ŠTUDIJA VPLIVA SUPERKRITIČNEGA OGLJIKOVEGA DIOKSIDA NA PREŽIVETJE KVASOVK IZ SACCHAROMYCES CEREVISIAE

Transcription

1 UNIVERZA V MARIBORU FAKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJO Maja Ajtnik ŠTUDIJA VPLIVA SUPERKRITIČNEGA OGLJIKOVEGA DIOKSIDA NA PREŽIVETJE KVASOVK IZ SACCHAROMYCES CEREVISIAE Diplomska naloga Maribor, maj 2009

2 Študija vpliva superkritičnega ogljikovega dioksida na preživetje kvasovk iz Saccharomyces cerevisiae I UNIVERZA V MARIBORU FAKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJO SI 2000 MARIBOR, Smetanova 17 Diplomsko delo univerzitetnega študijskega programa ŠTUDIJA VPLIVA SUPERKRITIČNEGA ODLJIKOVEGA DIOKSIDA NA PREŽIVETJE KVASOVK IZ SACCHAROMYCES CEREVISIAE Študentka: Študijski program: Smer: Predvideni strokovni naslov: Maja AJTNIK univerzitetni, Kemijska tehnologija Kemijska tehnologija univ. dipl. inž. kem. tehn. Mentor: Komentor: izr. prof. dr. Maja HABULIN doc. dr. Mateja PRIMOŽIČ IZJAVA Izjavljam, da sem diplomsko delo izdelala sama, prispevki drugih so posebej označeni. Pregledala sem literaturo iz področja diplomskega dela po naslednjih elementih: Vir: ScienceDirect, Web of Science Gesla: S. cerevisiae, high pressure, extractions, supercritical carbon dioxide Skupine gesel (unija itd.): S. cerevisiae Časovno obdobje: Od leta 1976 do leta 2009 Število referenc: 24 Število prebranih izvlečkov: 9 Število prebranih člankov: 5 Število pregledanih knjig: 4 Podpis študentke Maribor, maj 2009

3 Študija vpliva superkritičnega ogljikovega dioksida na preživetje kvasovk iz Saccharomyces cerevisiae II

4 Študija vpliva superkritičnega ogljikovega dioksida na preživetje kvasovk iz Saccharomyces cerevisiae III ZAHVALA Zahvaljujem se mentorici, izr. prof. dr Maji Habulin, za pomoč in odlično vodenje ter svetovanje skozi diplomsko delo. Za komentorstvo se zahvaljujem dr. Mateji Primožič. Zahvala gre tudi vsem zaposlenim v Laboratoriju za separacijske procese in produktno tehniko. Posebna zahvala velja staršem in Borutu, ki so mi ves čas študija stali ob strani in me vzpodbujali.

5 Študija vpliva superkritičnega ogljikovega dioksida na preživetje kvasovk iz Saccharomyces cerevisiae IV Študija vpliva superkritičnega ogljikovega dioksida na preživetje kvasovk iz Saccharomyces cerevisiae Povzetek Saccharomyces cerevisiae sodi v razred kvasovk, ki spadajo v kategorijo gliv. V nasprotju z Escherichia coli in ostalimi bakterijami ima S. cerevisiae celično jedro in citoplazmatske organele. S. cerevisiae je prvi eukariot, ki so mu določili genom in predstavlja odličen modelni sistem za proučevanje višjih eukariotov. Zadnjih dvajset let se zgoščeni ogljikov dioksid (CO 2 ) pogosto uporablja kot alternativa za netermično pasterizacijo hrane v prehrambeni industriji. Tako je hrana določen čas v kontaktu s sub- ali superkritičnim CO 2 (SC CO 2 ) kar lahko posledično povzroči inhibicijo rasti mikroorganizmov. SC CO 2 pa lahko služi tudi kot topilo za ekstrakcijo intracelularnih komponent iz mikrobnih celic ali za izolacijo produktov iz reakcijske zmesi pri proizvodnji biomase. Karakteristike ekstrakcije s SC CO 2 sovpadajo s pogoji biotehnološke proizvodnje: blaga temperatura, netoksičnost, dobra selektivnost in čisti produkti (brez prisotnosti topila). Ključne besede: S. cerevisiae, visok tlak, ekstrakcije, superkritični ogljikov dioksid UDK: : (043.2)

6 Študija vpliva superkritičnega ogljikovega dioksida na preživetje kvasovk iz Saccharomyces cerevisiae V Study of influence of supercritical carbon dioxide on survival of yeasts from Saccharomyces cerevisiae Abstract Saccharomyces cerevisiae belongs to a class of yeasts, belonging to the fungi. In contrast to Escherichia coli and other bacteria, the S. cerevisiae contains cell nucleus and cytoplasmatic organelles. S. cerevisiae is the first eukaryot, which genome was defined and represents an excellent model system for the study of higher eukaryots. Over the past twenty years, the use of high-pressure carbon dioxide (CO 2 ) is also proposed as an alternative non-thermal pasteurization technique for foods in the food industry. Thus, the food is a limited period of time in contact with the sub- or supercritical CO 2 (SC CO 2 ), and may consequently lead to inhibition of growth of microorganisms. SC CO 2, however, can also serve as a solvent for the extraction of intracellular components from microbial cells or for isolation of products from the reaction mixture in the production of biomass. The characteristics of SC CO 2 extraction fit well with biotechnological production conditions: mild temperatures, lack of toxicity, good selectivity and ultra-pure products (no solvent residues). Keywords: S. cerevisiae, high pressure, extractions, supercritical carbon dioxide UDK: : (043.2)

7 Študija vpliva superkritičnega ogljikovega dioksida na preživetje kvasovk iz Saccharomyces cerevisiae VI VSEBINA 1 UVOD TEORETIČNI DEL Glive Saccharomyces cerevisiae Superkritični fluidi METODE IN MATERIALI Materiali Kemikalije Laboratorijska oprema Metode Priprava tekočega medija za rast kvasovk in inokulacija S. cerevisiae iz poševnega gojišča v pripravljen medij Hranilne podlage ali gojišča Priprava sterilne fiziološke raztopine Ohranitev mikrobnih kultur Ugotavljanje velikosti mikrobnih populacij Cepljenje kulture na trdna gojišča Merjenje optične gostote z UV-Vis spektrofotometru Inkubacija suspenzije s kuturo S. cerevisiae v zgoščenem CO Določanje koncentracije proteinov REZULTATI IN DISKUSIJA Hitrost dekompresije pri izvedenih eksperimentih Vpliv časa inkubiranja na preživetje kvasovk iz S. cerevisiae v SC CO 2 pri tlaku 100 bar Vpliv tlaka na preživetje kvasovk iz S. cerevisiae po 30 minutni inkubaciji v SC CO Koncentracija proteinov v suspenziji S. cerevisiae po inkubiranju v SC CO Vpliv SC CO 2 na vrednost ph suspenzije S. cerevisiae Vpliv SC CO 2 na preživetje celic S. cerevisiae na trdnih gojiščih...36

8 Študija vpliva superkritičnega ogljikovega dioksida na preživetje kvasovk iz Saccharomyces cerevisiae VII 5 SKLEP LITERATURA IN VIRI PRILOGE Priloga A Izmerjene optične gostote suspenzij S. cerevisiae pri 550 nm za hitro ( p/ t = 30,5 bar/min) in počasno ( p/ t = 3,8 bar/min) ekspanzijo pri različnih tlakih in časih inkubacije v SC CO Priloga B Število preštetih kolonij S. cerevisiae v 1 ml suspenzije S. cerevisiae inkubirane v SC CO 2, ter izračunani odstotki preživetja celic S. cerevisiae iz števila živih in mrtvih celic Priloga C Meritve OD in izračuni koncentracij proteinov v suspenziji S. cerevisiae za hitro ( p/ t = 30,5 bar/min) in počasno ( p/ t = 3,8 bar/min) ekspanzijo pri različnih tlakih in časih inkubacije v SC CO 2 so prikazani v tabelah C. 1 in C Priloga D Umeritvena krivulja za makro Bradfordovo metodo Priloga E Življenjepis...49

9 Študija vpliva superkritičnega ogljikovega dioksida na preživetje kvasovk iz Saccharomyces cerevisiae VIII SEZNAM SLIK Slika 2.1: Razmnoževanje gliv (6)... 5 Slika 2.2: Mucor mucedo (7)... 6 Slika 2.3: Aspergillus (7)... 7 Slika 2.4: Zgradba bazidija pri nižjih in višjih prostotrostnicah... 8 Slika 2.5: S. cerevisiae - prerez (9)... 9 Slika 2.6: Kemijski prikaz fermentacije (11)...10 Slika 2.7: Življenjski cikel kvasovke (12)...11 Slika 2.8: Interferenčni mikroskop...12 Slika 2.9: Fazni diagram CO 2 (9)...13 Slika 2.10: p - T diagram za CO 2 s premicami konstantne gostote...14 Slika 2.11: Gostota in dielektrična konstanta CO 2 kot funkcija tlaka...15 Slika 3.1: Erlenmajerica z univerzalnim tekočim medijem za gojenje kvasovk...19 Slika 3.2: Laboratorijski avtoklav...20 Slika 3.3: Mikroskop Eclipse (18)...22 Slika 3.4: Števna komora: Neubauer Improved (19)...23 Slika 3.5: Shema visokotlačnega šaržnega reaktorja...24 Slika 3.6: Visokotlačni šaržni reaktor...24 Slika 4.1: Vpliv hitrosti ekspanzije in časa inkubacije v SC CO 2 na preživetje kvasovk iz S. cerevisiae pri p = 100 bar in T = 35 C...29 Slika 4.2: Mrtve celice...30 Slika 4.3: Žive celice...30 Slika 4.4: Odvisnost preživetja celic S. cerevisiae od tlaka po 30 minutni inkubaciji v SC CO 2 pri 35 C. Prikazan je tudi vpliv hitrosti ekspanzije na preživetje kvasovk iz S. cerevisiae Slika 4.5: Koncentracijska razlika proteinov v suspenziji S. cerevisiae pred in po 30 min inkubiranju v SC CO 2 v odvisnosti od tlaka in hitrosti ekspanzije...34 Slika 4.6: Relativna vrednost proteinov v suspenziji S. cerevisiae v odvisnosti od tlaka in načina ekspanzije po 30 minutni inkubaciji pri 35 C v SC CO

10 Študija vpliva superkritičnega ogljikovega dioksida na preživetje kvasovk iz Saccharomyces cerevisiae IX Slika 4.7: Primerjava intenzivnosti rasti celic S. cerevisiae po izpostavitvi v SC CO 2 pri tlaku 100 bar (levo) in 200 bar (desno) Slika 4.8: Poškodovano trdno gojišče po inkubiranju v SC CO 2 pri tlaku 300 bar (levo) in 200 bar (na sredini) ter nepoškodovano trdno gojišče pri tlaku 100 bar (desno) pri hitri ekspanziji ( p/ t = 30,5 bar/min)...38 Slika D. 1: Umeritvena krivulja za makro Bradfordovo metodo...48

11 Študija vpliva superkritičnega ogljikovega dioksida na preživetje kvasovk iz Saccharomyces cerevisiae X SEZNAM PREGLEDNIC Tabela 2.1: Red velikosti fizikalnih veličin za pline, superkritične fluide in tekočine Tabela 2.2: Podatki o kritičnih temperaturah (T c ) in tlakih (p c ) za nekatere snovi...15 Tabela 2.3: Fizikalno-kemijske lastnosti CO 2 (15) Tabela 4.1: Povprečna sprememba tlaka po času pri dekompresiji suspenzije S. cerevisiae izpostavljene za 30 min pri 35 C in 100 bar v SC CO Tabela 4.2: Odstotek preživelosti kvasovk iz S. Cerevisiae v SC CO 2 pri 100 bar in 35 C ter različnih inkubacijskih časih pri hitri in počasni ekspanziji Tabela 4.3: Preživelost celic S. cerevisiae pri različnih tlakih in 35 C ter inkubacijskemu času 30 min v SC CO Tabela 4.4: Koncentracijska razlika in relativna vrednost proteinov v suspenziji S. cerevisiae po inkubaciji v SC CO 2 pri 35 C in pri različnih tlakih...33 Tabela 4.5: Vrednosti ph suspenzije S. cerevisiae pri različnih tlakih in različnih časih inkubacije v SC CO Tabela 4.6: Preživetje celic S. cerevisiae na trdnih gojiščih po 30 minutni inkubaciji v SC CO 2 pri 35 C in različnih tlakih ter načinu ekspanzije Tabela A. 1: Vrednosti izmerjenih optičnih gostot susepenzij S. cerevisiae pri 550 nm za vse meritve pri hitri ekspanziji ( p/ t = 30,5 bar/min) Tabela A. 2: Vrednosti izmerjenih optičnih gostot susepenzij S. cerevisiae pri 550 nm za vse meritve pri počasni ekspanziji ( p/ t = 3,8 bar/min)...44 Tabela B. 1: Število zraslih kolonij S. cerevisiae v 1 ml suspenzije S. cerevisiae inkubirane v SC CO2 ter izračun odstotkov preživelosti celic za vse meritve pri hitri ekspanziji ( p/ t = 30,5 bar/min)...45 Tabela B. 2: Število zraslih kolonij S. cerevisiae v 1 ml suspenzije S. cerevisiae inkubirane v SC CO2 ter izračun odstotkov preživelosti celic S. cerevisiae pri vseh meritvah pri počasni ekspanziji ( p/ t = 3,8 bar/min)....45

12 Študija vpliva superkritičnega ogljikovega dioksida na preživetje kvasovk iz Saccharomyces cerevisiae XI Tabela C. 1: Izmerjeni OD in izračuni koncentracij proteinov v suspenziji S. cerevisiae pri hitri ekspanziji ( p/ t = 30,5 bar/min) in različnih tlakih ter časih inkubacije v SC CO Tabela C. 2: Izmerjene OD in izračuni koncentracij proteinov v suspenziji S. cerevisiae pri počasni ekspanziji ( p/ t = 3,8 bar/min) in različnih tlakih ter časih inkubacije v SC CO 2.47

13 Študija vpliva superkritičnega ogljikovega dioksida na preživetje kvasovk iz Saccharomyces cerevisiae XII UPORABLJENE KRATICE BSA C 2 H 5 OH C 6 H 12 O 6 CFU CO 2 - CO 3 H + - HCO 3 H 2 O H 2 CO 3 N 2 O NaCl O 2 goveji (bovini) serumski albumin etanol glukoza colony forming units, štetje enot, ki tvorijo kolonije ogljikov dioksid karbonat (IV) vodikov ion hidrogenkarbonat (IV) voda ogljikova (IV) kislina didušikov oksid natrijev klorid kisik S. cerevisiae Saccharomyces cerevisiae SC CO 2 SCF Na-PBS superkritični ogljikov dioksid superkritični fluid natrijev fosfatni pufer

14 Študija vpliva superkritičnega ogljikovega dioksida na preživetje kvasovk iz Saccharomyces cerevisiae XIII UPORABLJENI SIMBOLI c z koncentracija raztopine proteinov na začetku mg/ml c k koncentracija raztopine proteinov na koncu mg/ml k naklon umeritvene krivulje BSA ml/mg OD 595,z začetna absorbanca, izmerjena pri valovni dolžini 595 nm 1 OD 595,k končna absorbanca, izmerjena pri valovni dolžini 595 nm 1 OD 550,z začetna absorbanca vzorca pri valovni dolžini 550 nm 1 OD 550,k končna absorbanca vzorca pri valovni dolžini 550 nm 1 p tlak bar p c kritični tlak Pa ph vrednost ph 1 ph z vrednost ph na začetku 1 ph k vrednost ph na koncu 1 T temperatura K T c kritična temperatura K, C t čas min V volumen ml GRŠKE ČRKE: c sprememba koncentracije proteinov v raztopini mg/ml c/c z relativna vrednost koncentracije proteinov v raztopini 1 p/ t sprememba tlaka po spremembi časa bar/min

15 Študija vpliva superkritičnega ogljikovega dioksida na preživetje kvasovk iz Saccharomyces cerevisiae XIV razlika absorbance 1 OD ρ gostota kg/m 3

16 Študija vpliva superkritičnega ogljikovega dioksida na preživetje kvasovk iz Saccharomyces cerevisiae 1 1 UVOD V zadnjih letih zahteve potrošnikov po bolj sveži, bolj kakovostni in varni hrani podpirajo raziskave milih tehnologij konzerviranja hrane kot alternativo termičnim procesom. Ob upoštevanju navedenega, je bil poudarek, zraven ostalih, na visoko tlačnem ogljikovem dioksidu. Karakteristike superkritične ekstrakcije CO 2 se dobro ujemajo s pogoji biotehnološke produkcije: nizke temperature, ne toksičnost, dobra selektivnost in ultra čisti produkti (1). Saccharomyces cerevisiae je kot najbolj raziskan eukariontski organizem ter zaradi svoje preprostosti in enostavnega načina gojenja zelo primeren za različne študije (2). Anti-mikrobni efekt CO 2 pod visokim tlakom je bil obširno demonstriran na različnih mikroorganizmih pri različnih operativnih pogojih tlaka in temperature od leta 1990 naprej. Poročilo o deaktivaciji bakterij in kvasovk s superkritičnim ogljikovim dioksidom (SC CO 2 ) je bilo objavljeno pred kratkim. Kljub temu je bilo razvitih malo industrijskih aplikacij za izkoriščanje te tehnologije, ker je mehanizem, ki vključuje mikrobiološko deaktivacijo ob prisotnosti CO 2, kateri lahko pospeši optimizacijo procesa in njegove industrijske aplikacije, slabo razumljiv. Do zdaj je bilo formuliranih in predloženih kar nekaj hipotez o mehanizmu deaktivacije toda šele zdaj se potrjujejo z ustreznimi eksperimentalnimi dokazi (1). Kar nekaj avtorjev se strinja s teorijo, da je transport mase gostega plina v tekočo fazo prvi obvezen korak za doseganje pasterizacijskega učinka. Po tem, voda v kontaktu s zgoščenim CO 2 postane kisla in zniževanje ph slabi mikrobiološko odpornost kar vodi do deaktivacije, z inhibicijo mikroorganizmov (1). Ko se CO 2 raztopi v tekoči fazi, je potrebnih šest korakov, da dosežemo smrtnost celice: modifikacija membrane, zniževanje intraceličnega ph, deaktivacija ključnega encima, direkten ovirajoč efekt molekularnega CO 2 in (HCO 3 ) - na metabolizem, motenje intracelularnega ravnotežja elektrolitov in odstranitev vitalnih komponent iz celic in celičnih membran.

17 2 Študija vpliva superkritičnega ogljikovega dioksida na preživetje kvasovk iz Saccharomyces cerevisiae V literaturi obstajata dve različni mnenji, ki se nanašata na biokompatibilnost zgoščenega CO 2. Nekateri avtorji navajajo dobro preživetje mikroorganizmov (3), drugi o rapidni izgubi sposobnosti za življenje mikroorganizmov v zgoščenem CO 2 (3). Za razjasnitev situacije je bila izvedena natančna študija obnašanja sposobnosti življenja kvasovk v stisnjenem CO 2 (3). S pomočjo inkubiranja suspenzije s kulturo S. cerevisiae v SC CO 2 smo hoteli doseči, da bi celice omenjene kulture odmrle zaradi poškodovane celične stene. Za ta namen smo optimirali temperaturo in tlak SC CO 2. Z različnimi metodami smo preučevali vplive SC CO 2 na suspenzijo S. cerevisae in na celice S. cerevisiae nacepljene na trdna gojišča. S pomočjo Bradfordove metode smo določili koncentracijo proteinov v suspenziji S. cerevisiae pred in po inkubaciji v SC CO 2.

18 Študija vpliva superkritičnega ogljikovega dioksida na preživetje kvasovk iz Saccharomyces cerevisiae 3 2 TEORETIČNI DEL 2.1 Glive Glive so eno izmed kraljestev živih bitij. So heterotrofi, ki živijo saprofitsko, parazitsko in simbiotsko. Pojem gliva je zelo obsežen. Obsega tako s prostim očesom nevidne organizme, kot so kvasovke in podobne glive, plesni, rje in sneti. Živijo v sladkih vodah, na kopnem, redkeje v morju (4). Njihove celice so brez plastidov in klorofila. Celično steno gradi pri večini skupin hitin, vendar se pri nekaterih še vedno pojavlja celuloza in drugi glukani. Heterotrofi niso samo glede energetske preskrbe in presnove ogljika, ampak tudi glede prehrane z dušikovimi spojinami in drugimi hranili. Rezervne snovi so glikogen, maščobe in še nekatere druge spojine, nikoli škrob. V rastlinski sistem jih uvrščamo zaradi tradicije, nedvomno pa gre za zelo samostojno skupino, ki jo kot glive prav lahko uvrščamo enakovredno rastlinam in živalim. Glive so eukarioti. Njihovo telo je po stopnji organizacije steljka, ki je v obliki golega parazitirajočega protoplasta, riziodnega micelija, brstilnega micelija, psevdomicelija in hifnega micelija, ta je sifonalni ali trihalni. Steljka gliv je zgrajena iz spleta hif- micelija in pleteža hif, ki služijo razmnoževanju, kar še posebej velja za višje organizacijske stopnje. Razmnoževanje je izredno raznoliko, in to na vegetativni, nespolni in spolni stopnji. Nespolno se razmnožujejo z različnimi vrstami trosov, katerih poimenovanje je odvisno od nastanka, jedrne faze in taksonomske pripadnosti vrst. Zelo pogosta oblika nespolnega razmnoževanja so konidiji, konidiospore, ki nastajajo kot mitospore vedno eksogeno, le izjemoma prevzemajo vlogo spolnega razmnoževanja, ko delujejo kot prenašalci moško potentnih jeder (gamet). Pri vrstah in oblikah, ki živijo v vodi se pojavljajo gole, običkane zoospore, ki jih pri kopenskih oblikah nadomestijo neobičkane aplanospore, ki so vedno obdane s celično steno. Pri pripravi na spolno razmnoževanje se v razvojnem ciklu pojavi menjava jedrnih faz - sprememba v plodnosti, največkrat iz diploidnega v haploidno stanje v procesu mejoze, ko se tvorijo mejospore. Nekatere vrste se razmnožujejo nespolno tudi z razpadom micelija na posamezne celice - oidije. Trajne oblike vegetativne faze, v kateri nekatere vrste prežive neugodno obdobje predstavljajo prepleti hif, imenovani sklerociji.

19 4 Študija vpliva superkritičnega ogljikovega dioksida na preživetje kvasovk iz Saccharomyces cerevisiae Nadalje je vegetativno razmnoževanje možno z več metrov dolgimi vrvičastimi spleti hif, imenovanimi rizomorfi. Pri spolnem razmnoževanju sta poleg izo-, anizo- in oogamije tudi gametangijo- in somatogamijo. Gametangiji niso nikdar obdani s steno, zgrajeno iz sterilnih celic kot to poznamo pri višjih rastlinah, ampak se v gametangiji spremeni ena celica. Zato podobno kot pri algah za žensko potentne gametangije ne uporabljamo izraza arhegoniji ampak oogon oz. askogon pri zaprtotrosnicah. Analogno moško potentne gametangije ne imenujemo anteridije, ampak spermatogonije. Isto velja za mesta nastanka spor, kjer po analogiji z višjimi rastlinami ni sten, zgrajenih iz sterilnih celic okrog sporogenega tkiva, zato izraz trosovnik ni primeren in se kot ustrezen izraz predlaga sporocista. Pri številnih skupinah obstaja le nespolno razmnoževanje, spolno je nepoznano oz. je spolni rod izumrl. Za te vrste je značilno, da se razmnožujejo samo nespolno, brez menjave jedrnih faz z mito oz. kondiosporami. Obstaja samo stranska plodna (razmnoževalna) oblika, imenovana anamorf (velika skupina nepopolnih gliv), rod (del razvojnega kroga), pri katerem razmnoževalne celice nastajajo brez menjave jedrne faze. Kot glavno plodno obliko, imenovano teleomorf pa tisti rod, v kateri prihajajo do kariogamije in nato do mejoze ter s tem do menjave jedrne faze. Pri številnih predstavnikih obstaja menjava generacij - metageneza. Nespolno in spolno generacijo so zaradi slabega poznavanja življenjskega kroga pogosto opisali kot ločene vrste, pri številnih predstavnikih pa spolna generacija ni znana. Danes pri glivah z menjavo spolne in nespolne generacije imenujemo nespolno anamorf, spolno telomorf in obe skupaj holomorf. V metagenezi je poudarjenost spolne in nespolne generacije zelo različna. Spolna in nespolna generacija nista vedno ločeni in sta lahko le sestavni del sicer enotne steljke kot je to primer pri večini liheniziranih gliv - lišajev, katerih steljke predstavljajo holomorf. Pri številnih vrstah pa se anamorf in telomorf razvijata popolnoma ločeno, pri številnih parazitih tudi na drugem gostitelju, kar je v preteklosti privedlo do ločenega poimenovanja nespolne in spolne generacije kot dveh samostojnih vrst. Razumevanje poteka menjave jedrnih faz in metageneze še dodatno zamegli pojav dvojedrnega stanja, zaradi časovnega presledka med plazmo in kariogamijo. Spolna diferenciacija steljk na moško in žensko potentne je morfološko neizražena. Zato označimo kot moško potentne tiste steljke, ki pri spolnem razmnoževanju jedra dajejo kot žensko potentne pa tiste, ki jih sprejemajo. V tem smislu lahko spolno diferenciacijo označimo kot dvodomno, kadar steljka (micelij) lahko le oddaja ali le sprejema jedra oz. enodomno, kadar micelij (steljka) jedra lahko oddaja ali sprejema. Pri regulaciji spolnega razmnoževanja se pojavlja še dodatna delitev partnerja na homotalične in heterotalične

20 Študija vpliva superkritičnega ogljikovega dioksida na preživetje kvasovk iz Saccharomyces cerevisiae 5 vrste. Homotalične so tiste enodomne glive, pri katerih lahko pride do križanja dveh micelijev, nastalih iz iste oz. genetsko identične zasnove. Heterotalične so tiste enodomne glive, kjer prej omenjeno križanje ni možno zaradi genetske inkompatibilnosti; jedra z enako genetsko zasnovo se odbijajo (+ : +, - : - para), steljke, hife, gametangiji se ne zlijejo; potrebna sta micelija oz. hife, ki so nastale iz genetsko različnih mejospor (pari + : -, - : +). Genska regulacija heterotaličnosti temelji na enem ali več parih alelov (5). Slika 2.1 prikazuje razmnoževanje gliv. Slika 2.1: Razmnoževanje gliv (6) Slika 2.1 govori o tem, da so askospore lahko + (ženski spol) ali (moški spol) orientirane. Askospore na primerni podlagi (npr. gozdna tla ali trohneč les) vzkalijo v haploidne hife. Hife se razrastejo v podgobje, v ugodnih razmerah pa se razvije trosnjak oz. plodišče - goba. Nespolno se številne glive zaprtotrosnice razmnožujejo s konidiji. V zametkih plodišča + hife tvorijo mnogojedrne ženske gametangije (askogone), - hife pa moške gametangije (anteridije oz. spermogone). Z združevanjem le-teh se vzpostavi dvojedrno stanje, iz katerih se razvijejo dvojedrne hife. Včasih se gametangiji ne tvorijo, ampak kopulirajo + in - hife (kot v primeru na sliki). Zlivanje + in - hif je oblika spolnega razmnoževanja, imenovanega somatogamija. Tukaj začno izraščati haploidne dvojedrne hife. Na terminalnih delih dvojedrnih hif začno nastajati aski, kjer z zlitem haploidnih jeder

21 6 Študija vpliva superkritičnega ogljikovega dioksida na preživetje kvasovk iz Saccharomyces cerevisiae nastane diploidna zigota. Iz diploidne zigote z mejozo (redukcijsko delitvijo) nastane 8 haploidnih jeder (4 + in 4 -) iz njih pa se razvije 8 askospor. Ko askospore dozorijo, se ask odpre, spore pa izpadejo. Če spore padejo na ugodna tla, iz njih vzkalijo nove haploidne, + ali hife (6). Glive so razvrščene v 5 debel: Chytridiomycetes Hitridijomicete so enocelične in plazmodialne, večjedrne steljčnice. V spolnem razmnoževanju se pojavljajo izogamija, anizogamija in gametangijogamija. Nespolno razmnoževanje poteka z zoosporami. Večina vrst je vodnih, kjer se hranijo z enoceličnimi algami in odmrlimi deli rastlin, alg in živali. Nekaj je tudi celičnih parazitov kopenskih rastlin. Skupina obsega okrog 500 vrst, katerih sistematika temelji na načinu spolnega razmnoževanja, zgradbi steljke in zoospor. Zygomycetes - jarmaste glive Zigomicete imajo ponavadi dobro razvit nitast micelj, v katerem so hife brez prečnih celičnih sten, torej nitasta sifonalna stopnja steljke. Pri spolnem razmnoževanju nikdar ne nastanejo gamete, ampak kopulirajo običajno večjedrni gametangiji. Nastane zigota, imenovana zigospora, ki nekaj časa miruje, gliva tako preživi neugodno obdobje. Vegetativno razmnoževanje je prilagojeno življenju na kopnem. Ni več običkanih trosov. Po navadi se odlomijo celi sporangiji (trosovniki). Poleg s sporangiosporami se vegetativno razmnožujejo še s konidiji. Večina zigomicet so saprofitske glive, gniloživke, ki razkrajajo številne organske snovi in so zato pomembni razkrojevalci v kopenskem ekosistemu. Eden izmed redov je Mucorales in v ta red spada vrsta Mucor mucedo (slika 2.2), ki je ena izmed najbolj pogostih plesni, ki kvari kruh, marmelado in druga živila. Slika 2.2: Mucor mucedo (7)

22 Študija vpliva superkritičnega ogljikovega dioksida na preživetje kvasovk iz Saccharomyces cerevisiae 7 Ascomycetes - glive zaprtotrosnice Večina gliv zaprtotrosnic živi kopensko kot saprofiti, paraziti ali v sožitju z višjimi rastlinami. Le redke vrste so prilagojene življenju v morju in sladki vodi. Steljka teh gliv je bogato razrasel micelij, zgrajen iz septiranih hif. Le kvasovke, ki so sekundarno spet prišle v vodno okolje, imajo enocelični brstilni micelij. V celični steni se vedno pojavlja hitin, razen pri kvasovkah pri katerih lahko popolnoma manjka. Večina zaprtotrosnic ima spolni stadij (teleomorf) in nespolni stadij (anamorf). Spolni organi imajo obliko mehov (askov). V asku pride do zlitja jeder, kariogamije in mejotske delitve, med katero endogeno nastajajo askospore. Nespolne spore konidije oblikujejo na prostih hifah ali v nespolnih trosiščih. K zaprtotrosnicam spada red Eurotiales. Zelo dobro je razvito vegetativno razmnoževanje anamorfita, ki poteka preko značilnih konidijev. Ti nastajajo na betičastih nastavkih betičaste plesni (rod Aspergillus) (slika 2.3). Slika 2.3: Aspergillus (7) Basidiomycetes - prostotrosnice Za glive prostotrosnice je značilno, da nastajajo mejospore, imenovane bazidiospore prosto, na celici, v kateri pride do kariogamije, in jo imenujemo bazidij. V bazidiju pride do zlitja jeder in redukcijske delitve. Sistematika gliv prostotrosnic temelji najprej na zgradbi bazidija (slika 2.4), ki je septiran na štiri zaporedne celice pri nižjih prostotrosnicah, rjah in sneteh in cel pri višjih prostotrosnicah. Septirani bazi imenujemo fragmobazidij, celi bazidij pa holobazidij. Obe skupini se razlikujeta še po kalitvi bazidiospor, po načinu življenja in z njim povezani zgradbi micelija.

23 8 Študija vpliva superkritičnega ogljikovega dioksida na preživetje kvasovk iz Saccharomyces cerevisiae Slika 2.4: Zgradba bazidija pri nižjih in višjih prostotrostnicah Deuteromycetes - nepopolne glive Nepopolne glive so zelo številna skupina gliv, pri katerih so znane le nespolne oblike razmnoževanja, predvsem konidiji, ali pa se je izgubila celo ta. Po zgradbi hif in sept prevladujejo zaprtotrosnice, le izjemoma tudi prostotrosnice. Če odkrijemo spolno generacijo, velja njeno ime, vendar se lahko uporablja tudi ime nespolne generacije (5). Živalski organizmi in glive nimajo klorofila, zato so v svoji prehrani vezane na organske snovi, ki jih ustvarjajo zelene rastline. Glive za prehrano uporabljajo rastlinske in živalske snovi, bodisi odmrle, trohneče, gnijoče ali žive. Zato najdemo mnogo gliv tam, kjer se je nakopičilo mnogo organskih snovi, v gozdovih, na kompostu. Glive se lahko pojavljajo kot soživke na območjih, ki jih pokriva rastlinski plašč, kot gniloživke, kjer so organski ostanki snovi rastlinskega in živalskega izvora, ali pa tudi kot zajedalke, ki se lotevajo živih rastlin, živali in celo nekaterih gliv (4). 2.2 Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae sodi v razred kvasovk. Kvasovke so netaksonomska kategorija gliv, definirana z ozirom na morfološke in fiziološke značilnosti. So filogenetsko različna skupina mikroorganizmov in pripadajo dvem glavnim taksonom, in sicer deblu Ascomycota in Basidiomycota. S. cerevisiae spada v carstvo Eukarya, kraljestvo Fungi, deblo Ascomycota, razred Saccharomycetes, red Saccharomycetales, družina Saccharomycetaceae. S. cerevisiae se razmnožuje spolno in nespolno (8). S. cerevisiae ima okrogle oz. sferične celice, velikosti od 5 do 12 µm (9), ki so približno desetkrat večje kot pri E. coli. V nasprotju z E. coli in ostalimi bakterijami ima S. cerevisiae

24 Študija vpliva superkritičnega ogljikovega dioksida na preživetje kvasovk iz Saccharomyces cerevisiae 9 celično jedro in citoplazmatske organele, kot so mitohondrij, ribosomi in endoplazmatski retikulum. Slika 2.5: S. cerevisiae - prerez (9) Izbrani sevi se uporabljajo pri alkoholni fermentaciji vina in piva ter pri proizvodnji fermentiranih živil (pekovski kvas) (9). Louis Pasteur ( ), francoski kemik in bakteriolog, je prvi, ki je pojasnil, da fermentacijo povzročajo kvasovke (10). Prav tako je S. cerevisiae zmožna rasti pri ph 1,6. V prisotnosti kisika lahko oksidirajo sladkorje z respiracijskim sistemom v mitohondrijih. Zmožne so pretvoriti sladkor v etanol in CO 2. Ker kisik ni vpleten v proces pretvorbe, ta praktično poteka pri anaerobnih pogojih. Obenem se etanol lahko pojavlja kot stranski proizvod metabolizma tudi v primerih aerobnega procesa ob zadostni količini sladkorjev v mediju. V okolje se izločajo številni encimi in metaboliti, ki spreminjajo delovno okolje kvasovk v njem neugodno. Ko je okolje spremenjeno bodisi zaradi akumulacije izločkov iz celice, se rast ustavi. Stacionarna faza lahko traja poljubno dolgo, odvisno od agresivnosti medija, nato pa avtolitični procesi razgradijo kvasovke (8). Omenjene spremembe se lahko ponazorijo s sledečimi reakcijami (10). ANAEROBNI POGOJI C 6 H 12 O 6 2C 2 H 5 OH + 2CO 2 (2.1) AEROBNI POGOJI: C 6 H 12 O 6 + 6O 2 6CO 2 + 6H 2 O (2.2)

25 10 Študija vpliva superkritičnega ogljikovega dioksida na preživetje kvasovk iz Saccharomyces cerevisiae Fermentacija je proces v katerem torej kvasovke spremenijo sladkor v etilni alkohol in CO 2. Slika 2.6 prikazuje kemijski prikaz fermentacije. Slika 2.6: Kemijski prikaz fermentacije (11) S. cerevisiae je prvi eukariot, ki so mu določili genom in predstavlja odličen modelni sistem za proučevanje pomembnih problemov pri višjih eukariotih (10). S. cerevisiae se običajno razmnožujejo vegetativno z brstenjem. Le občasno se razmnožujejo spolno s tvorjenjem askospor. Spore so v nasprotju s sporami bakterij temperaturno občutljive in jih lahko v eni minuti popolnoma uničimo že pri temperaturi 74 C (10). Spolno razmnoževanje: Askospore se razvijajo v golih nezaščitenih askih, in sicer na različne načine. Askospore so sferoidne in gladke. Askusi so lahko sferični ali elipsoidni. Celice so ponavadi sferične do sferoidne, občasno tudi elipsiodne do celindrične. Rast na trdni površini ima svoje značilnosti. Kolonije so po obliki okrogle, robovi kolonij so gladki. Površina kolonije je gladka, profil kolonije je izbokel do visoko izbokel (blazinaste). Ustroj kolonije je mazav. V tekočem gojišču je rast motna, opazimo sedimentacijo in flotacijo celične mase. Sedimentacija je granulirana. Kvasovke so sposobne asimilacije in fermentacije različnih vrst saharidov. Zmožne so anaerobne in aerobne rasti. Optimalna rast S. cerevisiae je med 33 in 35 C v mediju z 10 do 30 % glukoze. Minimalna

26 Študija vpliva superkritičnega ogljikovega dioksida na preživetje kvasovk iz Saccharomyces cerevisiae 11 temperatura, kjer raste S. cerevisiae, je 4 C ob 10 % glukoze. Pri 50 % glukoze je minimalna temperatura rasti 13 C. Nespolno razmnoževanje poteka z brstenjem. Majhen brst ali hčerinska celica nastane na površini starševske celice kot kaže slika 2.7. Brst raste in se napolni z jedrnim in citoplazmatskim materialom starševske celice. Ko je brst tako velik kot starševska celica, se celici ločita. Brst se razvija iz enega ali več mest starševske celice glede na vrsto celice. Kjer se proces razvija hitro, celice lahko ostanejo delno pritrjene ena na drugo (8). Slika 2.7: Življenjski cikel kvasovke (12) Napredek v uporabi interferenčnega mikroskopa (slika 2.8) je omogočil meriti suho težo posameznih celic kvasovk. Najpomembnejša in nepričakovana ugotovitev, dobljena s cepljenim kvasov Shizosaccharomyces pombe in pekovskim kvasom Saccharomyces cerevisiae je bila, da je bila porast v suhi teži posamezne celice s časom linearna in ne eksponentna, kot če bi bila hitrost naraščanja sorazmerna z že dobljeno velikostjo. Zato je priporočljivo, da je sinteza kontrolirana s citoplazmatskimi delci, ki se ne spremenijo v številu in aktivnosti za časa življenja celice, ki se podvoji pri delitvi celice in se enakomerno porazdeli med obe hčerinski celici. Drugo pomembno dognanje je bilo, da porast v celičnem volumnu ni bil strogo vzporeden porastu v suhi teži in da se je v dveh različnih preučevanih vrstah vzorec porasta znatno razlikoval. Ker je vzorec rasti in delitve precej različen pri kvasovkah, izgleda, da je linearna porast v teži splošna značilnost živih celic in da volumen narašča na bolj spremenljiv način (13).

27 12 Študija vpliva superkritičnega ogljikovega dioksida na preživetje kvasovk iz Saccharomyces cerevisiae Slika 2.8: Interferenčni mikroskop 2.3 Superkritični fluidi Superkritični fluidi (SCF) se uporabljajo kot topila za različne ekstrakcijske procese, kar je dokumentirano v številnih člankih. Nekaj komercialnih primerov takšnih ekstrakcij so dekofeinacija kave in čaja, ekstrakcija hmelja, začimb in eteričnih olj. V novejšem času se superkritični fluidi uporabljajo tudi v neekstrakcijskih procesih kot npr.: topila za kemijske in biokemijske reakcije, topila za kromatografske postopke, mediji za pridobivanje majhnih delcev. V skladu z direktivo Evropske skupnosti (88/344EEC) se lahko v ekstrakcijskih procesih brez omejitev uporabljajo naslednja topila: voda, propan, butan, butilacetat, etilacetat, etanol, CO 2, aceton in N 2 O. Vsa druga topila so ali prepovedana ali imajo zelo natančno določena možna področja uporabe (ne za prehrambeno, kozmetično in farmacevtsko industrijo) in količine dovoljenih preostankov topil v produktih. Uporaba fluidov nad kritično točko (sinonim superkritični fluid - SCF) pa daje produkte brez ostankov topil. SCF so plini ali tekočine nad kritično točko. To so pogoji, ko sta tlak in temperatura nad kritičnima vrednostma. Fazni diagram CO 2 prikazuje slika 2.9.

28 Študija vpliva superkritičnega ogljikovega dioksida na preživetje kvasovk iz Saccharomyces cerevisiae 13 Slika 2.9: Fazni diagram CO 2 (9) Slika 2.9 prikazuje p - T diagram za čisto snov. Tri daljice delijo p - T diagram na tri področja: trdno, tekoče in plinasto. Na črtah sta dve fazi v ravnotežju, v trojni točki pa hkrati v ravnotežju obstajajo vse tri faze. Za vsako spojino obstaja kritična točka (T C, p C ), kjer se konča nekontinuirani prehod iz tekočega stanja v plin. Nad kritično točko je topilo v nadkritičnem (sinonim superkritičnem) stanju in ga opišemo kot SCF. Najpogosteje s tem izrazom označujemo fluide v relativni bližini kritične točke (1,01 do 1,1 T C ter 1,01 do 1,5 p C ). V tem območju se termofizikalne lastnosti bistveno spreminjajo glede na spremembe tlaka in temperature. Značilni lastnosti SCF sta po eni strani zelo velika stisljivost in gostota, ki je podobna gostoti tekočine, po drugi strani pa imajo podobne transportne sposobnosti kot plini. Tabela 2.1 prikazuje velikostne rede nekaterih fizikalnih veličin za pline, tekočine in SCF. Tabela 2.1: Red velikosti fizikalnih veličin za pline, superkritične fluide in tekočine. plin superkritični fluid tekočina gostota (kg m -3 ) 1 0, difuzijski koeficient (m 2 s -1 ) viskoznost (kg m -1 s -1 )

29 14 Študija vpliva superkritičnega ogljikovega dioksida na preživetje kvasovk iz Saccharomyces cerevisiae Vidimo, da je gostota SCF reda velikosti gostota tekočin, medtem ko je njihova viskoznost podobna viskoznosti plinov. Difuzivnost je nižja od difuzivnosti plinov in višja od difuzivnosti tekočin. Lastnosti plina pri superkritičnih pogojih torej združujejo ugodne lastnosti topil v tekočem in plinastem stanju. Osnovna lastnost SCF, ki predstavlja širok potencial v separacijskih procesih, je možnost spreminjanja gostote superkritičnega topila v bližini njegove kritične točke z majhnimi spremembami tlaka in/ali temperature. Slika 2.10 prikazuje p - T diagram za CO 2 s premicami konstantne gostote. Slika 2.10: p - T diagram za CO 2 s premicami konstantne gostote Majhne spremembe tlaka in/ali temperature povzročijo velike spremembe gostote fluida ter s tem njegove sposobnosti raztapljanja oziroma različne topnosti snovi v superkritičnem topilu. S tlakom lahko torej kontinuirano spreminjamo in nadzorujemo lastnosti topila, posebno njegovo sposobnost raztapljanja: od območja, ko je SCF podoben plinu, do tam, ko ima podobne lastnosti kot tekočine. Zvišanje gostote fluida pogosto omogoča povečanje topnosti topljenca, nizka viskoznost pa omogoča boljše transportne lastnosti. S spremembo tlaka in temperature se spreminja tudi dielektrična konstanta SCF (slika 2.11).

30 Študija vpliva superkritičnega ogljikovega dioksida na preživetje kvasovk iz Saccharomyces cerevisiae 15 V tabeli 2.2 so zbrane nekatere spojine, ki se uporabljajo kot SCF, ter podatki o njihovih kritičnih točkah. Slika 2.11: Gostota in dielektrična konstanta CO 2 kot funkcija tlaka Izbor topila je dokaj odvisen od njegovih kritičnih lastnosti, ki jih podajamo v tabeli 2.2. Kot superkritično topilo opredelimo zmes (oz. čisto snov) pri pogojih, ki so vsaj za eno izmed najbolj zastopanih snovi nad njeno kritično točko. Tabela 2.2: Podatki o kritičnih temperaturah (T c ) in tlakih (p c ) za nekatere snovi. Snov T C ( C) p C (bar) Metan ,0 Eten 9 50,3 Ogljikov dioksid 31 73,8 Etan 32 48,8 Propen 92 46,2 Propan 97 42,4 Amonijak ,0 Triklorofluorometan ,1 Izopropanol ,0 Cikloheksan ,2

31 16 Študija vpliva superkritičnega ogljikovega dioksida na preživetje kvasovk iz Saccharomyces cerevisiae Benzen ,3 Toluen ,6 Aceton ,0 Voda ,0 Daleč najbolj pogosto uporabljen SCF je CO 2, saj ima številne dobre lastnosti: je netoksičen, ni vnetljiv, ni drag, je splošno priznan za varnega ter ima dokaj nizke vrednosti kritičnega tlaka in temperature (73,8 bar in 31,1 C). Omogoča tudi selektivno separacijo težje hlapnih snovi, izolacijo naravnih substanc v celoti in brez ostankov topila, separacijo temperaturno labilnih substanc ter enostavno energetsko ugodno in tako rekoč popolno regeneracijo topila (14). Kemijske in fizikalne lastnosti ogljikovega dioksida so zbrane v tabeli 2.3. Tabela 2.3: Fizikalno-kemijske lastnosti CO 2 (15). Kemijska formula CO 2 Molekulska masa Barva Vonj Gorljivost 44,01 g/mol brez brez ni Tališče -56,6 C Vrelišče -78,5 C Temperatura trojne točke -56,6 C Tlak trojne točke 5,185 bar Kritična temperatura 31 C Kritični tlak 73,825 bar Kritična gostota 464 kg/m 3 Prost CO 2 najdemo v atmosferi, v obliki brezbarvnega plina, je brez vonja in je nevtralnega okusa. V vodi se raztaplja in tvori ogljikovo kislino H 2 CO 3, ki pa disociira na H + in CO 3 2- ione. ph vrednost raztopine CO 2 znaša 3,7 in pade pod vplivom tlaka na 3,3 (16).

32 Študija vpliva superkritičnega ogljikovega dioksida na preživetje kvasovk iz Saccharomyces cerevisiae 17 3 METODE IN MATERIALI 3.1 Materiali Kemikalije krompirjev dekstrozni agar, Merck, mesni pepton, Merck, D (+) glukoza, minimum 99% GC, Sigma, natrijev klorid [NaCl], 99,5 %, Merck, ekstrakt kvasovk, Sigma, ekstrakt sladu, Sigma, natrijev citrat dihidrat [C 6 H 5 Na 3 O 7 x 2H 2 0], Kemika, metilensko modrilo, Merck, Roti-Quant, set za določevanje proteinov po Bradfordu, Carl Rath GmbH + Co KG, BSA, Albumin iz govejega seruma, minimum 98% electrophoresis, Sigma, kvasovke iz Saccharomyces cerevisiae Laboratorijska oprema tehtnica (0,0001), Kern 770, tehtnica (0,00001), Mettler AT201, grelnik, Tehtnica, mikroskop eclipse E200, Nikon, UV-Vis spektrofotometer, Varian, Cary 50 Probe, ph meter, Checker by Hanna,

33 18 Študija vpliva superkritičnega ogljikovega dioksida na preživetje kvasovk iz Saccharomyces cerevisiae mini inkubator, Labnet, mešalo reamix, Assistent, avtomatičen avtoklav za parno sterilizacijo, Zirbus, avtomatska pipeta, Transferpette. 3.2 Metode Priprava tekočega medija za rast kvasovk in inokulacija S. cerevisiae iz poševnega gojišča v pripravljen medij Sestava univerzalnega tekočega medija za gojenje kvasovk S. cerevisiae: 5 g mesnega peptona, 3 g ekstrakta kvasovk, 3 g ekstrakt sladu, 10 g D-(+) glukoze. Vse sestavine smo zatehtali v 1000 ml bučko in dodali 1 L navadne vode. Bučko z raztopino smo potopili v vrelo vodno kopel ter jo ob intenzivnem mešanju segrevali, dokler raztopina ni postala popolnoma bistra. Tekoči medij za rast kvasovk smo odpipetirali v erlenmajerice, po 50 ml v vsako erlenmajerico. Erlenmajerice smo nato zamašili z zamaški in zaščitili s papirjem in gumico (slika 3.1) ter jih sterilizirali v avtoklavu z vodno paro pod tlakom pri 121 C. Čas sterilizacije, ko je bila dosežena temperatura steriliziranja, je bil 15 min. Po končani sterilizaciji smo erlenmajerice s sterilnim tekočim medijem ohladili na približno 60 C in nato cepili (inokulirali) S. cerevisiae iz poševnega gojišča z mikrobiološko zanko (ezo) v pripravljen medij. Inokulacija je potekala tako, da smo z ezo trikrat preneseli bakterijsko kulturo iz poševnega gojišča v tekoči medij. Delali smo aseptično v laminarni komori. Epruvetam s poševnimi gojišči in erlenmajericam s sterilnimi mediji smo pred in po inokulaciji prežarili vratove na plinskem gorilniku, da smo preprečili možnost kontaminacije. Prav tako smo pred in po inukolaciji trikrat prežarili ezo. Delali smo ob prisotnosti odprtega ognja. Erlenmajerice smo inkubirali 24 h pri optimalni temperaturi za rast testnega mikroorganizma; pri 28 C za S. cerevisiae (17).

34 Študija vpliva superkritičnega ogljikovega dioksida na preživetje kvasovk iz Saccharomyces cerevisiae 19 Slika 3.1: Erlenmajerica z univerzalnim tekočim medijem za gojenje kvasovk Hranilne podlage ali gojišča Hranilne podlage so hranilne snovi, pripravljene za gojenje mikroorganizmov v laboratorijskih razmerah. Kot gojišča bi lahko označili vse snovi, na ali v katerih rastejo mikroorganizmi. Gojišča, ki se uporabljajo v mikrobiologiji, so številna in raznolika, saj so prilagojena potrebam mikroorganizmov in načinu uporabe (izolacija, vzdrževanje, namnoževanje in karakterizacija kulture). Gojišča so vodne raztopine, ki jih določen mikroorganizem potrebuje za rast. Glede na sestavo jih delimo na kompleksna (ne poznamo njihove natančne kemijske sestave) in definirana (vsebujejo točno določene koncentracije čistih kemikalij in se uporabljajo pri študiju mikrobnega metabolita). Priprava krompirjevega agarja za glive 39 g krompirjevega dekstroznega agarja (PDA) smo zatehtali v 1000 ml bučko in dolili 1 L vode. Bučko z raztopino smo potopili v vrelo vodno kopel ter jo ob intenzivnem mešanju segrevali, dokler v raztopini ni bilo več opaziti delcev. V prazne epruvete smo odpipetirali po 9 ml in 10 ml pripravljenega agarja, jih zamašili in prekrili s folijo ter jih nato sterilizirali v avtoklavu z vodno paro pod tlakom pri 121 ºC. Po končani sterilizaciji (ko je medij še tekoč) smo zlili v epruvete, ki vsebujejo 10 ml agarja še 9 ml agarja, tako da smo imeli epruvete z 19 ml sterilnega trdnega agarja (17) Priprava sterilne fiziološke raztopine 9 g natrijevega klorida smo zatehtali v 1000 ml bučko in jo dopolnili z destilirano vodo do oznake. Raztopino smo potopili v vročo vodno kopel in jo mešali, dokler se natrijev klorid ni popolnoma raztopil.

35 20 Študija vpliva superkritičnega ogljikovega dioksida na preživetje kvasovk iz Saccharomyces cerevisiae V prazne epruvete smo odpipetirali 9 ml pripravljene raztopine, jih zamašili in jih dali v avtoklav (slika 3.2), kjer smo jih sterilizirali z vodno paro pod tlakom pri temperaturi 121 C. Po končani sterilizaciji smo počakali, da se je sterilna fiziološka raztopina ohladila (17). Slika 3.2: Laboratorijski avtoklav Ohranitev mikrobnih kultur Mikrobno kulturo na poševnem gojišču (S. cerevisiae) smo večkrat precepljali na sterilno poševno gojišče, da bi preprečili izroditev ali celo izumrtje kulture. Kultura je bila zato vedno sveža. Pogostost precepljanja je odvisna od občutljivosti kulture (enkrat na teden, enkrat na mesec...). V levo roko smo prijeli epruveto z mikrobno kulturo, zraslo na poševnem gojišču in epruveto s sterilnim poševnim gojiščem za mikroorganizme. Obema epruvetama smo predhodno prežarili vratove na plinskem gorilniku, da smo preprečili možnost kontaminacije. Z desno roko smo odstranili pokrove epruvet in s prežarjeno ezo, ki smo jo ohladili na zraku, narahlo potegnili po gojišču z zraslo kulturo. Ezo s kulturo smo prenesli v sveže poševno gojišče in jo cepili na površino svežega gojišča. Po končanem precepljanju smo epruveti z gojišči zaprli in jima ponovno prežarili vratove. Prav tako smo prežarili tudi ezo. Gojišče s svežo precepljeno kulturo smo inkubirali pri temperaturi 28 C. Kulture, ki so se razvile na hranilnih podlagah, smo hranili v temnih in hladnih prostorih (v hladilniku) (17) Ugotavljanje velikosti mikrobnih populacij Poznamo več načinov za določanje števila mikrobnih celic. Indirektne ali gojitvene metode

36 Študija vpliva superkritičnega ogljikovega dioksida na preživetje kvasovk iz Saccharomyces cerevisiae 21 Štetje na trdnih gojiščih je najpogosteje uporabljena metoda štetja celic. Ta metoda se uporablja predvsem za ugotavljanje števila mikrobnih celic v tekočinah in materialih, ki jih je mogoče suspendirati v tekočini. Pri tej metodi štejemo žive celice. V preiskovalnem materialu je navadno preveč mikrobnih celic, da bi jih lahko šteli in je zato treba material ali kulturo najprej redčiti ter primarne razredčine cepiti na plošče hranilnega agarja. Gojitveni pogoji (temperatura, čas inkubacije ter uporabljena gojišča) so odvisni od mikrobnih celic, na katere se material preiskuje. Po urni inkubaciji pri določeni temperaturi kolonije preštejemo. Običajno štejemo na ploščah, ki imajo od 25 do 300 kolonij. Število kolonij, ki zrastejo na plošči hranilnega agarja ni zmeraj enako število bakterij v kulturi. Zato pravimo, da na plošči preštejemo enote, ki tvorijo kolonije (colony forming units, CFU). Ugotavljanje števila kolonij s štetjem na ploščah. Pripravili smo si razredčine kulture od 10-1 do V 1. epruveto z 9 ml fiziološke raztopine smo aseptično dodali 1 ml suspenzije S. cerevisiae. Z novim sterilnim nastavkom smo suspenzijo premešali in 1 ml prenesli v naslednjo epruveto s fiziološko raztopino. Postopek smo ponovili in vsakič zamenjali nastavek za pipeto. 1 ml razredčine kulture smo odpipetirali v sterilno petrijevko pod kotom 45 º. Epruvete s trdim hranilnim krompirjevim agarjem smo segrevali, dokler se agar ni utekočinil. V sterilno petrijevko smo nato prelili hranilni agar, katerega temperatura ni smela presegati 60 ºC. Petrijevke smo pazljivo pretresli, da se je razredčina kulture enakomerno porazdelila po petrijevki. Inkubirali smo 24 ur pri 28 C. Po 24 urah inkubacije smo prešteli število kolonij. Direktne ali števne metode Pri teh metodah štejemo mikrobne celice v vzorcu, kar lahko delamo na mikroskopskih preparatih ali s posebnimi napravami. Za takšno štetje uporabljamo objektne ploščice s števnimi komorami. Na označen kvadrat razmažemo vzorec in ga pokrijemo s krovnim stekelcem. S pomočjo mikroskopa (slika 3.3) preštejemo število celic.

37 22 Študija vpliva superkritičnega ogljikovega dioksida na preživetje kvasovk iz Saccharomyces cerevisiae Slika 3.3: Mikroskop Eclipse (18) Obarvanje mrtvih celic z metilenskim modrilom Za 200 ml raztopine smo potrebovali 0,02 g metilenskega modrila in 4 g natrijevega citrata dihidrata. Raztopino je bilo potrebno vedno pripraviti svežo. Zatehtali smo 0,02 g metilenskega modrila v 100 ml bučko in jo dopolnili z destilirano vodo. Nato smo zatehtali še 4 g trinatrijevega citrata dihidrata v 100 ml bučko in jo dopolnili z destilirano vodo. Obe raztopini smo dobro premešali. Pripravili smo suspenzijo kvasovk (uporabili smo nerazredčeno suspenzijo kvasovk) in raztopino metilenskega modrila. V ependorfko smo odpipetirali 500 µl metilenskega modrila in 500 µl razredčene suspenzije s kulturo S. cerevisiae. Raztopino smo dobro premešali. Na števno komoro (slika 3.4) smo odpipetirali 10 µl raztopine metilenskega modrila in razredčene suspenzije s kulturo S. cerevisiae. Mrtve celice so se obarvale modro. Prešteli smo žive in mrtve celice. Natančnost metode: približno celic/ml (običajno je napaka manjša od 1-5 %).

38 Študija vpliva superkritičnega ogljikovega dioksida na preživetje kvasovk iz Saccharomyces cerevisiae 23 Slika 3.4: Števna komora: Neubauer Improved (19) Cepljenje kulture na trdna gojišča V sterilno petrijevko smo pod kotom 45 prelili 19 ml tekočega krompirjevega agarja in ga pustili, da se je ohladil. V levo roko smo prijeli epruveto s trdnim gojiščem S. cerevisiae in ji odstranili zamašek ter ga trikrat prežarili. Z ezo, ki smo jo predhodno prežarili, smo kulturo pomešali in jo nanesli v obliki spirale na strjen agar v petrijevki. Petrijevko smo inkubirali 24 ur pri 28 C (17) Merjenje optične gostote z UV-Vis spektrofotometru Antimikrobno delovaje inhibitorja na rast testnih mikroorganizmov v določenih časovnih intervalih smo določili z merjenjem optične gostote vzorcev z UV/Vis spektrofotometrom pri 550 nm. Merili smo gostoto rasti celic kvasovk v mediju. Medij je vseboval 1 ml suspenzije s kulturo S. cerevisiae in 5 ml univerzalnega tekočega medija za rast kvasovk. Rast celic smo izmerili pred in po inkubaciji v SC CO 2 v suspenziji S. cerevisiae (17) Inkubacija suspenzije s kuturo S. cerevisiae v zgoščenem CO 2 Razredčeno suspenzijo S. cerevisiae smo inkubirali v SC CO 2 v visokotlačnem šaržnem reaktorju (sliki 3.5 in 3.6). Suspenzija je vsebovala 1 ml tekoče kulture S. cerevisiae in 5 ml univerzalnega tekočega medija za rast kvasovk. Pripravljeno suspenzijo smo v visokotlačnem šaržnem reaktorju termostatirali na želeno temperaturo (35 C). Ko smo dosegli želeno temperaturo, smo reaktor dopolnili s CO 2 do želenega tlaka.

39 24 Študija vpliva superkritičnega ogljikovega dioksida na preživetje kvasovk iz Saccharomyces cerevisiae T = const. PI P jeklenka s CO grelnik 3 - reaktor P - visokotlačna črpalka 2 PI - manometer 1 Slika 3.5: Shema visokotlačnega šaržnega reaktorja Iz slike 3.5 je razvidno, da je reaktor opremljen s priključkom za dovod CO 2 iz jeklenke preko visokotlačne črpalke ter manometrom, s katerim smo merili tlak. Slika 3.6: Visokotlačni šaržni reaktor Določanje koncentracije proteinov Za določanje koncentracije proteinov smo uporabili kolorimetrično metodo po Bradfordu (20). Metoda temelji na dejstvu, da se barvilo Comassie briliant modro G-250 specifično veže na protein. Rdeča barva barvila se spremeni v modro, s tem pa se spremeni absorpcijski

40 Študija vpliva superkritičnega ogljikovega dioksida na preživetje kvasovk iz Saccharomyces cerevisiae 25 maksimum barvila iz 465 nm na 595 nm. Vezava barvila na protein je zelo hitra (okoli dve minuti), kompleks protein barvilo pa je stabilen relativno dolgo (približno eno uro). Metodo je možno izvajati v dveh območjih: standardna procedura ali makro metoda (ang. standard assay) za območje koncentracije od (0,1 do 1) mg/ml in mikro proceduro (ang. micro assay) za območje koncentracij od (1 do 25) µg/ml (20). V prilogi D je priložena slika D. 1, kjer je prikazana umeritvena krivulja za makro Bradfordovo metodo. S pomočjo te umeritvene krivulje smo lahko izračunali oziroma odčitali direktno iz grafa glede na dobljene vrednosti absorbance pri valovni dolžini 595 nm, (OD 595 ), koncentracijo proteina v suspenziji S. cerevisiae. Koncentracijo proteinov smo vedno določevali z makro Bradfordovo metodo. Bradfordova metoda: Bradfordov reagent (Roti-Quant) smo 5x razredčili v Na-PBS pufru ph = 7,4. Za merjenje absorbance pri 595 nm smo si vzorec pripravili tako, da smo vzeli V = 1 ml razredčenega reagenta in V = 20 µl vzorca iz suspenzije S. cerevisiae. Slepi vzorec: V = 1 ml razredčenega reagenta in V = 20 µl Na-PBS pufra ph = 7,4. Meritve posameznega vzorca smo izvajali na UV-Vis spektrofotometru pri 595 nm. Vrednost k dobimo iz enačbe umeritvene krivulje po makro Bradfordovi metodi (enačba 3.1 in 3.2). Vrednosti za c z in c k bi lahko tudi direktno odčitali iz ustrezne umeritvene krivulje. c c z k OD595, z = (3.1) k OD595, k = (3.2) k kjer je: k c z naklon umeritvene krivulje BSA začetna koncentracija proteinov v raztopini, c k končna koncentracija proteina v raztopini, OD 595, z absorbanca vzorca na začetku, OD 595,k absorbanca vzorca na koncu.

41 26 Študija vpliva superkritičnega ogljikovega dioksida na preživetje kvasovk iz Saccharomyces cerevisiae 4 REZULTATI IN DISKUSIJA Vpliv SC CO 2 na preživetje kvasovk iz S. cerevisiae smo preučevali pri različnih tlakih, različnih načinih ekspanzije in različnih inkubacijskih časih. Za vsak eksperiment posebej smo si pripravili svež tekoči medij za rast kvasovk. Medij smo sterilizirali v laboratorijskem avtoklavu, kjer z vodno paro pod tlakom 2,06 bar pri 121 C (15 min), uničimo vse žive celice in spore. Po končani sterilizaciji smo v pripravljen medij inokulirali z mikrobiološko ezo kulturo S. cerevisiae iz poševnega gojišča. Delali smo v laminarni komori ob prisotnosti odprtega ognja. Erlenmajerice z univerzalnim tekočim medijem za gojenje kvasovk in predhodno inukoliranim S. cerevisiae smo inkubirali 24 ur pri optimalni temperaturi za rast mikroorganizma; pri 28 C za S. cerevisiae. Po inkubaciji smo suspenzijo s kulturo S. cerevisiae razredčili z univerzalnim tekočim medijem za gojenje kvasovk v razmerju 1:5. Razredčeni suspenziji smo izmerili absorbanco pri 550 nm, določili koncentracijo proteinov pri 595 nm, ter odčitali ph. Velikost mikrobne populacije S. cerevisiae smo določili s pomočjo števne metode z uporabo mikroskopa. V laminarni komori smo aseptično odpipetirali 6 ml razredčene suspenzije S. cerevisiae v ampulo. Slednjo smo izbrali zato, ker ima izredno ozek vrat in pri hitrem izpustu CO 2 iz reaktorja ni prišlo do izliva suspenzije. Da bi preprečili možnost razbitja ampule, smo le-to zavili v sterilno vato in jo dali v visokotlačni šaržni reaktor, kjer smo suspenzijo s kulturo S. cerevisiae termostatirali na želeno temperaturo (35 C) in nato reaktor dopolnili s CO 2 do želenega tlaka. Suspenzijo s kulturo S. cerevisiae smo inkubirali v zgoščenem CO 2 pri različnih tlakih in pri konstantni temperaturi (35 C). Čas inkubacije razredčene suspenzije S. cerevisiae v SC CO 2 smo spreminjali glede na preživelost kvasovk S. cerevisiae. Po končani inkubaciji v SC CO 2 smo suspenziji s kulturo S. cerevisiae ponovno izmerili absorbanco pri 550 nm, določili koncentracijo proteinov pri 595 nm, ter izmerili ph raztopine. 500 µl inkubirane suspenzije S. cerevisiae v SC CO 2 smo obarvali s 500 µl metilenskega modrila in pod mikroskopom ugotavljali preživelost celic. Odmrle celice so se obarvale modro. Za kontrolo smo naredili še razmaze na trdnih gojiščih in po 24 h inkubacije pri temperaturi 28 C prešteli zrasle kolonije S. cerevisiae. Da bi lahko primerjali preživelost celic S. cerevisiae v suspenziji s preživelostjo celic S. cerevisiae, nacepljenih na trdnih gojiščih, inkubiranih v SC CO 2, smo si pripravili še trdna gojišča za

42 Študija vpliva superkritičnega ogljikovega dioksida na preživetje kvasovk iz Saccharomyces cerevisiae 27 rast kvasovk. Tekoči krompirjev dekstrozni agar smo odpipetirali po 4mL v epruvete in naredili poševna gojišča. Ko se je agar strdil, smo z ezo na sterilna poševna gojišča v laminarni komori aseptično nacepili kulturo S. cerevisiae. Epruveto smo zavili v sterilno vato in jo dali v visokotlačni šaržni reaktor. Celice S. cerevisiae, nacepljene na trdnih gojiščih smo inkubirali 30 min pri 35 C v SC CO 2 pri različnih tlakih in za oba načina ekspanzije. Med tem smo v sterilno petrijevko pod kotom 45 prelili 19 ml tekočega krompirjevega agarja in ga pustili, da se je ohladil. Po končani inkubaciji smo z ezo pomešali po inkubirani kulturi S. cerevisiae in jo v obliki spirale nanesli na strjen agar v petrijevki. Petrijevko s kulturo S. cerevisiae smo pustili rasti 24 ur pri temperaturi 28 C. Po končanem delu smo vse vzorce z mikroorganizmi uničili z avtoklaviranejm. 4.1 Hitrost dekompresije pri izvedenih eksperimentih V visokotlačnem šaržnem reaktorju smo inkubirali suspenzije S. cerevisiae v SC CO 2 pri 35 C in tlaku 100 bar. Po določenem inkubacijskem času smo izvedli dekompresijo. Spreminjali smo hitrost dekompresije kot funkcijo spremembe tlaka v odvisnosti od spremembe časa. Izračunali smo povprečno spremembo tlaka po času. Rezultati so podani v tabeli 4.1. Tabela 4.1: Povprečna sprememba tlaka po času pri dekompresiji suspenzije S. cerevisiae izpostavljene za 30 min pri 35 C in 100 bar v SC CO 2. ekspanzija p/ t (bar/min) hitra 30,5 počasna 3,8 Pri hitri ekspanziji in pri visokih tlakih je suspenzija S. cerevisiae zamrznila. To je predstavljalo velik problem. Morali smo počakati, da se je suspenzija ob ognju odtalila. Suspenzije nismo smeli premešati, saj je bil na stenah ampule še vedno prisoten CO 2 in le-ta bi lahko privedel do izliva suspenzije S. cerevisiae iz ampule. Šele ko smo imeli popolnoma tekočo suspenzijo in v njej ni bilo videti prisotnosti CO 2 smo lahko začeli z meritvami.

43 28 Študija vpliva superkritičnega ogljikovega dioksida na preživetje kvasovk iz Saccharomyces cerevisiae 4.2 Vpliv časa inkubiranja na preživetje kvasovk iz S. cerevisiae v SC CO 2 pri tlaku 100 bar Razredčeno suspenzijo s kulturo S. cerevisiae smo odpipetirali v ampulo. Ampulo smo zavili v sterilno vato in jo dali v visokotlačni šaržni reaktor. Suspenzijo S. cerevisiae smo inkubirali v SC CO 2 pri tlaku 100 bar in temperaturi 35 C. Proučevali smo vpliv časa inkubacije na preživetje kvasovk iz S. cerevisiae v SC CO 2. Izvedli smo dve vrsti ekspanzije: počasno ( p/ t = 3,8 bar/min) in hitro ( p/ t = 30,5 bar/min). Preživelost kvasovk iz S. cerevisiae v suspenziji pri različnih časih inkubacije in tlaku 100 bar ter pri dveh vrstah ekspanzije prikazuje tabela 4.2 in tabeli A. 1 in A. 2, kjer so prikazane optične gostote suspenzije S. cerevisiae pred in po izpostavitvi v SC CO 2. Tabela 4.2: Odstotek preživelosti kvasovk iz S. Cerevisiae v SC CO 2 pri 100 bar in 35 C ter različnih inkubacijskih časih pri hitri in počasni ekspanziji. t (min) p/ t (bar/min) preživetje (%) (ekspanzija) 30 3,8 (počasna) ,5 (hitra) ,8 (počasna) ,5 (hitra) ,8 (počasna) ,5 (hitra) ,8 (počasna) ,5 (hitra) ,8 (počasna) ,5 (hitra) ,8 (počasna) ,5 (hitra) ,8 (počasna) ,5 (hitra) 0

44 Študija vpliva superkritičnega ogljikovega dioksida na preživetje kvasovk iz Saccharomyces cerevisiae 29 Preživelost celic v % smo izračunali tako, da smo pod mikroskopom na števni komori prešteli žive in mrtve celice in število živih celic delili s številom vseh celic. Direktne metode (štetje celic S. cerevisiae pod mikroskopom) smo primerjali z indirektnimi metodami (ugotavljanje števila kolonij s štetjem na ploščah). Rezultati izračunov preživelosti celic S. cerevisiae in število kolonij S. cerevisiae s štetjem na ploščah so prikazani v tabeli B. 1 in B. 2 v prilogi B. Tabela 4.2 nam nazorno prikazuje, da so pri času inkubiranja 30 minut preživele skoraj vse celice S. cerevisiae. Razlike v preživelosti celic med obema vrstama ekspanzij so izredno majhne, kar je bilo v nasprotju z našimi pričakovanji. Preživelost celic S. cerevisiae je v odvisnosti od časa inkubiranja upadala skoraj linearno vse do 95 min, kjer je sledil strmi padec krivulje. To nam demonstrira tudi graf na sliki 4.1. Po 95 min inkubiranja suspenzije s kulturo S. cerevisiae v SC CO 2 so celice zelo hitro odmirale. Že pri 100 min je preživelost celic padla za več kot polovico in pri 110 minutah so vse celice odmrle. p = 100 bar preživetje (%) hitra ekspanzija počasna ekspanzija t (min) Slika 4.1: Vpliv hitrosti ekspanzije in časa inkubacije v SC CO 2 na preživetje kvasovk iz S. cerevisiae pri p = 100 bar in T = 35 C. Ugotovili smo, da se je s podaljševanjem časa inkubiranja razredčene suspenzije S. cerevisiae v SC CO 2 zmanjševalo število živih celic S. cerevisiae v suspenziji. Da bi

45 30 Študija vpliva superkritičnega ogljikovega dioksida na preživetje kvasovk iz Saccharomyces cerevisiae ugotovili, kaj se zgodi s celicami S. cerevisiae, ki so bile inkubirane v SC CO 2, pri preživelosti 0 %, smo jih fotografirali pod mikroskopom (slika 4.2). Odmrle celice imajo rahlo nagubano celično steno in ni vidnega razmnoževanja. Slika 4.2: Mrtve celice Za primerjavo smo fotografirali še žive celice S. cerevisiae, ki smo jih predhodno inkubirali v SC CO 2 30 min in je njihovo preživetje bilo 97 % (slika 4.3). Na sliki 4.3, nazorno vidimo nespolno razmnoževanje celic S. cerevisiae, ki poteka z brstenjem. Majhen brst ali hčerinska celica nastane na površini starševske celice. Slika 4.3: Žive celice

46 Študija vpliva superkritičnega ogljikovega dioksida na preživetje kvasovk iz Saccharomyces cerevisiae Vpliv tlaka na preživetje kvasovk iz S. cerevisiae po 30 minutni inkubaciji v SC CO 2 Razredčeno suspenzijo S. cerevisiae smo inkubirali 30 min v SC CO 2 v visokotlačnem šaržnem reaktorju pri temperaturi 35 C. Vsak eksperiment smo izvajali pri točno določenem tlaku. Dobljeni rezultati so prikazani v tabeli 4.3. Tabela 4.3: Preživelost celic S. cerevisiae pri različnih tlakih in 35 C ter inkubacijskemu času 30 min v SC CO 2. p (bar) ( p/ t = bar/min) ekspanzija preživetje (%) 10 30,5 (hitra) ,8 (počasna) ,5 (hitra) ,8 (počasna) ,5 (hitra) ,8 (počasna) ,5 (hitra) ,8 (počasna) ,5 (hitra) 73 Pri tlaku 10 bar so vse celice S. cerevisiae preživele, kot smo tudi pričakovali. Pri 75 bar, malo nad vrednostjo kritičnega tlaka CO 2 (p c = 73,8 bar), so vse celice S. cerevisiae v suspenziji preživele pri obeh vrstah ekspanzije. Iz grafa na sliki 4.4 je razvidno, da je krivulja preživelosti kvasovk S. cerevisiae po inkubiranju v SC CO 2 v odvisnosti od tlaka linearna do tlaka 75 bar, nato začne z naraščanjem tlaka linearno padati. Ugotovili smo, da s povečanjem tlaka preživi manjše število celic S. cerevisiae. Vendar nas je presenetila ugotovitev, da pri zelo visokih tlakih (200 in 300 bar) še vedno preživi velik procent celic S. cerevisae (77 % pri tlaku 300 bar in po počasni ekspanziji ter 73 % pri tlaku 300 bar in po hitri ekspanziji).

47 32 Študija vpliva superkritičnega ogljikovega dioksida na preživetje kvasovk iz Saccharomyces cerevisiae t = 30 min preživetje (%) p (bar) hitra ekspanzija počasna ekspanzija Slika 4.4: Odvisnost preživetja celic S. cerevisiae od tlaka po 30 minutni inkubaciji v SC CO 2 pri 35 C. Prikazan je tudi vpliv hitrosti ekspanzije na preživetje kvasovk iz S. cerevisiae. Iz slike 4.4 je razvidno, da preživetje kvasovk iz S. cerevisiae upada z višanjem tlaka inkubiranja. Pri počasni ekspanziji ( p/ t = 3,8 bar/min) je preživetje večje kot pri hitri ekspanziji ( p/ t = 30,5 bar/min). Pričakovali smo tudi, da bo pri zelo visokih tlakih (200 in 300 bar) večja umrljivost, a se je izkazalo, da so kvasovke zelo odporne na povišan tlak. 4.4 Koncentracija proteinov v suspenziji S. cerevisiae po inkubiranju v SC CO 2 Koncentracijo proteinov smo določevali s pomočjo UV-Vis spektrofotometra pri valovni dolžini 595 nm. S pomočjo umeritvene krivulje za makro Bradfordovo metodo (priloga D) smo izračunali ali direktno iz krivulje odčitali koncentracijo proteinov v inkubirani suspenziji S. cerevisiae v SC CO 2. Koncentracijo proteinov v suspenziji S. cerevisiae smo določili pred in po inkubiranju v SC CO 2. Izračunali smo koncentracijsko razliko proteinov in relativno vrednost koncentracije proteinov v suspenziji S. cerevisiae ter rezultate prikazali na diagramih.

48 Študija vpliva superkritičnega ogljikovega dioksida na preživetje kvasovk iz Saccharomyces cerevisiae 33 Tabela 4.4 podaja koncentracijsko razliko proteinov in relativno vrednost v suspenziji S. cerevisiae v odvisnosti od različnih tlakov. Čas inkubiranja suspenzije S. cerevisiae v SC CO 2 je bil 30 min pri temperaturi 35 C. V prilogi v tabelah C. 1 in C. 2 so prikazani izračuni koncentracije proteinov v suspenziji pri hitri ( p/ t = 30,5 bar/min) in počasni ( p/ t = 3,8 bar/min) ekspanziji. V prilogi D, na sliki D. 1 je prikazana krivulja za makro Bradfordovo metodo. Tabela 4.4: Koncentracijska razlika in relativna vrednost proteinov v suspenziji S. cerevisiae po inkubaciji v SC CO 2 pri 35 C in pri različnih tlakih. p (bar) p/ t (bar/min) (ekspanzija) c z c k c c/c z 75 3,8 (počasna) 0,0259 0,0552 0,0293 1, ,5 (hitra) 0, ,016 0, , ,8 (počasna) 0,0526 0,0816 0,029 0, ,5 (hitra) 0,0194 0,0341 0,0147 0,76 Iz tabele 4.4 in slike 4.5 je razvidno, da se je koncentracija proteinov v suspenziji S. cerevisae po inkubaciji SC CO 2 povečala ne glede na tlak in način ekspanzije. To je bilo v skladu z našimi sklepanji. Pričakovali smo, da se bo pri povečanem številu odmrlih celic po izpostavitvi visokemu tlaku koncentracija proteinov v suspenziji S. cerevisiae povečala. Visoki tlaki namreč povzročijo, da pride do permeabilizacije celičnih sten kvasovk S. cerevisiae. Tako se lahko intracelularni proteini izločijo iz celice. Posledično se poveča koncentracija skupnih proteinov v suspenziji. Koncentracijsko razliko proteinov v suspenziji S. cerevisiae pred in po inkubiranju v odvisnosti od tlaka prikazuje slika 4.5.

49 34 Študija vpliva superkritičnega ogljikovega dioksida na preživetje kvasovk iz Saccharomyces cerevisiae t = 30 min 0,035 0,03 c (mg/ml) 0,025 0,02 0,015 0,01 hitra ekspanzija počasna ekspanzija 0, p (bar) Slika 4.5: Koncentracijska razlika proteinov v suspenziji S. cerevisiae pred in po 30 min inkubiranju v SC CO 2 v odvisnosti od tlaka in hitrosti ekspanzije. Iz slike 4.5 lahko sklepamo, da počasna ekspanzija ( p/ t = 3,8 bar/min) povzroči intenzivnejše sproščanje proteinov iz celic kvasovk iz S. cerevisiae, saj je koncentracijska razlika večja kot v primeru hitre ekspanzije ( p/ t = 30,5 bar/min). Če primerjamo eksperimente, pri katerih smo izvedli hitro ekspanzijo ( p/ t = 30,5 bar/min) ugotovimo, da je bila pri tlaku 75 bar po inkubaciji suspenzije S. cerevisiae v SC CO 2 manjša koncentracijska razlika proteinov v suspenziji kot pri tlaku 300 bar. To potrdi tudi naša pričakovanja. Suspenzijo S. cerevisiae smo si pred vsakim eksperimentom pripravili svežo, zato so bile začetne koncentracije proteinov v suspenziji različne. Kvasovke so živi organizmi. Njihova rast je odvisna od številnih vplivov (pogoji rasti, priprava tekočega medija za rast kvasovk, itd.), zato smo pričakovali, da v vsakem novem vzorcu suspenzije S. cerevisiae ne bo iste vsebnosti koncentracije proteinov. Slika 4.6 prikazuje relativno vrednost koncentracije proteinov v suspenziji S. cerevisiae v odvisnosti od tlaka in načina ekspanzije.

50 Študija vpliva superkritičnega ogljikovega dioksida na preživetje kvasovk iz Saccharomyces cerevisiae 35 t = 30 min 2,5 2 c/cz 1,5 1 hitra ekspanzija počasna eksanzija 0, p (bar) Slika 4.6: Relativna vrednost koncentracije proteinov v suspenziji S. cerevisiae v odvisnosti od tlaka in načina ekspanzije po 30 minutni inkubaciji pri 35 C v SC CO 2. Kadar smo izvedli hitro ekspanzijo ( p/ t = 30,5 bar/min) pri tlaku 75 bar je bila dosežena zelo visoka relativna vrednost koncentracije proteinov v suspenziji. Eksperiment pri 75 bar in 35 C je bil izveden v bližini kritične točke CO 2 (T c = 31 C, p c = 73,8 bar). Najverjetneji pogoji, ki so doseženi v bližini kritične točke SC CO 2, povzročijo intentivnejšo permeabilizacijo celične stene. Posledično se je sprostilo več proteinov. To je privedlo do večje relativne vrednosti koncentracije proteinov v suspenziji po izpostavitvi v SC CO 2 pri tlaku 75 bar kot pri tlaku 300 bar za obe vrsti ekspanzije. 4.5 Vpliv SC CO 2 na vrednost ph suspenzije S. cerevisiae Realnega ph med procesom inkubiranja suspenzije S. cerevisiae v SC CO 2 nismo mogli izmeriti, saj ne obstajajo ustrezne naprave, ki bi to omogočale. Tako smo izmerili ph le pred in po inkubiranju suspenzije kvasovk S. cerevisiae v SC CO 2 s pomočjo digitalnega ph metra. Pričakovali smo, da se bo ph z dodatkom SC CO 2 v razredčeni suspenziji S. cerevisiae spremenil. Tabela 4.5 podaja ph vrednosti pri različnih eksperimentih.

51 36 Študija vpliva superkritičnega ogljikovega dioksida na preživetje kvasovk iz Saccharomyces cerevisiae Tabela 4.5: Vrednosti ph suspenzije S. cerevisiae pri različnih tlakih in različnih časih inkubacije v SC CO 2. t (min) p (bar) p/ t (bar/min) (ekspanzija) ph z ph k ,8 (počasna) 5,27 4, ,5 (hitra) 5,23 4, ,8 (počasna) 5,19 4, ,5 (hitra) 5,10 4, ,8 (počasna) 5,10 4, ,5 (hitra) 5,06 4, ,8 (počasna) 5,21 4, ,5 (hitra) 5,05 4, ,8 (počasna) 5,22 4, ,5 (hitra) 5,06 4, ,8 (počasna) 5,10 4, ,5 (hitra) 5,20 4,64 Iz tabele lahko razberemo, da se je ph suspenzije s kulturo S. cerevisiae po inkubaciji SC CO 2 znižal. Univerzalni medij za gojenje kvasovk vsebuje vodo. CO 2 se je raztapljal v vodi in tvoril kislino H 2 CO 3. Posledično se je ph suspenzije S. cerevisiae znižal. Kvasovke so na neugodne vplive okolja mnogo bolj odporne kot bakterije, saj rastejo pri pri znatno nižjih ph vrednostih. Optimalni ph za rast kvasovk je med 4,0 in 5,0 (9). SC CO 2 je vplival na ph vrednost suspenzije S. cerevisiae, kar pa na rast kvasovk iz S. cerevisiae ni imelo velikega vpliva, saj lahko v literaturi zasledimo, da kvasovke rastejo tudi pri vrednosti ph 1,6 (8). 4.6 Vpliv SC CO 2 na preživetje celic S. cerevisiae na trdnih gojiščih Trdna gojišča smo si pripravili iz krompirjevega dekstroznega agarja. V epruveto smo v laminarni komori aseptično odpipetirali 4 ml agarja in naredili poševna gojišča. Na

52 Študija vpliva superkritičnega ogljikovega dioksida na preživetje kvasovk iz Saccharomyces cerevisiae 37 poševna gojišča smo z ezo precepili S. cerevisiae, epruveto zavili v sterilno vato, jo dali v visokotlačni šaržni reaktor in inkubirali v SC CO 2 pri različnih tlakih. Temperatura (35 C) in čas inkubacije (30 min) sta bila konstantna. Po inkubiranju smo kulturo S. cerevisiae cepili iz trdnega poševnega gojišča na novo sterilno gojišče in jo pustili rasti 24 ur pri temperaturi 28 C. Po 24 urah inkubacije smo dobili rezultate, ki jih prikazuje tabela 4.6. Tabela 4.6: Preživetje celic S. cerevisiae na trdnih gojiščih po 30 minutni inkubaciji v SC CO 2 pri 35 C in različnih tlakih ter načinu ekspanzije. p (bar) p/ t (bar/min) preživetje (ekspanzija) 100 3,8 (počasna) preživijo ,5 (hitra) preživijo 200 3,8 (počasna) preživijo ,5 (hitra) slabo preživijo 300 3,8 (počasna) ne preživijo ,5 (hitra) ne preživijo Pri inkubaciji S. cerevisiae na trdnih gojiščih v SC CO 2 pri tlaku 100 bar (slika 4.9) so celice preživele ne glede na vrsto ekspanzije, ki smo jo uporabili. Prav tako so celice preživele pri tlaku 200 bar v primeru, ko smo uporabili počasno ekspanzijo ( p/ t = 3,8 bar/min). Slabšo preživelost (slika 4.8) je bilo opaziti pri tlaku 200 bar in hitri ekspanziji ( p/ t = 30,5 bar/min), medtem ko pri tlaku 300 bar ni bilo zaznati preživetja celic pri obeh vrstah ekspanzije. Iz dobljenih rezultatov je razvidno, da so celice kvasovk S. cerevisiae v suspenziji bolj odporne na vpliv SC CO 2 kot celice S. cerevisiae nacepljene na trdno gojišče pri enakih pogojih inkubacije. Slika 4.8 prikazuje gosto razrastle kolonije S. cerevisiae po 24 urni inkubaciji pri 28 C, ki smo jih predhodno izpostavili za 30 min pri 35 C in tlaku 100 bar v SC CO 2 (levo) ter slabo razrasle kolonije S. cerevisiae po 24-h inkubacije in predhodni izpostavitvi pri tlaku 200 bar.

53 38 Študija vpliva superkritičnega ogljikovega dioksida na preživetje kvasovk iz Saccharomyces cerevisiae Slika 4.7: Primerjava intenzivnosti rasti celic S. cerevisiae po izpostavitvi v SC CO 2 pri tlaku 100 bar (levo) in 200 bar (desno). Ugotovili smo, da je zelo pomembno, kako hitro bomo CO 2 ekspandirali po končanem procesu inkubiranja kulture. Trdno gojišče se je namreč po inkubiranju v SC CO 2 pri tlaku 200 bar in 300 bar, ko smo izvedli hitro ekspanzijo (( p/ t = 30,5 bar/min) poškodovalo, kar je posledica zamrznitve (slika 4.9). Slika 4.8: Poškodovano trdno gojišče po inkubiranju v SC CO 2 pri tlaku 300 bar (levo) in 200 bar (na sredini) ter nepoškodovano trdno gojišče pri tlaku 100 bar (desno) po izvedeni hitri ekspanziji ( p/ t = 30,5 bar/min).

54 Študija vpliva superkritičnega ogljikovega dioksida na preživetje kvasovk iz Saccharomyces cerevisiae 39 5 SKLEP Uspešno smo izvedli inkubacije suspenzij kvasovk iz S. cerevisiae in kvasovk iz S. cerevisiae nacepljenih na poševnih trdnih gojiščih v SC CO 2 pri različnih tlakih, inkubacijskih časih in hitrosti ekspanzije. Naše delo je bilo razdeljeno na več posameznih delov. Najprej smo si po enostavni metodi pripravili suspenzijo s kulturo S. cerevisiae, ki smo jo najprej razredčili z univerzalnim tekočim medijem za gojenje kvasovk. Sledile so začetne meritve absorbance, vrednosti ph in določitve koncentracije proteinov v suspenziji S. cerevisiae. Po inkubaciji suspenzije S. cerevisiae v SC CO 2 smo izmerili še končne vrednosti. Izračuni med začetnimi in končnimi vrednostmi so nas pripeljali do različnih ugotovitev in potrdili naša pričakovanja. Ugotovili smo, da se je s podaljševanjem časa inkubiranja razredčene suspenzije S. cerevisiae v SC CO 2 zmanjševalo število živih celic S. cerevisiae v suspenziji. Najvišjo preživelost celic (97 %) S. cerevisiae v SC CO 2 pri tlaku 100 bar in 35 C smo dosegli po 30 minutnem inkubiranju suspenzije. Temperaturo, ki ima izredno velik vpliv na karakteristike tekočine, smo obdržali pri vseh eksperimentih konstantno 35 C. Tudi s povečanjem tlaka je preživelo manjše število celic S. cerevisiae. Vendar nas je presenetila ugotovitev, da je pri zelo visokih tlakih (200 in 300 bar) še vedno preživelo velik procent celic S. cerevisae (77 % pri tlaku 300 bar in po počasni ekspanziji ter 73 % pri tlaku 300 bar in po hitri ekspanziji). Koncentracija proteinov v suspenziji S. cerevisae se je po inkubaciji v SC CO 2 povečala ne glede na tlak in način ekspanzije. Pričakovali smo, da se bo pri povečanem številu mrtvih celic po izpostavitvi visokemu tlaku koncentracija proteinov v suspenziji S. cerevisiae povečala. Visoki tlaki namreč povzročijo, da pride do permeabilizacije celičnih sten kvasovk S. cerevisiae. Tako se lahko intracelularni proteini izločijo iz celice. Posledično se poveča koncentracija skupnih proteinov v suspenziji. Kadar smo izvedli hitro ekspanzijo ( p/ t = 30,5 bar/min) pri tlaku 75 bar, je bila dosežena zelo visoka relativna vrednost proteinov v suspenziji. Eksperiment pri 75 bar in 35 C je bil izveden v bližini kritične točke CO 2 (T c = 31 C, p c = 73,8 bar). Najverjetneje je

55 40 Študija vpliva superkritičnega ogljikovega dioksida na preživetje kvasovk iz Saccharomyces cerevisiae permeabilizacija celične stene pri pogojih blizu kritične točke SC CO 2 intenzivnejša. Posledično se je sprostilo več proteinov. To je privedlo do večje relativne vrednosti koncentracije proteinov v suspenziji po izpostavitvi v SC CO 2 pri tlaku 75 bar kot pri tlaku 300 bar za obe vrsti ekspanzije. Sprememba tlaka po času pri dekompresiji suspenzije S. cerevisiae, izpostavljene pri 35 C in tlaku 100 bar v SC CO 2 ne vpliva močno na preživetje kvasovk S. cerevisiae. Pri inkubaciji S. cerevisiae na trdnih gojiščih v SC CO 2 pri tlaku 100 bar so celice preživele ne glede na vrsto ekspanzije, ki smo jo uporabili. Prav tako so celice preživele pri tlaku 200 bar v primeru, ko smo izvedli počasno ekspanzijo ( p/ t = 3,8 bar/min). Slabšo preživelost je bilo opaziti pri tlaku 200 bar in hitri ekspanziji ( p/ t = 30,5 bar/min), medtem ko pri tlaku 300 bar ni bilo vidnega preživetja celic pri obeh vrstah ekspanzije. Ugotovili smo, da so celice kvasovk iz S. cerevisiae v suspenziji bolj odporne na vpliv SC CO 2 kot celice S. cerevisiae nacepljene na trdno gojišče pri enakih pogojih inkubacije. Glede na to, da smo pri suspenziji celic S. cerevisiae in celicah S. cerevisiae, nacepljenih na trdna gojišča, spreminjali tlak in čas inkubacije ter temperaturo pustili konstantno, bi bilo v nadaljevanju dobro preveriti še vpliv temperature na preživelost kvasovk iz S. cerevisiae.

56 Študija vpliva superkritičnega ogljikovega dioksida na preživetje kvasovk iz Saccharomyces cerevisiae 41 6 LITERATURA IN VIRI 1. Spilimbergo S., Manton D., Quaranta A., Della Mea G., Real- time monitoring of cell membrane modification during supercritical CO 2 pasterurization, The Journal of Supercritical Fluids: 2009, 48, Comino A., Struktura in funkcija CDC6 gena v celičnem ciklu kvasovke Saccharomyces cerevisiae, doktorsko delo, Ljubljana: Univerza v Ljubljani, Medicinska fakulteta, Isenschmid A., Marison I.W., Stokar U., The influence of pressure and temperature of compressed CO 2 on the survival of yeast cells, Journal of Biotechnology: 1995, 39, Batič F., Šircelj H., Turk B., Pregled rastlinskega sistema, delovna verzija za interno uporabo, Ljubljana: Univerza v Ljubljani, Biotehnična fakulteta, Oddelek za agronomijo, cetes_ razmnozevanje/ 7. org /slike/sistbot/sistbot_vaje_glive-mahovi-praprotnice_09.jpg&imgrefurl Šabeder S., Encimska sinteza estrov maščobnih kislin v organskih topilih in v superkritičnem ogljikovem dioksidu, doktorska disertacija, Maribor: Univerza v Mariboru, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo, Absec A., Basić I., Biotehnološka proizvodnja medice, seminarska naloga pri predmetu Biotehnologija, Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Živilska tehnologija,

57 42 Študija vpliva superkritičnega ogljikovega dioksida na preživetje kvasovk iz Saccharomyces cerevisiae 13. Hawker E. L., Linton H. A., Growth of Micro-organisms in Artificial Culture, Microorganisms: function, form and environment. London: Edvard Arnold Ltd., 1971, Knez Ž., Škerget M., Tehnologije s fluidi nad kritično točko, Termodifuzijski separacijski procesi, Maribor: Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo, , Stevec S., Topnost in difuzivnost superkritičnega ogljikovega diosida v poliesterskih polimerih, diplomsko delo, Maribor: Univerza v Mariboru, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo, Posel F., Študij prenosa snovi pri ekstrakciji s superkritičnimi fluidi, magistrsko delo, Maribor: Univerza v Mariboru, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo, Habulin M., Primožič M., Biokemijska tehnika, Navodila za laboratorijske vaje, Maribor: Univerza v Mariboru, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo, Hadolin M., Izolacija in koncentriranje aktivnih učinkovin iz bioloških materalov, doktorska disertacija, Maribor: Univerza v Mariboru, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo, Erkemen O., Effects of Carbon Dioxide Pressure on Saccharomyces cerevisiae, Food Science and Technology International: 2002, 8, Back W., Farbatlas und Handbuch der Getränkebiologie. Teil 2: Fruchtsaft- und Limonadenbetriebe, Wasser/Betriebshygiene, Milch und Molkereiprodukte Begleitorganismen der Getränkeindustrie. Nürnberg, 2000, 7, Prpar S., Vpliv razmerja glukoza/fruktoza na potek alkoholne fermentacije s kvasovko Saccharomyces cerevisiae, diplomsko delo, Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Enota medodelčnega študija mikrobiologije,

58 Študija vpliva superkritičnega ogljikovega dioksida na preživetje kvasovk iz Saccharomyces cerevisiae 43 7 PRILOGE 7.1 Priloga A Izmerjene optične gostote suspenzij S. cerevisiae pri 550 nm za hitro ( p/ t = 30,5 bar/min) in počasno ( p/ t = 3,8 bar/min) ekspanzijo pri različnih tlakih in časih inkubacije v SC CO 2. Tabela A. 1: Vrednosti izmerjenih optičnih gostot suspenzij S. cerevisiae pri 550 nm za vse meritve pri hitri ekspanziji ( p/ t = 30,5 bar/min). t (min) p (bar) OD 550,z OD 550,k OD ,8112 1,1980 0, ,8574 1,0351 0, ,8685 1,0847 0, ,8345 0,8864 0, ,8302 1,0325 0, ,8287 0,9953 0, ,8269 0,9832 0, ,8297 1,0239 0, ,7822 1,0497 0, ,8151 1,1785 0, ,8195 1,1168 0, ,4228 0,4655 0, ,4280 0,4580 0,0300

59 44 Študija vpliva superkritičnega ogljikovega dioksida na preživetje kvasovk iz Saccharomyces cerevisiae Tabela A. 2: Vrednosti izmerjenih optičnih gostot suspenzij S. cerevisiae pri 550 nm za vse meritve pri počasni ekspanziji ( p/ t = 3,8 bar/min) t (min) p (bar) OD 550,z OD 550,k OD ,8097 1,1964 0, ,8308 1,1892 0, ,8575 0,9478 0, ,8345 1,0980 0, ,6495 0,8951 0, ,8156 0,8700 0, ,8898 1,0732 0, ,8256 0,9822 0, ,8369 0,8972 0, ,8018 1,0417 0,2399 OD 550,z optična gostota suspenzije S. cerevisiae pri 550 nm pred eksperimentom OD 550,k optična gostota suspenzije S. cerevisiae pri 550 nm po končanem eksperimentu OD razlika optičnih gostot suspenzije S. cerevisiae po in pred eksperimentom

60 Študija vpliva superkritičnega ogljikovega dioksida na preživetje kvasovk iz Saccharomyces cerevisiae Priloga B Število preštetih kolonij S. cerevisiae v 1 ml suspenzije S. cerevisiae inkubirane v SC CO 2, ter izračunani odstotki preživetja celic S. cerevisiae iz števila živih in mrtvih celic. Tabela B. 1: Število zraslih kolonij S. cerevisiae v 1 ml suspenzije S. cerevisiae inkubirane v SC CO 2 ter izračun odstotkov preživelosti celic za vse meritve pri hitri ekspanziji ( p/ t = 30,5 bar/min). t (min) p (bar) število živih celic število mrtvih celic preživetje (%) štetje na ploščah (kolonij/ml) / / / 18 0 / / 10 0 / Tabela B. 2: Število zraslih kolonij S. cerevisiae v 1 ml suspenzije S. cerevisiae inkubirane v SC CO 2 ter izračun odstotkov preživelosti celic S. cerevisiae pri vseh meritvah pri počasni ekspanziji ( p/ t = 3,8 bar/min). t (min) p (bar) število živih celic število mrtvih celic preživetje (%) štetje na ploščah (kolonij/ml) /

61 46 Študija vpliva superkritičnega ogljikovega dioksida na preživetje kvasovk iz Saccharomyces cerevisiae / 13 0 /

62 Študija vpliva superkritičnega ogljikovega dioksida na preživetje kvasovk iz Saccharomyces cerevisiae Priloga C Meritve OD in izračuni koncentracij proteinov v suspenziji S. cerevisiae za hitro ( p/ t = 30,5 bar/min) in počasno ( p/ t = 3,8 bar/min) ekspanzijo pri različnih tlakih in časih inkubacije v SC CO 2 so prikazani v tabelah C. 1 in C. 2. Tabela C. 1: Izmerjeni OD in izračuni koncentracij proteinov v suspenziji S. cerevisiae pri hitri ekspanziji ( p/ t = 30,5 bar/min) in različnih tlakih ter časih inkubacije v SC CO 2. t (min) p (bar) OD 595,z c z OD 595,k c k ,0402 0,0408 0,0624 0, ,0049 0,0049 0,0157 0, ,0190 0,0194 0,0335 0, ,0184 0,0186 0,0345 0, ,0269 0,0273 0,0480 0, ,0508 0,0516 0,0757 0, ,0632 0,0642 0,0654 0, ,0431 0,0437 0,0652 0, ,0031 0,0032 0,0108 0, ,0368 0,0373 0,0470 0, ,0250 0,0253 0,0451 0,0458 Tabela C. 2: Izmerjene OD in izračuni koncentracij proteinov v suspenziji S. cerevisiae pri počasni ekspanziji ( p/ t = 3,8 bar/min) in različnih tlakih ter časih inkubacije v SC CO 2. t (min) p (bar) OD 595,z c z OD 595,k c k ,0254 0,0259 0,0543 0, ,0264 0,0268 0,0479 0, ,0517 0,0526 0,0803 0, ,0352 0,0357 0,0548 0, ,0398 0,0404 0,0574 0, ,0499 0,0506 0,0702 0, ,0872 0,0885 0,1003 0,1018

63 48 Študija vpliva superkritičnega ogljikovega dioksida na preživetje kvasovk iz Saccharomyces cerevisiae 7.4 Priloga D Umeritvena krivulja za makro Bradfordovo metodo. 1 y = 1,0158x R 2 = 0,9898 0,8 0,6 OD595 0,4 0, ,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 c BSA [mg/ ml] Slika D. 1: Umeritvena krivulja za makro Bradfordovo metodo.

64 Študija vpliva superkritičnega ogljikovega dioksida na preživetje kvasovk iz Saccharomyces cerevisiae Priloga E Življenjepis Osebni podatki Ime / Priimek Naslov E-pošta Državljanstvo Maja Ajtnik Št. Janž 25, 2360 Radlje ob Dravi, Slovenija maja.ajtnik@gmail.com slovensko Datum rojstva Spol ženski Delovne izkušnje Obdobje občasna dela preko študentskega servisa opravljanje obvezne študijske prakse na Univerzi v Mariboru na Fakulteti za kemijo in kemijsko tehnologijo