزاد مسئول( )نويسنده تهمتن یحیی سازمان شیراز شعبه رازی سازی سرم و واکسن تحقیقات موسسه ایران تهران کشاورزی ترویج و آموزش تحقیقات ۹۵ تیر پذيرش: تاريخ 94 ماه دی يافت: تاريخ yahyatahamtan@yahoo.com چكيده هب تولد از پس روزهای نخستین بهویژه برهها و گوسالهها )EPEC و ETEC EHEC( پاتوژن سویههای از ناشی اسهال گوسالههاو از رکتوم سوآب 200 تحقیق این طی است. برخوردار زیادی اهمیت از حاصله اقتصادی خسارات و تلفات علت روی بر نمونهها شد. جمعآوری شیراز شهرستان 1393( ) 1392 تا سال یک مدت اسهال به مبتال روزه 30 تا یک برههای یلک اشریشیا بیماریزای ژنهای شیوع مطالعه این شد. داد کشت مینکا و ائوزین-متیلنبلو و مککانکیآگار محیطهای )bfpb و eae( انتروپاتوژنیک کلی اشریشیا و )eae و Stx2 Stx1( انتروهموراژیک کلی اشریشیا )STa F41 )K99 انتروتوکسیژنیک ژن هرسه دارای صد 12/03 جداشده کلی اشریشیا 133 از داد نشان نتایج شد. بررسی Multiplex PCR تکنیک از استفاده با هک داد نشان K99 حدت ژن توالی تعیین همچنین میباشند. EHEC بیماریزای ژن سه هر دارای صد سه و ETEC بیماریزای پراکندگی دارد. شباهت ژنی بانک موجود رفرنسهای نوکلئوتیدی توالیهای با صد 100 تا 97 آنها نوکلئوتیدی توالی نس مدیریتی عوامل از ناشی میتواند تفاوتها این میباشد. متفاوت جهان مختلف مناطق مذکور سویه سه با عفونت شیوع باشد. باردار ماان واکسیناسیون و آن کیفیت و حجم آغوز یافت زمان گوسالهها فارس PCR پاتوژن کلیهای اشریشیا حدت فاکتورهای کلیدی: کلمات

2 اشریشیاکلی... حدت فاکتورهای مولکولی شناسایی Veterinary Journal (Pajouhesh & Sazandegi) No 115 pp: Molecular Identification of Virulence Factors of E. coli in Three Strains of ETEC, EHEC and EPEC in Calves and Lambs with Diarrhea in Shiraz By: Arjmandpout, P., MSC Student, Department Biology, Science Faculty, Sirjan Islamic Azad University, Shiraz Branch Research Science. Tahamtan, Y., (Corresponding Author) Razi Vaccine and Serum Research Institute, Branch, Agricultural Research, Education and Extension Organisation (AREEO), Tehran, Iran. Received: Accepted: Pathogenic E.coli (ETEC, EHEC and EPEC) cause diarrhea in new born calves and lambs are important especially due to mortality rate and high economic losses. In this study 200 rectal swab samples were collected from 1-30 day-old calves and lambs with diarrhea during in Shiraz. The samples were inoculated on Mac Conkey, EMB and Minca agar media. The presence of various virulence genes of ETEC (k99, F41 fimbria and Sta), EHEC (Stx1, Stx2 and eae) and EPEC (bfpb and eae) was investigated using multiplex PCR. The PCR test results showed that out of 133 E. coli isolates, 12.03% and 3% possessed all three virulence genes of ETEC and EHEC, respectively. The sequencing of K99 gene showed % homology between the isolates. The variety of ETEC, EPEC and EHEC prevalence has been reported in the world. These variations could be due to managing factors, calves age, colostrum intake and dam vaccination. Key words: Pathogenic E. coli, Virulence Factors, PCR, Fars مقدمه روي بر سادگي به كه است متحركي ارگانيسم اشريشياكلي و هوازی باکتری این ميكند. رشد خوبي به معمولي كشت محيطهاي گرد کلنیهای مککانکیآگار محیط روی بر و است اختیاری هوازی بی فلزي جالي يك با آن كلنيهاي میکند. ایجاد صورتی و صاف برجسته )تبدیل اندول تست شدن مثبت و )EMB( ائوزينمتيلنبلو آگار روي بر باکتریها این ميشود داده تشخيص سرعت به اندول( به تریپیتوفان از اشریشیاکلی هستند. پیلی دارای همچنین و میباشند مثبت الکتوز باکتریها این از برخی اما است حیوانات روده مجاری طبیعی ساکنین بیماری مهمترین که کرده بیماری ایجاد بیماریزا فاکتورهای بودن دارا با گوسالهها اسهال ایجاد عامل مهمترین عنوان به باکتری این است. اسهال هک ویژگیهایی )6(. است شده شناخته زندگی اول روزهای برهها و به باکتری اتصال نوع شامل میدهند تشکیل را سیستمویروتیپ اساس وعوامل توکسین تولید میزبان سلولهای روی اتصال تأثیر میزبان سلول سرولوژی گروه یک از بیش معموال ویروتیپ یک باشند. می تهاجمی اسهال ایجاد که کلی اشریشیا پاتوتیپهای اساس این بر دارد. وسروتیپ کلی اشریشیا )ETEC( انتروتوکسیژنیک کلی اشریشیا شامل کنند می اشریشیا )EHEC( انتروهموراژیک کلی اشریشیا )EPEC( انتروپاتوژنیک و )EIEC( انترواینویسیو کلی اشریشیا انترواگریگیتیو) EAggEC ( کلی )12(. میباشند پراکنده) DAEC ( چسبندگی با اشریشیا اسهال شکل به رودهای عفونت نقش با ارتباط فراوانی گزارشات انتروتوکسیژنیک سویه خصوص به کلی اشریشیا پاتوژن سویههای توسط چه شده تازهمتولد بره و گوساله انتروهموراژیک و انتروپاتوژنیک خاصی سویههای است. شده منتشر جهان مناطق سایر چه و کشور داخل اشریشیا و )ETEC( انتروتوکسیژن کلی اشریشیا مانند کلی اشریشیا از اثبات اما )1(. هستند مرتبط اسهال ایجاد با وروتوکسین کننده تولید کلی ایجادکننده باکتریهای مهمترین EHEC و ETEC EPEC که است شده هستند خصوصیاتی واجد گروه سه این باکتریهای )13(. هستند اسهال را نقش مهمترین که فرد به منحصر فاکتورهای و تکثیر بقا قت قبیل از ETEC سویه باکتریهای ویژگی مهمترین میکنند. ایفا بیماری ایجاد و شده مخاط به آن اتصال سبب که است باکتری سطح فیمبریه وجود بیماریزا باکتری این توسط سم نوع دو کلی طور به میکنند. تولید سم حرارت به مقاوم سم 2- و حرارت به حساس سم 1- میگردد تولید حرارت) STa ( به مقاوم سم گوساله از شده جدا باکتریهای تمام تاکنون )19(. نمودهاند راتولید عمدتا که است نوزادان اسهال عمده عامل EPEC سویه فاکتور دارای سویه این )13(. میباشد بیماریزا توسعه حال کشورهای پالسمید توسط که میباشد )EPEC adherence factor (EAF(( پیوستگی میباشند EAF فاقد که EPEC از سویههایی میشود. کد دالتونی مگا 60 bfp (bundle- نام به نانومتر هفت قطر به فیمبریهای دارای )ATEC( همکاران و جیرون توسط 1991 سال که میباشند )forming pilus موثر سویه این بیماریزایی که دیگری فاکتور است) 13 (. شده گزارش EPEC سویه شناسایی برای bfp و eae ژن دو این از است. فاکتورeae است از سویههایی )13(. میشود استفاده atypical و typical آن رده دو و typical دسته جز هستند bfp و eae ژن دو هر دارای که.E coli باکتری typical EPEC دسته جز هستند bfp ژن فاقد که هایی سویه و EPEC 28

3 1396 تابستان دامپزشكی نشريه 115 شماره )13(. شدهاند طبقهبندی اپیدمیولوژیکی مشاهده دو طبق بر همکاران و رایلی 1983 سال کردند معرفی E.coli باکتری از بیماریزا سویه یک عنوان به را EHEC سویه همراه به آبکی اسهال و شدید گوارشی بیماریهای باعث سویه این )18(. )وروتوکسین( سیتوتوکسین تولید به قا تنها نه که میشود شکمی د )17(. دارند) 4 ( نیز را روده مخاط به اتصال توانایی بلکه میباشند پالسمید hlya ژن )توسط همولیزین دارای EHEC سویههای تمام stx2 و stx1 ژنهای )توسط مانند شیگال سم یک میشود( کدگذاری intimin نام به دالتون کیلو 97 وزن به پروتئینی و میشود( کدگذاری )10(. میباشند میشود( کدگذاری eaea ژن )توسط عوامل ژنهای بررسی به که مولکولی نوین روشهای امروزه هب نسبت که میشوند معمول روشهای جایگزین میپردازند بیماریزایی حساسیت عدم بودن وقتگیر همچون ضعفی نقاط مولکولی روشهای روشهای دارند. نمونه تیمار پیش به نیاز همچنین و باال اختصاصیت و اختصاصی ژنهای جستجوی برای Multiplex PCR روش جمله از مولکولی و حساسترین جدیدترین از کلینیکی نمونههای بیماریزایی عوامل عفونتها فراوانی تعیین برای امروزه که است روشهایی اختصاصیترین )11(. دارد کاربرد طرف یک از بیماری یک شیوع میزان از صحیح ک که آنجا از و مسئولین به میتواند دیگر طرف از و میدهد نشان را بیماری آن اهمیت پیشگیری برای مناسب روشهای اتخاذ بیماری با مبارزه دستانکاران حاضر مطالعه لذا نماید کمک مختلف سطوح بیماری کنترل و مورد دام.E coli از ناشی اسهال بیماری کننده ایجاد عوامل شناسایی گرفت. قرار بررسی کار روش و مواد گوساله رکتوم مخاط از سواب نمونه سالهای شیراز شهرستان مختلف نواحی از اسهالی روزه 30 تا یک برههای و حاوی پیچدار لولههای مدفوع نمونه حاوی سواب گردید. جمعآوری مؤسسه شناسایی باکتری آزمایشگاه به )TSB) trypticase soy broth محیط و مککانکیآگار محیطهای روی بر نمونهها شد. داده انتقال شیراز رازی مورفولوژیکی تستهای از شد. داده خطی کشت ) بلو متیلن )ائوزین EMB VPبه و TSI MR اوره سیترات بیوشیمیایی آزمونهای گرم رنگآمیزی موجود باکتریهای سایر از E.coli باکتری جداسازی و شناسایی منظور برای Sta و K99 F41 اختصاصی پرایمرهای از گردید. استفاده نمونه شناسایی برای eae و Stx1 Stx2 پرایمرهای ETEC باکتری شناسایی EPEC باکتری شناسایی برای eae و Bfp پرایمرهای و EHEC باکتری ترتیب به قطعههای ازدیاد منظور به eae و eae Bfp Stx2 Sta Stx1 F41 K99 ژنهای بازی جفت کشور ساخت اپندورف دستگاه از استفاده با و PCR تکنیک از استفاده با ازسواب ساعت 24 کشت DNA استخراج برای 1(. ) گردید استفاده آلمان از استفاده با DNA و گردید سانترفیوژ و شد برداشته TSB محیط رکتوم پروتکل مطابق سیناژن شرکت ساخت )DNP TM( استخراج تجاری کیت 25 شامل ترموسیکلر دستگاه PCR دمایی برنامه گردید. استخراج کیت 45 مدت به جه 50 دمای ثانیه 30 مدت به جه 94 دمای و سیکل مدت به جه 70 نهایی دمای و ثانیه 90 مدت به جه 70 دمای و ثانیه از بعد و شد داده انتقال آگارز ژل به PCR محصول سپس بود. دقیقه 10 با مقطر آب و بروماید اتیدیوم از استفاده با ژل رنگبری و آمیزی رنگ گردید. مشاهده داک ژل دستگاه و فرابنفش اشعه از استفاده نتایج رنگآمیزی کشت های روش از استفاده با رکتوم سوآب نمونه 200 از منظور به شد. جداسازی E.coli باکتری 133 بیوشیمیایی های تست و گرم پرایمرهای از استفاده با EHEC و ETEC EPEC سویههای شناسایی گرفت. انجام PCR تست نمونهها تمامی برای شده ذکر اختصاصی صد( )12/03 16 جداشده E.coli 133 از که داد نشان PCR نتایج F41 فاکتور دارای صد( )18/04 جدایه 24 K99 فاکتور دارای جدایه )12/03 جدایه 16 تنها و STa فاکتور دارای صد( )15/78 جدایه 21 و 1(. )شکل بودند هم با ژن سه این دارای صد( شده جدا E.coli 133 از که داد نشان EHEC سویه برای PCR نتایج صد( )12/03 جدایه 16 Stx1 فاکتور دارای صد( )9/77 جدایه 13 هشت eae فاکتور دارای صد( )13/53 جدایه 18 Stx2 فاکتور دارای همزمان طور به Stx2 و Stx1 فاکتور دو هر دارای صد( )6/01 جدایه داشتند هم با همزمان طور به را فاکتور سه هر صد( )سه جدایه چهار از سویه این که داد نشان EPEC سویه برای PCR تست نتایج 2(. )شکل نشد. جدا نمونهها از کدام هیچ به مربوط صد( )27 نمونه 37 آمده بدست نمونه 133 از نهایت بودند EHEC گروه به مربوط صد( )26/31 نمونه 35 و ETEC گروه )45/86 نمونه 61 ضمنا نشد. یافت نمونهای هیچ EPEC سویه و نشد. یافت فوق گروه سه از هیچکدام به مربوط باکتری صد( دو به برهها آلودگی میزان داد نشان آمده بدست نتایج کلی طور به به آنها آلودگی میزان همچنین و بوده صفر EPEC سویه و ETEC سویه میزان بین معنیداری آماری ارتباط آمد. بدست صد 4/51 EHEC سویه p(. > )0/05 نیامد بدست برهها باکتری گروه سه این به آلودگی ETEC سویه به گوسالهها آلودگی میزان داد نشان نتایج گوسالهها مورد میزان بین میباشد. صفر EPEC و صد EHEC صد 30.8 بدست معنیداری آماری ارتباط گوسالهها باکتری گروه سه این آلودگی دو به بزها آلودگی میزان داد نشان نتایج بزها مورد p(. > )0/05 آمد صد 0/25 /3( )120 EHEC سویه به اما بوده صفر EPEC و ETEC سویه به آلودگی میزان بین معنیداری آماری ارتباط نیز مورد این آمد. بدست )2(. p(. > )0/05 نیامد بدست بزها باکتری گروه سه این بحث از صد 27/81 که شد مشخص کلی طور به حاضر مطالعه برهها از کدام هیچ حالیکه شدهاند آلوده ETEC سویه به گوسالهها 19/54 برهها از صد 4/51 بودند. نشده آلوده سویه این توسط بزها و بودند شده آلوده EHEC سویه به بزها از صد 2/25 و گوسالهها از صد EHEC سویه صد 26/31 شده جداسازی نمونه 133 از کلی طور به و مطالعاتی با فراوانیها این شد. جداسازی ETEC سویه صد 27/81 و متفاوت است گرفته انجام مختلف مناطق محققین سایر توسط که 29

4 اشریشیاکلی... حدت فاکتورهای مولکولی شناسایی فراوانی پژوهشهای انتروتوکسیژنیک اشریشیاکلی سویه مورد میباشد. بخصوص حیوانات سویه این حضور از نشان که است شده انجام این زندگی اول هفته سویه این عفونت شیوع و برهها و گوسالهها کشمیر 2013 سال همکاران و وانی مطالعه جمله از دارد. حیوانات برههای از صد پنج و بیمار گوسالههای از صد هشت کردند اعالم که هیچ که داشتند اظهار و بودند ETEC سویه به آلوده اسهال به مبتال و شبانا ندارد) 24 (. حضور ETEC سویه سالم برههای و گوسالهها از کدام مبتال گوسفندهای و گاو روی بر که مطالعهای 2014 سال همکاران ETEC سویه به نمونهها از صد 2/2 که کردند اعالم دادند انجام اسهال به بره گوساله روی بر که بررسیهایی طی مطالعه این شدهاند) 20 (. آلوده عوامل ژنهای شیوع میزان گرفت انجام شیراز اسهال به مبتال بز و اشریشیاکلی STa انتروتوکسین و F41 و K99 فیمبریه بیماریزایی و صد 18/04 صد 12/03 ترتیب به گوسالهها انتروتوکسیژنیک با را ژن سه هر نمونهها از صد 12/03 و گردید تعیین صد 15/78 نشد. یافت بز و بره از حاصل نمونههای فاکتور سه این اما داشتند. هم K99 فراوانی میزان چین شرق 2004 سال همکاران و چن مطالعه کردند) 5 (. اعالم صد پنج انتروتوکسیژنیک اشریشیاکلی را F41 و فراوانی این فرانسه 1982 سال همکاران و نسیری تحقیق نتایج مطالعاتی سویه این روی بر هم ایران داد) 11 (. نشان صد 6/1 را که 1389 سال همکاران و کیانی مطالعه جمله از است گرفته انجام 1/5 که کردند اعالم و کردند کار روزه 30 تا یک گوسالههای روی بر صد هشت و Sta و F41 فاکتور صد دو F41 فاکتور نمونهها از صد RCP استفاده مورد اختصاصی پرایمرهای الیگونوکلئوتیدی توالی 1- جدول پرایمر) bp ( اندازه -- پرایمر توالی زا بیماری عامل K99 TATTATCTTAGGTGGTATGG GGTATCCTTTAGCAGCAGTATTTC 314 F41 GCATCAGCGGCAGTATCT GTCCCTAGCTCAGTATTATCACCT STa GCTAATGTTGGCAATTTTTATTTCTGTA AGGATTACAACAAAGTTCACAGCAGTAA 380 Stx1 )TTCGCTCTGCAATAGGT(A )TTCCCCAGTTCAATGTAAGA(T Stx2 )GTGCCTGTTACTGGGTTTTTCTT(C )AGGGGTCGATATCTCTGTC(C 190 Eae CCGGAATTCGGGATCGATTACCGTCAT CCCAAGCTTTTATTTATCAGCCTTAATCTC 555 Bfp GACACCTCATTGCTGAAGTCG CCAGAACACCTCCGTTATGC

5 شماره 115 نشريه دامپزشكی تابستان 1396 از نمونهها هر سه فاکتور را با هم داشتند) 2 (. بررسی شمس و همکاران سال 2012 استان فارس با استفاده از روش مولکولی و سرولوژی به شناسائی دو فاکتور K99 و F41 از گوسالههای یک تا 30 روزه پرداختند و اعالم کردند که 5/3 صد از نمونهها برای فاکتور K99 مثبت بودند و همه باکتریهای اشرشیاکلی جدا شده ژن F41 را داشتند) 21 ( صورتیکه مطالعه لطفالهزاده و همکاران سال 1383 که با روشآگلوتیناسیون شهرستانهای بابل و قائمشهر انجام گرفت این میزان 1/07 صد گزارش شد) 3 (. به نظر میرسد که بخشی ازتفاوتها مربوط به متفاوت بودن میزان شیوع اسهال ناشی از ETEC این مناطق باشد ضمن اینکه حساسیت و ویژگی روشهای به کار رفته نیز متفاوت میباشد. مطالعات دیگر که توسط سایر محققین این زمینه انجام شده است صد فراوانی بیشتری را نسبت به این مطالعه و مطالعات ذکر شده باال نشان میدهند. برای مثال مطالعهای که 7 هفت منطقه اروپا جهت بررسی عوامل ایجاد کننده اسهال عفونی گوسالهها توسط سانلند و همکاران سال 2003 انجام گرفت میزان شیوع اشریشیاکلی K99 از هشت تا 46 صد گزارش گردید) 22 (. مطالعهای که بخشهایی از ترکیه انجام شد نشان داده شد که 16 صد از گوسالههای مبتال به اسهال دارای اشریشیاکلی K99 بودهاند) 8 (. رابطه با دو سویه EHEC و EPEC حیوانات مطالعات متعددی مناطق مختلف انجام و میزان حضور ژنهای بیماریزا مورد بررسی قرار گرفته است. مطالعه حاضر حضور سویه EHEC و EPEC گوساله بره و بز نیز مورد بررسی قرار گرفت و نتایج حاصله نشان داد که 75 صد از برهها و سه صد از گوسالهها دارای توکسین Stx1 25 صد از برهها و 10 صد از گوسالهها حاوی توکسین Stx2 بودهاند. 13/53 صد از گوسالهها دارای فاکتور eae و سه صد از گوسالهها هر سه فاکتور را با هم داشتند و به طور کلی 9/73 صد از نمونهها دارای Stx1 12/03 صد دارای Stx2 و 13/53 صد دارای فاکتور eae بودهاند. ورما و همکاران مطالعهای هند بر روی گوساله و برهها تعیین کردند که 9/73 صد از گوسالهها و شش صد از برهها دارای سویه EHEC بودند که از این تعداد 9/73 صد از گوسالهها و شش صد از برهها دارای هر سه فاکتور Stx2 Stx1 و eae بودند )23(. قابل ذکر است که مطالعات دیگر محققان این فراوانیها نسبت به مطالعه حاضر صد بیشتری نشان میدهد از جمله بررسیهای نوتنا و همکاران اردن که گزارش کردند سویه EHEC 25 صد از برهها و 65/5 صد از بزها حضور داشته است) 15 (. مطالعات شبانا و همکاران که بر روی گاو و گوسفندهای مبتال به اسهال انجام گرفت نشان داد 48/9 صد با سویه EHEC و 6/7 صد با سویه EPEC آلوده شدهاند) 20 (. کیم و همکاران سال 2010 کره جنوبی حضور این سویهها را خوک اعالم و تعیین کردند که 38 از نمونهها دارای ژنهای فیمبریه 42 صد دارای توکسین و 34 صد دارای هر دو فاکتور فیمبریه و توکسین بوده و از این تعداد 23 صد دارای توکسین LT چهار صد دارای توکسین STX1 25 صد دارای توکسین Stx2 21 صد دارای Intimin 66 صد از نمونهها آلوده به سویه ETEC و 53 صد نمونهها آلوده به سویه EPEC بودند) 10 (. مطالعه وانی و همکاران بر روی گوساله و برههای مبتال به اسهال نشان داد که 4/16 صد از نمونهها دارای ژن eaea 2/5 صد دارای ژن Stx1 و 3/2 صد دارای ژن Stx2 بودهاند) 24 (. مطالعات دیگری این زمینه نیز انجام شده است که صد فراوانی بیشتری را نسبت به این مطالعه و مطالعات ذکر شده باال نشان میدهد از جمله مطالعه دستمالچی و همکاران سال 2012 ارومیه بر روی گوسالههای مبتال به اسهال و سالم با استفاده از روش Multiplex PCR که شیوع ژنهای eae Stx2 Stx1 و hlya را مورد بررسی قرار دادند و نتایج PCR نشان داد که 23/1 صد از نمونهها دارای ژن Stx1 26/92 صد از نمونهها حاوی ژن 50 Stx2 صد دارای هر دو ژن Stx1 و pt 9 26/92 صد دارای ژن eaea و 57/69 صد از نمونهها دارای ژن hlya بودند) 7 (. نجین و همکاران با آزمایش بر روی گوسالهها با استفاده از روش PCR اعالم کردند که 3/31 صد از نمونهها دارای یک فیمبریه F17 F5( و F41( بودند 44/2 صد دارای Stx1 و 36/6 صد دارای 9 صد بودند )14(. همان طورکه ذکر شد بیماریهای عفونی از مهمترین عوامل تأثیرگذار صنعت دامپروری هستند که باعث خسارات اقتصادی زیادی میگردند. از جمله این بیماریها اسهال گوسالهها و برهها است که از دو طریق جدول 2 - فراوانی سویه های ETEC-EHEC-EPEC بر اساس نوع حیوانات تعداد باکتری جدا شده نواع حیوانات )%(ETEC )%(EHEC )%(EPEC )%(*Others بره 8 6)75( )25(2 گوساله )30.83( 26)21.66( )52.5(63 بز 5 3)60( )40(2 کل )27.81( 35)26.31( )45.86(61 :Others* منظور سایر باکتری ها به غیر از سه گروه ذکر شده جدول می باشد. 31

6 شناسایی مولکولی فاکتورهای حدت اشریشیاکلی... منابع مورد استفاده 1.Pourtaghi-Shotorban H., Dahpahlevan V., Shaghayegh A. and Badiee A.(2011).Molecular detection of diarrhea genicentrotoxigenic Escherichia coli (ETEC) from calves fecal samples in Alborzprovince. Journal of veterinary clinical research.vol, 2, NO,1. pp: (In persian) 2.Kiani, Y., Tahamtan, Y., Hoseini, M.H and Hayati,M.(2011). An assessment for comparing virulent factors of enterotoxigenice.coli k99 isolates by PCR and SDS- PAGE methods. Journal of Microbial World. Vol, 3, No,4. pp: Lotfollahzadeh, S.,Ziaei Daroonkolai, N., ZahraeiSalehi, T., Poorbakhsh, S.A., MokhberDezfouli, M.R and Afshari, GH.R.(2004).A study on the Presence of Escherichia coli,coccidia and cryptosporidium in stool samples of under one month age diarrheic calves in Ghaemshahr and Babol and antibiotic Sensitivity Of Isolates. J. Fac. Vet. Med. Univ.Tehran.Vol,59. NO,2. pp: Boyce,T., Swerdlow,D.Land Griffin, P.M.( 1995). Escherichia coli O157: H7 and the Hemolytic- Uremic Syndrome. The New England Journal of Medicin, Vol, 333, No,6. pp: Chen, X., Gao, S., Jiao, X and Liu, X.(2004). Prevalence of serogroups and virulence factors of Escherichia coli strains isolated from pigs with postweaning diarrhoea in eastern China. Veterinary Microbiology, Vol, 103, pp: Christopher, M.J., Bhaskaran, S., Rathore, K.S and Waghela, S.(2004). Enterotoxigenic K99+ Escherichia coli attachment to host cell receptors inhibited by recombinant pili protein. Veterinary Microbiology, Vol,101, No,2. pp: Dastmalchi,H. and Ayremlou, N.( 2012). Characterization of Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) in feces of healthy and diarrheic calves in Urmia region, Iran.I. J. M,Vol, 4, No,2. pp: Guler, L., Gunduz, K. and Ok, U.(2008). Virulence factors and antimicrobial susceptibility of Escherihia coli isolated from calvesin Turky. Zoonoses and Public Health,Vol, 55, No,5. pp: Kim, H., Samadpour, M., Grimm, L., Clausen, C.R., Besser, T.E., Baylor, M., and et al.(1994).characteristics of antibiotic-resistant Escherichia coli O157:H7in Washington State, The Journal of Infectious Diseases,Vol, 170, No,6. pp: Kim,Y.J., Kim,J.H., Hur, J andlee,j.h.( 2010). Isolation of Escherichia coli from piglets in South Korea with diarrhea and characteristics of the virulence genes.the Canadian Journal of Veterinary Research,Vol, 74,No,1. pp: Naciri, M., Lefay, M., Mancassola, R., Poirier, P and Chermette, R.(1999). Role of Cryptosporidium parvum as a pathogen in neonatal diarrhoea complex in suckling and dairy calves in France. Veterinary Parasitology, Vol, 85, No,5.pp: Nagy, B., Moon, H. WandIsaacson, R.E.(1977).Colonization of porcine intestine by enterotoxigenic Escherichia coli selection of piliated forms invivo, adhesion of piliated forms to epithelial مستقیم )به علت مرگ گوسالهها و برهها و هزینه مان( و غیرمستقیم )کاهش رشد دام پس از بیماری( صورت میپذیرد )16(. بین عوامل عفونی سویههای اشریشیاکلی پاتوژن از اهمیت بسیار ویژهای برخوردارند و مهمترین عامل ایجاد اسهال گوسالهها و برهها خصوصا روزهای اول زندگی میباشند )6(. مطالعات زیادی ارتباط با این عفونت انجام گرفته است که اهمیت موضوع را نشان میدهد اما تاکنون زمینه میزان شیوع و تعیین هویت مولکولی فاکتورهای حدت سویههای پاتوژن اشریشیاکلی پاتوژن ETEC( EHEC و )EPEC با بکارگیری تکنیک Multiplex PCR از نمونه مستقیم سواب رکتوم )بدون از دست دادن باکتری کشتهای متعدد( ایران مطالعهای صورت نگرفته است لذا این مطالعه کنار روشهای معمول با بکارگیری روش Multiplex PCR و همچنین با استفاده از پرایمرهای اختصاصی عوامل بیماریزای اشریشیاکلی )K99 Sta F41 Eaeو Aggr Stx2 Stx1 )Bfpb بررسی گردید. برای کامل کردن این پژوهش پیشنهاد میشود نمونهها از مناطق جغرافیایی گستردهتر انتخاب گردد تعداد بیشتری از نمونهها جهت مطالعه بررسی شود کارایی روش مولکولی شناسایی عوامل بیماریزایی برای تشخیص سویههای ETEC EHEC و EPEC به طور مستقیم مدفوع بررسی شود حساسیت آنتی بیوتیکی جدایههای اشریشیاکلی پاتوژن بهدست آمده از گوسالهها و برههای مبتال به اسهال مقایسه و بررسی گردد باکتریهای جدا شده به روش مولکولی مورد بررسی قرار گیرد تا مرحله بعد بتوان با استفاده از سویههایی که آنها فیمبریه به خوبی تظاهر مینماید واکسن مناسبی تهیه نمود. همچنین بیماریزایی باکتریهای جدا شده با الگوهای مولکولی متفاوت حیوان آزمایشگاهی مورد بررسی قرار گیرد. نتیجهگیری کلی با توجه به مطالعه حاضر و مطالعات ذکر شده از دیگر مناطق جغرافیایی میتوان نتیجه گرفت که میزان شیوع عفونت با سه سویه ETEC EHEC و EPEC مناطق مختلف جهان متفاوت میباشد که بخشی از این تفاوتها میتواند مرتبط با عواملی نظیر عوامل مدیریتی سن گوسالههای مورد مطالعه زمان یافت آغوز حجم و کیفیت آن و واکسیناسیون ماان باردار و همچنین استفاده از تکنیکهای متفاوت مطالعات باشد. اما با توجه به باال بودن نسبی فراوانی آلودگیهای ETEC و EHEC این منطقه مراقبتهای بهداشتی ضرورت بیشتری ایجاد مینماید. تشکر و قدانی نویسندگان مقاله از کارکنان بخش بیولوژی مولکولی موسسه تحقیقات واکسن و سرمسازی رازی شعبه شیراز کمال تشکر و امتنان را دارند. این مقاله با حمایت پروژه موسسه رازی با شماره مصوب ۲-۸۴-۱۸-۹۱۱۳ انجام شده است. 32

7 شماره 115 نشريه دامپزشكی تابستان 1396 cells in vitro, and incidence of a pilus antigen among porcineenteropathogenic E. coli. Infect Immun,Vol, 16, No,1. pp: Nataro, J.P and Kaper, J.B. (1998). Diarrheagenic Escherichia coli. Clinical Microbiology Review,Vol, 11,No,1. pp: Nguyen, T.D., Thanh Vo2, T and Khac, H.V.( 2011). Virulence factors in Escherichia coli isolated from calves with diarrhea in Vietnam. J. Vet. Sci, Vol, 12,No,2. pp: Novotna, R., Alexa, P., Hamrik, J., Madanat, A., Smola, J. and Cizek,A.(2005). Isolation and characterization Shiga toxin-producing Escherichia coli from sheep and goats in Jordan with evidence of multiresistant serotype O157:H7. Vet. Med. Czech, Vol, 50,No, 3. pp: Ok, M., Guler,L., Turgut, K., Ok, U., Sen, I., Gunduz, K., Birdane, M. F and Guzelbektes, H.(2008). The studies on the Aetiology of Diarrhoea in neonatal calves and determination of virulence gene markers of Escherichia coli Strains by multiplex PCR. Zoonoses and Public Health,Vol, 56,No,2.pp: Phan, Q and Mshar, P.( 2003). Escherichia colio157:h7 Gastroenteritis- Conecticut. Conecticut Dipartment of Public Health, Vol, 23,No, 2. pp: Riley, L.W., Remis, R.S., Helgerson, S.D., McGee, H.B., Wells, J.G and et al.(1983). Hemorrhagic colitis associated with a rare Escherichia coli serotype. N Engl J Med,Vol, 308,No,12. pp: Schoonderwoerd, M., Clarke, R.C., Dreume, A.A and Rawluk, S.A.(1988). Colitis in calvesnatural and experimental infection with a verotoxin-producing strain of Escherichia coli O111.NM. Can. J.Vet. Res, Vol, 52, No,4. pp: Shabana, I.I. (2014). Escherichia coli Pathotypes Associated With Diarrhea in Human and Domestic Animals. American Journal of Animal and Veterinary Sciences, Vol, 9, No, 3. pp: Shams, Z., Tahamtan, Y., Pourbakhsh, A., Hosseiny, M.H., Kargar, M. and Hayati,M.(2012). Detection of enterotoxigenic K99 (F5) and F41 from fecal sample of calves by molecular and serological methods. Comp Clin Pathol,Vol, 21, pp: Sunderland, S., Sarasola, P., Giles, C.G and Smith, D.G.(2003). Efficacy of danofloxacin 18% injectable solution in the treatment of Escherichia coli diarrhoea in young calves in Europe. Research in Veterinary Science,Vol, 74, No,2. pp: Verma, Sh., Kumar, M., Kashyap, S.,Singh,M and Venkatesh,V.(2013). Current Scenario Of Escherichia coli And Its Serotype o157 In Indian Subcontinent. IJIRSET,Vol, 2, Issue 7,ISSN: Wani, S.A., Bhat, M.A., Samanta, I., Nishikawa,YandBuchh, A.S.( 2003). Isolation and characterization of Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) and enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) from calves and lambs with diarrhoea in India. Letters in Applied Microbiology,Vol, 37,NO, 2. pp: Wani, S.A., Hussain, I., Beg, S.A., Rather, M.A., Kabli, Z.A. Mir, M.A and Nishikawa,Y. (2013). Diarrhoeagenic Escherichia coli and salmonellae in calves and lambs in Kashmir.absence, prevalence and antibiogram. Rev. sci. tech. Off. int. Epiz.,Vol,32, No,3. 33

8 شناسایی مولکولی فاکتورهای حدت اشریشیاکلی... 34