UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA ŽIVILSKA TEHNOLOGIJA

Transcription

1 UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA ŽIVILSKA TEHNOLOGIJA BIOTEHNOLOŠKA PROIZVODNJA PALMINEGA VINA* Marjeta FURMAN, Darko GARJETOVIČ, Peter FRANJGA (študentje tretjega letnika živilske tehnologije) prof. dr. Peter Raspor in asist. dr. Maja Paš (mentorja) Ljubljana, 2003 *Seminarska naloga pri predmetu Biotehnologija

2 Biotehnološka proizvodnja palminega vina, Seminar, BF, Študij živilske tehnologije, POVZETEK Palmino vino je pomembna alkoholna pijača, ki jo pridelujejo v zahodni Afriki. Nekaj ga pridelajo v Nigeriji, Gani in tudi v Sri Lanki in Maleziji. Zbiranje palminega sok ima že svojo tradicijo. Prodajalci palminega vina imajo svojo boginjo. Palmin sok zberejo iz cvetne nožnice še ne odprtih cvetov različnih vrst palm. Zbirajo ga v lončene posode in prelijejo v velike posode kjer poteče tudi fermentacija. Dnevno zberejo približno dva do tri litre soka. Fermentacija palminega vina je vedno mlečno alkoholno kislinska in poteče kmalu potem, ko je sok zbran. Glavni mikroorganizmi, ki pri njej sodelujejo, so mlečno kislinske bakterije (Lactobacillus plantarum, Leuconostoc menseroides, ), kvasovke (Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe ) in ocetno kislinske bakterije. Svež palmin sok je sladka, umazano rjava, brezalkoholna pijača, ki s fermentacijo preide v belo do brezbarvno alkoholno, lahko že malo kisu podobno pijačo. Plamin sok vsebuje 10 do 12 % sladkorja in ima ph okoli 7, ki po fermentaciji pade na ph 4. Palmino»vino«vsebuje največ do 7 % alkohola in po pravilih ni pravo vino. Je zelo slabo obstojno in ga morajo kmalu po izvršeni fermentaciji konzumirati ali konzervirati. Tradicionalna metoda konzerviranja je dodatek posušenega in zdrobljenega lubja drevesa Saccoglottis gabonensis. Palmino vino ima pomembno prehransko vrednost. SUMMARY Palm wine is an important alcoholic beverage which is produced in West Africa. Some of it is produced in Nigeria, some also in Ghana, Sri Lanka and Malaysia. Collecting of palm sap has its own tradition. Producers of palm wine have their own deity. Palm sap is collected by cutting the unexpanded flower spathe. They collect it in a gourd and it is poured over into big containers. Two to three liters of sap per day can be collected. The palm wine fermentation is always a lastic alcohol acetic one. The fermentation begins soon after the sap is collected. The main microorganisms which take part in the fermentation are lactic bacteria (Lactobacillus plantarum, Leuconostoc menseroides, ), yeasts (Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces, ) and acetic bacteria. The fresh palm sap is dark brown, non-alcohol beverage which through fermentation turn to a sweet, clear, colourless and alcohol sap which can get the taste of vinegar. Palm sap contains from 10 to 12 % sugar and it has ph around 7 which after fermentation takes place falls to 4. Palm wine contains top most 7% alcohol and by law it is not a real wine. It deteriorates very quickly and therefore soon after fermentation it has to be consumated or preserved. The traditional method of preserving is by adding pulverized dust of the bark tree (Saccoglottis gabonensis ) to fresh palm wine. Palm wine has a great nutritional value.

3 Biotehnološka proizvodnja palminega vina, Seminar, BF, Študij živilske tehnologije, KAZALO POVZETEK... 2 SUMMARY... 2 KAZALO UVOD PALMINO VINO ZBIRANJE PALMINEGA SOKA CENA IZDELKA ZGODOVINA BIOPROCESA MIKROBIOLOŠKE OSNOVE BIOPROCESA SPLOŠNE ZNAČILNOST KVASOVK, KI SODELUJEJO PRI PROIZVODNJI PALMINEGA VINA SPLOŠNE ZNAČILNOSTI MLEČNO KISLINSKIH BAKTERIJ, KI SODELUJEJO PRI PROIZVODNJI PALMINEGA VINA SPLOŠNE ZNAČILNOSTI OCETNO KISLINSKIH BAKTERIJ, KI SODELUJEJO PRI PROIZVODNJI PALMINEGA VINA BIOKEMIJSKE OSNOVE BIOPROCESA SPLOŠNE BIOKEMIJSKE ZNAČILNOSTI PALMINEGA VINA VPLIV Saccoglottis gabonensis NA PODALJŠANJE OBSTOJNOSTI PALMINEGA VINA Grafični in tabelarični prikazi vpliva S. gabonensis na obstojnost palminega vina Senzorične lastnosti palminega vina obdelanega s S. gabonensis BIONIŽENIRSKE OSNOVE BIOPROCESA PRIPRAVLJALNI POSTOPEK POTEK BIOPROCESA ZAKLJUČNI POSTOPKI EKOLOŠKI ASPEKT BIOPROCESA UPORABA BIOPROIZVODOV V PREHRANI REFERENCE... 23

4 Biotehnološka proizvodnja palminega vina, Seminar, BF, Študij živilske tehnologije, UVOD Znano je, da lahko iz vseh sladkih rastlinskih sokov pridelamo alkoholno pijačo. Ta dobro znan proces pridobivanja alkoholnih pijač se imenuje fermentacija, kjer s pomočjo kvasovk dobimo alkohol in ogljikov dioksid. Veliko alkoholnih pijač je narejenih iz rastlinskih sokov, vključno s sokovi iz kokosovih palm, oljnih palm, palm divjih dateljnov,»nipa«palm, rafija palm,»kithul«palm (Macrae s sod., 1993; Wood in Brain, 1985). 1.1 PALMINO VINO Palmino vino je pomembna alkoholna pijača v zahodni Afriki. Nekaj ga pridelujejo tudi v Sri Lanki in Malaziji. Uporablja ga več kot deset milijonov podeželskih ljudi v južni Nigeriji.. Po strogih enoloških pravilih ni pravo vino, saj vsebuje maksimalno le 7 % alkohola in je slabo obstojen izdelek. Za boljšo obstojnost mu dodajajo posušeno lubje drevesa Saccoglottis gabonensis, kot konzervirno sredstvo. Obstaja v različnih oblikah, od sladke nefermentirane do kisle fermentirane in že kisu podobne pijače. Palmina vina, ki jih pridelujejo v Nigeriji imenujejo»emu«in»ogogoro«, pridelana v Gani pa»nsafufuo«. Pridelujejo ga iz sladkega palminega soka, ki ga dnevno zberejo približno tri litre. Pridobivajo ga iz različnih vrst palm. Najpogosteje iz raphia palm (Raphia hookeri in Raphia vinifera), oljne palme (Elaeis guineense) in kokosove palme (Cocos nucifera). Če pridelamo palmino vino iz kokosove palme, mu rečemo»toddy«. Pri proizvodnji palminega vina ni toplotne obdelave palminega soka, kar pomeni, da je vino odličen substrat za mikrobno rast. Pri sami proizvodnji, moramo paziti, da v čim manjši meri pride do kontaminacije z mikroorganizmi iz okolja, predvsem z bakterijami. V primeru kontaminacije z tujim bakterijami lahko pride do nastanka organskih kislin namesto alkohola. Znano je tudi, da ima palmino vino veliko prehransko vrednost (Wood in Brain, 1985). 1.2 ZBIRANJE PALMINEGA SOKA Sok zbirajo z izcejanjem le-tega iz še ne odprtih cvetov palm. Ponavadi se sok zbira vsaj dan ali dva. Svež palmin je zelo sladek in umazano rjave barve, po fermentaciji pa je brezbarven do belkast. Sama kvaliteta palminega vina je v veliki meri odvisna že od same kvalitete zbranega soka. Pomembno vlogo pri zbiranju soka pa ima tudi sama posoda, ki se med dvema postopkoma zbiranja ne pomiva zaradi prisotnih mikroorganizmov, ki jih posoda vsebuje in pomagajo pri samem začetku fermentacije. Ko je sok zbran v velikih posodah jih prenesejo v posebne zbiralne kolibe, kjer pustijo sok med fermentacijo (Steinkraus, 1996).

5 Biotehnološka proizvodnja palminega vina, Seminar, BF, Študij živilske tehnologije, slika 1: koča, kjer zbirajo palmin sok med fermentacijo ( Postopek zbiranja soka pa narekuje tudi ceno končnega izdelka palminega vina. Noži, buča za zbiranje in steklenice stanejo zelo malo. Veliko stane predvsem delovna sila. Danes je plezanje na vsako drevo posebej in zabijanje kljuk dolgotrajno in ni produktivno. Sistem vrvi, ki poveže drevesa skupaj olajša in poenostavi delo in tako zniža ceno palminega vina. Glavne kontrolne točke pri pridobivanju soka so predvsem odstranitev trdnih delcev iz soka ter primeren prostor za sok, kjer naj bi fermentacija potekla ( 1.3 CENA IZDELKA V Sri Lanki stane steklenica (2,5 L) palminega vina približno 1.00 do 1.50 ameriškega dolarja. Svež toddy je možno dobiti direktno iz drevesa ali pa v pivnici kar iz posode kamor zbirajo palmin sok. V vrhuncu sezone stane 0.25 L palminega vina ameriškega dolarja, medtem ko na festivalih naraste cena 0.25 L na 0.5 dolarja. Malazijski toddy prodajajo v gostilne kjer zbirajo palmina vina (»toddy booths«). Njegovo ceno določa vlada. Pri nezakonitem zbiranju stane liter 0.21 dolarjev in v trgovini v večjih mestih pol litra 0.10 dolarja. Zakonito pa stane pol litra toddy-a 0.16 dolarja, kjer je zajeta še taksa vlade (0.115 dolarja na liter). V Nigeriji je cena palminega vina nizka. Narekuje jo cena drugih konkurenčnih alkoholnih pijač, predvsem piva. Cena ponavadi naraste v sušnih delih leta, predvsem decembra. V Gani se palmino vino ponavadi prodaja v steklenicah po 0.56 litra (»pint«bottles) ali velikih lončenih posodah vrčih. Če ga razvrstijo v velike zabojnike ga ven zajemajo z majhnimi bučkami. Ceno vina predstavlja predvsem trud vložen za pridobivanje palminega soka. Včasih so ženske in otroci vozili prodajat vino v mesto. Danes je motorizacija nujna. Naraščanje cene goriva pa prispeva tudi k ceni izdelka (Steinkraus, 1996).

6 Biotehnološka proizvodnja palminega vina, Seminar, BF, Študij živilske tehnologije, Slika 2: Palmino vino v času sezone pijejo kar iz posode kamor zbirajo palmin sok (

7 Biotehnološka proizvodnja palminega vina, Seminar, BF, Študij živilske tehnologije, ZGODOVINA BIOPROCESA Proizvodnja alkoholnih pijač je poznana odkar obstaja človeška civilizacija. Na kakšen način so ljudje v daljni preteklosti prišli do fermentiranih izdelkov ne moremo trditi z gotovostjo. Morda so fermentacijo odkrili slučajno z opazovanjem, lahko pa so intenzivno eksperimentirali (Blatnik s sod., 2000). Tudi palmino vino že od nekdaj pridelujejo s fermentacijo palminega soka. Ta običaj ima že svojo tradicijo. Ljudje so včasih verjeli, da prodajalce palminega vin lahko varuje njihova»boginja«. Tako je imajo po ustnem izročilu prodajalci palminega vina zaščitnico imenovano»palm Wine Seller«. Prikazana je na sliki številka 3. Kip zaščitnice prodajalcev palminega vina je zelo simetričen. Poudarjena je njena vedrost in ubranost. Z eno roko se oprijema okoli telesa, v drugi pa drži doječega otroka ( Slika 3: Prodajalka palminega vina ( Toddy se je prodajal direktno od kmeta, ki ga je delal do potrošnika vse do leta Potem so ga začeli prodajati v trgovine z palminimi vini, kjer ga danes večina ljudi kupuje. Tako kot večina vrst vin ima tudi palmino vino častitljivo zgodovino, saj je eno izmed najbolj zgodnje pridelanih vin. Prve zbiralke palminega soka so bile ženske (

8 Biotehnološka proizvodnja palminega vina, Seminar, BF, Študij živilske tehnologije, MIKROBIOLOŠKE OSNOVE BIOPROCESA Palmino vino vsebuje mlečno kislinske bakterije, kvasovke in ocetno-kislinske bakterije. Tako vedno poteče mlečno alkoholno ocetna fermantacija. Vendar med različnimi palminimi vini variira število in tip mikroorganizmov od drevesa do drevesa. Druga težava je biokemijska variabilnost palminega soka pričakovano od letine in od vrste palme. Sprejemljiv produkt lahko dobimo z vcepljanjem in oplemenitenjem soka z dodatkom starter kulture kvasovk in mlečno kislinskih bakterij. To je v bistvu predlagano po podeželskih merilih. S tega stališča dejavniki mikrobiološkega značaja podeželskega vina niso značilni, če izvzamemo prehrambeno vrednost. Fermentacija palminega soka se začne takoj ko je sok zbran v posodi. Zanjo odgovorni mikroorganizmi so kvasovke v glavnem Saccharomyces cerevisiae in Schizosaccharomyces pombe in bakterije Lactobacillus plantarum in Leuconostoc mesenteroides (Uzochukwu s sod., 1993). 3.1 SPLOŠNE ZNAČILNOST KVASOVK, KI SODELUJEJO PRI PROIZVODNJI PALMINEGA VINA Poznamo več kot vrst gliv. Od tega 500 vrst priznavamo za kvasovke. Torej kvasovke predstavljajo le majhen del kraljestva gliv. Enostavno definiran termin kvasovke je skoraj nemogoč, saj vemo, da ima veliko ne celičnih oblik kompleksne življenjske cikle. V splošnem pa kvasovke opišemo kot mikroskopsko majhne, enocelične prave glive, od 2 8 µm široke in od µm dolge (večje kot večina bakterij). So močno razširjene v naravi, imajo dobro razvito jedro s kromosomi, obdano z jedrno membrano; so torej evkarionti (Hui, 1991). Kvasne celice so lahko ovalne, okrogle, cilindrične, srpaste, tudi limonaste oblike. Nekateri rodovi kvasovk so lahko tudi manj pravilnih oblik: trikotne, podobne steklenici, na enem polu podaljšane, na polih zožene in nekoliko podaljšane,... Rastejo kot saprofiti ali paraziti. Razmnožujejo se običajno vegetativno z brstenjem oziroma nekatere s cepljenjem. Večina kvasovk se razmnožuje tudi generativno ali spolno in jih tako uvrščamo med askomicete in bazidomicete. V splošnem se s kapsulacijo dveh kvasnih celic oziroma spor začne spolni krog, ki vodi v oblikovanje asko- oziroma bazidio-spor. Kvasovke nimajo fotosintetske sposobnosti in niso mobilne (nimajo lakomotornih organov). V aerobnih razmerah metabolirajo številne sladkorje, medtem ko imajo v anaerobnih razmerah sposobnost fermentecije samo nekatere vrste. Redke izjeme so lahko patogene (Raspor, 1996). Pri fermentaciji vina sodelujejo predvsem kvasovke rodu Saccharomyces za katere poznamo tudi pojem»žlahtne kvasovke«. Mednje sodi vrsta Saccharomyces cerevisiae, ki je tipična predstavnica fermentativnih kvasovk. Zanje je značilno, da pretvorijo večino sladkorja v etanol. Te kvasovke so zimocidne, kar pomeni, da s svojimi toksini ovirajo ostale prisotne kvasovke pri delu in tako prevzamejo vodilno vlogo v bioprocesu (Raspor, 2002). Značilnosti rodu Saccharomyces so, da so celice okrogle, ovalne ali cilindrične oblike in multipolarno brstijo. Tvorijo eno do štiri ali več elipsoidnih askospor z gladko površino. Psevdomicelija ne tvorijo, lahko pa se pojavijo posamezne hife. Fermentirajo glukozo, ne tvorijo ekstracelularnih škrobu podobnih snovi (Jeršek, 2001). Pri fermentaciji palminega vina je iz tega rodu pomembna vrsta Saccharomyces cerevisiae. Njihove značilnosti so, da so sposobne fermentirati nekatere disaharide, pa tudi glukozo.

9 Biotehnološka proizvodnja palminega vina, Seminar, BF, Študij živilske tehnologije, Ne tvorijo pa ekstracelularnih, škrobu podobnih snovi. Razmnožujejo se vegetativno z brstenjem in generativno z askosporami. Zanje je značilno multilateralno oziroma mnogostransko brstenje. Tvorijo eno do štiri askospore z gladko površino, sferoidne oblike. Ne tvorijo psevdomicelija, lahko pa se pojavijo posamezne hife (Barnett s sod., 1983). Prav tako pri fermentaciji palminega vina sodelujejo kvasovke rodu Sachizosaccharomyces iz družine Saccharomycetaceae, katerih vegetativna oblika je cilindrična celica ali pravi micelij, ki pogosto razpade na odseke. Nespolno se razmnožuje z delitvijo, pri čemer nastaja prečna membrana, nasprotno kot pri brstenju. Pri spolnem razmnoževanju se zlivajo haploidne celice. Iz zigote nastane ask z dvema, štirimi ali osmimi askosporami. Vse vrste fermentirajo glukozo, nobena pa galaktoze ali laktoze. Ne asimilirajo nitrata (Likar, 1987). 3.2 SPLOŠNE ZNAČILNOSTI MLEČNO KISLINSKIH BAKTERIJ, KI SODELUJEJO PRI PROIZVODNJI PALMINEGA VINA Mlečno kislinske bakterije so izredno pomembna skupina bakterij. So po Gramu negativne, nepatogene in nesporogene. So anaerobni organizmi, običajno negibljive bakterije, ki pridobivajo energijo s fermentacijo. Za rast potrebujejo veliko rastnih faktorjev. Nekatere mlečno kislinske bakterije ne izkoriščajo laktoze (Lactobacillus belbrickii), ampak pretvorijo glukozo preko piruvata v mlečno kislino. Mlečno kislinske bakterije preživijo in celo rastejo pri nizkih ph vrednostih (do ph 3). Tvorijo mikrofloro mleka, zato so prisotne v mleku in mlečnih izdelkih, ravno tako pa so nekatere vrste prisotne pri fermentaciji palminega vina. Orla Jeuan je leta 1919 podal sistematiko mlečno kislinskih bakterij na osnovi fermentacije sladkorjev, tvorbe plina, morfologije celic, odnosa do kisika in na osnovi optimalne temperature rasti. Njegova sistematika se je obdržala vse dokler moderna biotehnologija in molekularna biologija nista podali predloga, da se naredi naravno elucijsko drevo. Vse mlečno kislinske bakterije razen bifidobakterij (uvrščene so med Actinomycetes) so v elucijskem drevesu uvrščene v Clostridium. Najstarejši del drevesa predstavlja Clostridium, ki je anaeroben. Večina predstavnikov iz drugih rodov (Leuconostoc, Lactobacillus, Lactococcus in Streptococcus) ni striktno anaerobnih in bolj ali manj uspešno rastejo pri nižjih koncentracijah kisika. Med bakterije, ki so glavni proizvajalci mlečne kisline se prištevajo Streptococcus lactis in sorodne vrste ter Lactobacillus. V palminem vinu so bili izolirani laktobacili, ki so palčke, dolge tanke ali krajše kroglaste, posamično ali v verižicah. Dolge so od 6 7 µm (Gaber s sod. 2000). Mlečno kislinske bakterije so pri fermentaciji palminega vina prisotne od začetka do konca. Njihova glavna aktivnost je metabolizem širokega spektra sladkorjev v mlečno kislino. Njihove metabolne zmožnosti pa zajemajo še veliko drugih komponent, vključno z organskimi kislinami in fenolnimi spojinami. Velike večina mlečno kislinskih bakterij izkorišča glukozo preko Embden Meyerhof Parnas poti ter tako pridelajo preko 85% mlečne kisline. Rod Leuconostoc so heterofermentativne, kokoidne bakterije. Zelo so razširjene v naravi, predvsem v rastlinah. Za rast potrebujejo ogljikove hidrate, aminokisline, peptide, nukleinske kisline, maščobne kisline ter vitamine, kot so biotin, nikotin, tiamin,

10 Biotehnološka proizvodnja palminega vina, Seminar, BF, Študij živilske tehnologije, pantotenska kislina Optimalna temperatura rasti je med 20 in 30ºC). So aerotolerantne bakterije (Holt s sod. 1994). Za vrsto tega rodu Leuconostoc mesenteroides je tipična fermentacija izcejenega soka palm. Od ostalih mlečno kislinskih bakterij se razlikuje v tem, da lahko tolerirajo relativno visoke koncentracije soli in sladkorjev (višje od 50%). So obligatno heterofermentativne, Gram pozitivne, negibljive bakterije, ki kljub različnemu temperaturnemu območju relativno hitro rastejo. Proizvajajo ogljikov diokid in kisline (mlečno, ocetno, citronsko), ki znižujejo ph. Ogljikov dioksid, kot produkt fermentacije nadomešča kisik in s tem zagotavlja anaerobno okolje, ki je ugodno za rast ostalih laktobacilov. Poleg tega anaerobnost stabilizira prisotnost askorbinske kisline ( Rod Lactobacillus so homofermentativne in heterofermentativne, gram pozitivne bakterije, ki za svojo rast potrebujejo sladkorje, razgradnje produkte beljakovin, vitamine in nenavadno nizke koncentracije kisika. So palčke, dolge tanke ali krajše kroglaste, ki so lahko posamično ali v verižicah. Glavni produkt fermentacije je mlečna kislina. V splošnem velja, da so predstevniki tega rodu ne patogeni. So pa tudi sestavni del človeške mikroflore (Holt s sod. 1994). Predstavnik laktobacilov, ki sodeluje pri fermentaciji palminega vina je Lactobacillus plantarum (Wood in Brain, 1985). 3.3 SPLOŠNE ZNAČILNOSTI OCETNO KISLINSKIH BAKTERIJ, KI SODELUJEJO PRI PROIZVODNJI PALMINEGA VINA V dobro aeriranih pogojih predelih mase, ocetno kislinske bakterije postenejo dominantne, pretvarjajoč etanol v ocetno kislino. Obe kislini, ocetna in mlečna, se lahko dalje oksidirata do ogljikovega dioksida in vode, z rastjo ph vrednosti. Te eksotermne oksidacije vodijo do dviga temperature v masi. Ocetno kislinske bakterije so po Gramu negativne, od 0,6 0,8 µm dolge, elipsoidne ali paličaste bakterije. Imajo flagele, kar jim omogoča hitro premikanje. So obligatni aerobi, ki proizvajajo pigmente ali celulozo. Zmožne so mutiranja in z lahkoto spremenijo obliko. Najpomembnejša sposobnost ocetno kislinskih bakterij je oksidacija etanola v ocetno kislino. To njihovo lastnost človek uporablja za pridelavo različnih vrst kisa. Tudi palmino vino hitro dobi kiselkast okus na račun fermentacije mlečno kislinskih bakterij (Zaviršek s sod., 2001). Prvi, ki je določil različne vrste ocetno kislinskih bakterij je bil Hansen, leta 1879 (Bacterium aceti, Bacterium pasteurianum in Bacterium kutzingianum). Kasneje so ocetno kislinske bakterije uvrstili v družino Acetobacteriaceae in znotraj družine rodova Acetobacter in Gluconobacter). Le te se med sabo razlikujejo po sposobnosti oksidacije acetata in laktata do ogljikovega dioksida in vode. To sposobnost imajo le vrste rodu Acetobacter, ne pa vrste rodu Gluconobacter. Med obema rodovoma ocetno kislinskih bakterij obstaja tudi značilna razlika v velikosti PCR produktov medgenskih regij; 16S 23S rdnk (število in velikost nukleotidov), kar nam omogoča hitro razlikovanje obeh rodov (Trček, 1999).

11 Biotehnološka proizvodnja palminega vina, Seminar, BF, Študij živilske tehnologije, BIOKEMIJSKE OSNOVE BIOPROCESA 4.1 SPLOŠNE BIOKEMIJSKE ZNAČILNOSTI PALMINEGA VINA Palmino vino je alkoholna pijača pridobljena z fermentacijo palminega soka. Palmin sok je sladek sirup, ki vsebuje od % sladkorja, ki se s pomočjo kvasovk, mlečno kislinskih bakterij in ocetno kislinskih bakterij fermentira in s tem tvori alkohol. Glavna substanca v svežem palminem soku je saharoza. Vsebuje je 12 od 15 % celotne teže. Prisotnih je zelo malo reducirajočih sladkorjev kot so glukoza, fruktoza, maltoza in rafinoza. Ravno tako svež palmin sok vsebuje 0,23 % proteinov, 0,02 % maščob, minerale in askorbinsko kislino (5,7 mg/100ml). Med fermentacijo sladkor hidrolizira do glukoze in fruktoze. Vsebnost reducirajočih sladkorjev, ki so v začetku le v sledovih naraste, ko je saharoza hidrolizirana. V 24 urah je več kot pol vseh sladkorjev fermentiranih, najhitreje se fermentira saharoza. V tem času večina proizvajalcev raje zaključi fermentacijo, ko je ph okoli 5. Ocetna in mlečna kislina nastajata tako kot etanol med fermentacijo. Po 36 do 48 urah koncentracija etanola doseže višek 5.0 do 5.3 % v/v. Koncentracija etanola začne padati kmalu, če palmino vino skladiščimo dlje časa. ph vrednost palminega soka takoj, ko je zbran v posodi je 7.2, po osmih urah pa ph pade na 5.5 do 5.8. Takrat kvasovke S. cerevisiae najmočneje fermentirajo. V času, ko vsebnost alkohola naraste na 5,0 %, lahko ph pade na 4.0 do 4.3. Izoamilni alkohol, aktivni izoamilni alkohol, isobutanol, 1-propanol in etil acetat v šibko fermentiranem palminem soku niso prisotni. Formirajo se v palminem vinu. Določajo jih z plinsko kromatografijo. Največji problem pri proizvodnji palminega vina (predvsem toddya) predstavlja nastanek sekundarnega produkta hidrogen sulfida, ki mu daje karakterističen in nezaželjen vonj. Vsebnost hidrogen sulfida naraste do 150 µmolov na liter toddya. Le-ta nastane s fermentacijo "divjih" kvasovk. Prisotnost amonijevih in določenih kovinskih ionov zavre nastanek hidrogen sulfida, medtem ko nekaj hidrogen sulfida odhlapi tudi z ogljikovim dioksidom. Raziskave kako se izogniti hidrogen sulfidu še niso dovolj napredovale. Ni podatkov o koristnosti nastanka sekundarnih produktov fermentacije. Na njihovo vsebnost v toddyju vpliva raznolikost mikrobne flore. Vsebnost alkohola, določena po destilacijski metodi, niha od 4,8 % v pasteriziranih steklenicah toddya do 10,3 % v svežem toddyu. Vsebnost kisline varira od 0,35 do 0,47 % kot ocetna kislina. V palminem vinu iz rafia palm iz zahodne Afrike vsebuje mlečno (32,1 56,7 mg/100 ml), ocetno (18,6 do 28,6 ml/100 ml) in vinsko (11,7 do 36,0 mg/100 ml) kislino. Po 24 urah fermentacije pride tudi do sinteze jabolčne, piruvične, citronske in nekaterih drugih kislin. Shamala in Sreekantiah poročata, da je bila maksimalna vsebnost etanola najdena v soku palm divjih dateljnov v Indiji 3,4 %. Za proizvodnjo toddya smatrata kot bistvene mlečno kislinske bakterije (Steinkraus, 1996). Kmalu po prevzemu svežega palminega soka pride do poslabšanja organoleptičnih lastnosti, kar je posledica fermentacije sladkorja z bakterijami prisotnimi v samem soku. Visoka vsebnost alkohola in kislin povzroči palmino vino neuporabno. Da bi podaljšali čas uporabnosti, uporabljajo različne metode. Tradicionalna in še zmeraj aktualna metoda je dodajanje posušenega in zdrobljenega lubja drevesa Saccoglottis gabonensis svežemu palminemu vinu. Kako ta»konzervans«vpliva na obstojnost palminega vina so ugotavljali z raznimi poskusi (Ojimelukwe, 2000 in Wood s sod., 1985).

12 Biotehnološka proizvodnja palminega vina, Seminar, BF, Študij živilske tehnologije, VPLIV Saccoglottis gabonensis NA PODALJŠANJE OBSTOJNOSTI PALMINEGA VINA Svežemu palminemu vinu iz Raphia hookeri so bile dodane različne koncentracije S. gabonensis. Koncentracijo alkohola, sladkorjev in nitratov so spremljali štiri dni v kontrolnih vzorcih (brez S. gabonensis) in vzorci s S. gabonensis. Fermentacijski "davek" so določali s spremljanjem produkcije ogljikovega dioksida, ph pa z titracijo. Primerjali so senzorične lastnosti svežega in obdelanega palmineg vina in sicer: svežega palminega vina, štiri dni shranjenega vina na sobni temperaturi (27 29 ºC) in trideset dni skladiščenega pri sobni temperaturi. Tako kontrolni primeri kot postopek s S. gabonensis je privedel do povišanja alkoholne vsebnosti in ogljikovega dioksida ter znižanja vsebnosti sladkorja (saharoze, glukoze ali maltoze) in ph. Pomembna razlika med obdelanimi in kontrolnimi vzorci se pokaže v refraktivnem indeksu. Produkcija ogljikovega dioksida se vsak dan zmanjšuje v obeh primerih (Ojimelukwe, 2000) Grafični in tabelarični prikazi vpliva S. gabonensis na obstojnost palminega vina Graf 1 prikazuje sprostitev CO 2 iz vzorcev palminega vina.v prvih 24 urah fermentacije se sprosti več CO 2 iz vzorcev palminega vina, ki vsebuje S. gabonensis kot iz kontrolnega vzorca. Od prvega dneva dalje pa velja ravno obratno, več CO 2 se sprosti iz kontrolnih vzorcev. Splošno velja, da z daljšanjem fermentacijskega postopka se manjša koncentracija CO 2. Graf 1: Sprostitev ogljikovega dioksida iz palminega vina pri različnih koncentracijah S.gabonensis (Ojimelukwe, 2000)

13 Biotehnološka proizvodnja palminega vina, Seminar, BF, Študij živilske tehnologije, Graf 2 prikazuje vsebnost alkohola v palminem vinu z dodanim S.gabonensis in kontrolih vzorcih vina med štiri dnevnim analiziranjem. Pri obeh je prišlo do dviga vsebnosti alkohola do četrtega dne nato pa do padca. Vsebnost alkohola v vzorcih, ki so vsebovali več kot S. gabonensis je ponavadi višja kot vsebnost alkohola pri vzorcih brez dodatka. Graf 2: Vsebnost alkohola v palminem vinu pri različnih koncentracijah S.gabonensis (Ojimelukew, 2000)

14 Biotehnološka proizvodnja palminega vina, Seminar, BF, Študij živilske tehnologije, Tabela 1 prikazuje rezultate asimilacije sladkorjev med fermentacijo. Padec količine sladkorja je večji v vzorcih, ki vsebujejo S. gabonensis kot pa v kontrolnih vzorcih. Količina saharo-maltoze in saharoze so najnižje v vzorcih z S.gabonensis grama na 100 mililitrov palminega vina. Najhitrejša je bila asimilacija saharoze, nato pa glukoze in maltoze. Tabela 1: Poraba sladkorjev pri fermentaciji vzorcev palminega vina z različnimi koncentracijami S. gabonensis na 100 ml palminega vina (Ojimelukwe, 2000)

15 Biotehnološka proizvodnja palminega vina, Seminar, BF, Študij živilske tehnologije, Tabela 2 prikazuje porabo nitratov med fermentacijo. Poraba nitratov je bila višja v vzorcih z S. gabonensis kot brez prisotnosti le-te. Nitrate potrebujejo fermentirajoči organizmi, predvsem kvasovke. Višja stopnja porabe nitratov pomeni večjo metabolično aktivnost in večjo aktivnost fermentirajočih kvasovk. Tabela 2: Poraba nitratov pri fermentaciji palminega vina z različnimi koncentracijami S.gabonensis (Ojimelukwe, 2000)

16 Biotehnološka proizvodnja palminega vina, Seminar, BF, Študij živilske tehnologije, Graf 3 prikazuje spremembe ph vrednosti pri kontrolnih vzorcih palminega vina in vzorcih z dodanim S. gabonensis med štiri dnevnim analiziranjem. Padec ph pri kontrolnih vzorcih je večji kot pri vzorcih z dodanim S. gabonensis. S povečevanjem koncentracije S.gabinensis je padec ph vedno manjši. Graf 3: Sprememba ph v palminem vinu z različnimi koncentracijami S.gabonensis (Ojimelukve, 2000) Senzorične lastnosti palminega vina obdelanega s S. gabonensis Okus in barva svežega palminega vina sta v prvih 24 urah boljša od vzorcev z dodanim S.gabonensis. Vonj obdelanega in neobdelanega palminega vina je enak. Po 24 urah pa sta okus in vonj boljša pri vzorcih z več kot 0.06 % S.gabonensis. Vzorci z dodanim % S.gabonensis imajo najboljše organoleptične lastnosti. Do četrtega dneva je palmino vino brez dodane S.gabonensis nesprejemljivo na senzornih testih. Medtem ko palmino vino z dodanim več kot 0.06 % S.gabonensis ohrani več kot 60 % začetne arome, 80 % originalega okusa in 60 % splošne sprejemljivosti. V barvi ni nobenih vidnih sprememb. Po 30 dneh skladiščenja pa sta tako obdelano kot neobdelano palmino vino nesprejemljiva. (Ojimelukve, 2000)

17 Biotehnološka proizvodnja palminega vina, Seminar, BF, Študij živilske tehnologije, BIONIŽENIRSKE OSNOVE BIOPROCESA Izbira primernih palm V izbrano cvetno nožnico pritrdijo palico iz španskega trsa po kateri kaplja palmin sok Z močnim lesenim kladivom zabijejo oster vrh bambusovih palic na površino še ne odprtega cveta Razkoljejo vrhnje tkivo (ponovijo dvakrat na dan) Sok začne pritekati po kapljicah Zbirajo ga v lončeno posodo dvakrat dnevno Prodajo v tovarne Prinesejo v svoj zbiralni prostor Filtrirajo in dodajo askorbinsko kislino Dodajo sladkor in vodo (neobvezno po izbiri) Stekleničenje Dvojna pasterizacija pri 60 C 15 minut in pri 80 C 15 minut Hranijo na mrzlem Etiketirajo Poteče fermentacija v nekaj urah (aktivna, učinkovita fermantacija) Filtrirajo Skladiščijo v zabojnikih Prodajo v trgovine, kjer prodajajo palmina vina Specifično težo uravnavajo z hidrometrom Shema št.1: Shema proizvodnje palminega vina (Toddy) (Steinkraus, 1996)

18 Biotehnološka proizvodnja palminega vina, Seminar, BF, Študij živilske tehnologije, PRIPRAVLJALNI POSTOPEK Palmino vino najpogosteje pridobivamo iz že v uvodu omenjenih rafia palm (Raphia hookeri in Raphia vinifera) in oljnih palm (Elaesis guineense) in kokosovih palm, katerih vino se imenuje toddy. V manjiš količinah pa ga pridobivajo tudi iz palm divjih dateljnov (Phoenix sylvestris in Boraaus flabellifer) in»kithul«palm (Caryota urens). Sok lahko pridobivajo iz ozke in podolgovate razpoke na steblu (vejah), vendar so glavni vir pridobivanja palminega soka še ne odprti cvetovi palme. Za sam proces fermentacije uporabljamo sok palm, ki ga dobimo na poseben način, tako da z lesenimi palicami prebodejo še ne odprt cvet palme. Sok izteče po kapljicah iz še neodprtih cvetov palm. Tak način pridobivanja soka je tudi eden izmed najbolj uporabljen in se uporablja predvsem pri kokosovih palmah (Steinkraus, 1996 in Wood s sod., 1985). Slika 4: Cvet palme iz katerega pridobivajo palmin sok (Steinkraus, 1996) S tem, ko naredijo vreznino v neodprt cvet, prerežemo kanale floema, kar omogoča, da iz floema izteka sladek sok, ki vsebuje veliko produktov fotosinteze - ogljikovih hidratov. Torej je sam sok palm zmes ogljikovih hidratov (glukoze, fruktoze, saharoze, manoze...). V različnih državah uporabljajo različne metode priprave palm za izcejanje soka. Za eno izmed metod velja, da palmo najprej podrejo, torej posekajo, in nato naredijo vreze v terminalni meristem, pri drugi metodi pa se je potrebno povzpeti na palmo in začeti postopek zbiranja soka, torej narediti vreze v še ne odprte cvetove palm.

19 Biotehnološka proizvodnja palminega vina, Seminar, BF, Študij živilske tehnologije, V času zbiranja palminega soka je starim palmam oziroma palmam, ki imajo že ostarele liste (veje), le-te potrebno odstraniti. Tako zagotovijo ostalim listom, ki so mlajši zadostno količino svetlobe in s tem polno moč izločanja soka. Sončni žarki so potrebni za popoln potek fotosinteze in s tem večje količine izločenega soka (Steinkraus, 1996). Slika 5: Vrezi vzdolž palminega cveta olajšajo iztek soka (Steinkraus, 1996) Pri samem začetku zbiranja soka mora biti zareza, ki jo naredimo trikotne oblike ter približno 2,5 cm globoka. Tako zarezo obložijo z naravnim materialom in vanjo namestijo kos bambusove palice, ki deluje kot cev, skozi katero izteka palmin sok in se zbira posodi. Po približno 24 od 36 urah palmin sok izteče iz vreznin. Pridelovalci palminega vina zbirajo sok dvakrat na dan, zjutraj in zvečer. V Gani oljne palme najprej posekajo, nato odsekajo stare liste in pustijo le mlajše. Le na najmlajših naredijo usek in vložijo 6 mm plastično ali bambusovo cev. Sok teče v tem primeru na podlagi zemeljske gravitacije. Posod je pokrita, da bi onemogočala sušenje soka oziroma morebitni vpad insektov in trdnih delcev iz okolja v sok. Posoda, ki jo domačini uporabljajo, je lahko lončena, steklena ali pa se uporabljajo polietilenske vreče. Pri samem postopku posode ne operejo pač pa vanjo zbirajo svež palmin sok, ker se v posodi mikroorganizmi, ki so pomembni za začetek fermentacije. Zato pa je potrebno embalažo za polnjene s palminim vinom prej sterilizirati.

20 Biotehnološka proizvodnja palminega vina, Seminar, BF, Študij živilske tehnologije, Dnevno iz palme pridobijo 1,7-3,4 litrov soka iz ene palme. Maksimalna produktivnost pa je aprila in maja, ko začnejo palme cveteti in poganjati novi listi. Tako se poveča tudi anabolizem rastlin. V splošnem pa lahko palme izločajo sok čez celo leto (Steinkraus, 1996). Slika 6: Zbiralec soka, pritrjen na cvet palme (Steinkraus, 1996) POTEK BIOPROCESA Pri procesu pridobivanja vina, sok palm ni termično obdelan, zato je vino dober substrat za rast mikroorganizmov. Zaradi tega je potrebno preprečiti morebitno kontaminacijo vina z mikroorganizmi iz okolja oziroma preprečiti, da bi bakterije prevladovale nad mikroorganizmi potrebnimi za sintezo alkohola namesto kisline. Svež sok je umazano rjave barve, ta barva pa se pri fermentaciji znatno spremeni v mlečno do belo barvo, kar je posledica številčnega razmnoževanja mikroorganizmov pri fermentaciji. Fermentacija pri procesu nastajanja palminega vina se imenuje alkoholno mlečno ocetno kislinska fermentacija, v katero so vključene mlečno kislinske bakterije, kvasovke kot ocetno-kislinske bakterije. Določeno pa je bilo, da palmino vino vsebuje okrog 1200 vrst mikroorganizmov, ki izvirajo iz same palme in iz opreme, ki se uporablja za pridobivanje palminega soka. To so predvsem mikroorganizmi, ki pospešijo proces fermentacije.

21 Biotehnološka proizvodnja palminega vina, Seminar, BF, Študij živilske tehnologije, Najbolj odgovorni mikroorganizmi za sam proces fermentacije, poleg vseh ostalih, sta že v mikrobioloških osnovah omenjeni kvasovki S. cerevisiae in Schizosaccharomyces pambe ter bakteriji Lactobacillus plantarium in Lactobacillus mesenteroides. Pri procesu fermentacije je možno, da bi prišlo do kontaminacije soka z mikroorganizmi iz zraka, vendar sam sok vsebuje veliko količino sladkorjev, kar deluje reduktivno na te mikroorganizme. Alkoholna fermentacija se začne takoj, ko je ves sok zbran v zbirnih posodah. Ponavadi se sok prelije v plastične zabojnike, v katerih se fermentira približno dva dni. Ti pa se prenesejo v posebne za to namenjene prostore (ponavadi lesene kolibe). Po približno 24 urah fermentacije se ph zniža. Če bi fermentacijo nadaljevali več kot dan ali dva, bi začele nastajati organske kisline, predvsem mlečna, ocetna ter vinska kislina. Ker je alkoholno vrenje spontani proces, ni potrebno veliko doprinesti k sami fermentaciji. Glavne kontrolne točke celotne fermentacije so: odstranitev trdnih delcev soka, ne da bi pri tem sok preveč izpostavljali kontaminaciji z mikroorganizmi in zagotoviti primerno mesto za naravno fermentacijo, ki ima konstantno temperaturo okolice, ta pa je določena na podlagi tega, da palme rastejo na tropskih tleh in znaša približno 27 C ± 2 C (Steinkraus, 1996) ZAKLJUČNI POSTOPKI Palmino vino se po koncu fermentacije prefiltrira, da odstranimo morebitne trdne delce, ki so še ostali v vinu oziroma, da odstranimo sediment kvasovk ter stranske produkte, ki nastanejo pri fermentaciji. Vino, ki ga dobimo, je potrebno po fermentaciji takoj konzumirati ali pa vsaj ustekleničiti, ni pa ga potrebno pustiti»ležati«, da bi s tem izboljšali okus vina. Vino postaja po 24 urah vse manj prijetno na okus, ker nastaja veliko količine kislin in ponavadi se tako vino destilira. Po 48 urah pa je čisto nesprejemljivo kot vino in ga je potrebno destilirati. Palmino vino ima prijeten sladek okus, vendar tudi malo kiselkast, kar je včasih zaželjeno. Ob žveplanju sicer res dosežemo efekt, vendar okus palminega vina drastično spremenimo, zato žveplanje ni zaželeno. Ker je palmino vino slabo obstojno, ga je treba kmalu po fermentaciji konzervirati. Z marsikakšno metodo so poizkušali podaljšati rok uporabnosti palminega vina, kot na primer dodatek konzervansov za zaustavitev mikrobnega delovanja, pasterizacijo ter oboje kombiniramo, vendar nobena od teh metod ni bila uspešna. Navsezadnje so odkrili metodo, ki je še danes splošno veljavna: vino najprej centrifugirajo, uravnajo ph, gazirano ustekleničijo in šele nato pasterizirajo. Tako vino je nato stabilno vsaj 9 mesecev (Steinkraus, 1996). Kot tradicionalna metoda za podaljšanje obstojnosti palminega vina je uveljavljena tudi metoda opisana v biokemijskih metodah - dodajanje v prah zmletega lubja drevesa Saccogolottis gabonensis. Lubje dodajo svežemu palminemu vinu in ima podoben učinek kot konzervans. (Ojimelukwe, 2001) Obstaja še ena tehnika, s katero pa ne podaljšajo obstojnost vina, pač pa nefermentiran sok skoncentrirajo (vemo, da palmin sok vsebuje veliko količino sladkorjev, od %) in dobimo sirup, ki ga lahko kar takoj konzumirajo ali pa fermentirajo čez nekaj časa. Najuporabnejša posoda za shranjevanje palminega vina so glinasti lonci ali steklenice (Steinkraus, 1996).

22 Biotehnološka proizvodnja palminega vina, Seminar, BF, Študij živilske tehnologije, EKOLOŠKI ASPEKT BIOPROCESA Kot ekološko aspekt bi lahko bil problematičen način pridobivanja palminega soka z podiranjem palm. Če gojijo palme posebej za pridobivanje palminega soka je to načrtovano in ni problematično. Če pa palme naključno izberejo in jih posekajo, bi morali tako proizvodnjo palminega vina vsaj omejit. Drugih informacij o vplivu proizvodnje palminega vina in na okolje viri ne navajajo. 7. UPORABA BIOPROIZVODOV V PREHRANI Vsak od 4 milijonov ljudi v južni Nigeriji popije dnevno okoli 500 ml palminega vina. Liter pitnega palminega vina pridobljenega iz oljne palme vsebuje 300 kalorij od sladkorjev in proteinov. Vsebnost proteinskega dušika variira od 0.03 do 0.07 %. Celotnega dušika vsebuje okoli 0.12 %. Van Pee in Swings (1971) sta eksperimentirala, kako se spreminja koncentracija 26 amino kislin v fermentiranem palminem soku v 12 urnih intervalih 72 ur. Največ amino kislin je bilo prisotnih skozi cel eksperiment. Treonin, ornitin in histamin so izginile po 14 urah, medtem ko je bila β-alanin popolnoma odsotna. Cistein, histidin, lizin in arginin so bile odsotne v svežem palminem soku toda so se pokazale po 12 urah fermentacije (Steinkraus, 1996). Palmino vino ima pomembno prehrambeno vrednost tudi zaradi naslednjih 18 komponent, so jih identificirali v palminem soku. Najpomembnejše so: dva alkohola (2-metilpropanol in 3-metilbutanol), šest estrov (etil acetat, etil propanoat, propil acetat, etil izobutirat, etil butirat in etil 3-metilbutanonat). Manj pomembne komponente, ki so bile identificirane v palminem soku so: 2-hepton, naftelen in dva neznana (Uzochukwu s sod., 1994). Alkaloidi in fenolne spojine, ki so ekstrahirani iz palminega vina imajo antimikrobni učinek sodelujejo pri mlečno kislinski fermentaciji. Pomembno prehrambeno vrednost palminega vina poudarja tudi naraščajoča vsebnost tiamina, riboflavina in piridoksina. Prav tako so ugotovili, da se med fermantacijo poveča vsebnost vitamina B 12 (Brain, 1985). Kompleks vitamina B je najpomembnejše hranilo v palminem vinu. V Gani je tudi najcenejši vir vitamina B palmino vino. V prvih 4 do 5 dnevih narašča koncentracija vitamina B. Po 24 urah fermentacijeso bili v palminem vinu oljne in rafija palme najdeni naslednji vitamini: tiamin (8 25 µmg / L), riboflavin (8 50 µg / L), piridoksin (4-30µg / L), askorbinska kislina ( mg / 100 ml). Vsebnost vitamina B 12 naraste v tem času (24 urah) od 190 do 500 ng / L. V toddyju so odkrili naslednje vitamine in minerale: tiamin (23.9µg / 100ml), riboflavin (10.8 µg / 100ml), nikotinska kislina (396µg / 100ml), kalcija 481 µg / 100ml) in ionizirano železo (266 µg / 100ml) (Steinkraus, 1996). Družina kvasovk Saccharomyces cerevisiae, ki so prisotne v palminem vinu tudi določa njegovo prehrambeno vrednost. V njihovih celicah je zmes proteinov in prostih amino kislin pa tudi nekaj tiamina. Prehrambeno vrednost izboljša dodatek N-metil-N'-nitro-Nnitrozo gvanidin (MNNG). Novo izolirana vrsta Saccharomyces cerevisiae vsebuje 47 % proteinov, 1,8 % prostih aminokislin in 0,4 % tiamina in riboflavina na suho snov. Palmino vino vsebuje nekaj esencialnih amino kislin. Visoka vsebnost proteinov pa se lahko primerja s sojinimi izdelki. Vzorcu palminega vina so dodali MNNG za 210 minut in odvzeli 20 slučajnih kolonij. Spremembe v vsebnosti proteinov ni bilo opaziti. Narasla pa je vsebnost sladkorjev za 0.02 gramov na liter in vsebnost tiamina se je trikrat povečala. Ravno zaradi vsebnosti kvasovk S. cerevisiae in njihovih značilnosti je palmino vino odličen dodatek k hrani in lahko delno nadomesti sojine izdelke v hrani (Uma, 1990). Palmin sok lahko prekuhajo tudi v palmin sladkor, ki ga nekatere družine uporabljajo za pripravo peciva (

23 Biotehnološka proizvodnja palminega vina, Seminar, BF, Študij živilske tehnologije, REFERENCE - Adamlje. U., Artank. N., Baša. K., Bratina. B Proizvodnja etanola. Ljubljana, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo: 6 str. - Barnett. J. A., Pyne. R. W., Yarrow. D Yeast Charachteristic and Identification. Chambridge, University Press: 368 str. - Blatnik E., Boem T., Brumen B., Bužinel M Proizvodnja alkoholov, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo: 6 str. - Ezeogu. L. I., Okolo. B. N Sedimentation characteristics and effect of molasses concentration and medium supplementation on the ethanol productivity of an ethanol tolerant palm wine Saccharomyces. Biotehnology Letters. 16, 1: ref. in 16, 1: ref. - Gaber. M., Golob. Ž., Firm. A., Horvat. J Aerobna produkcija mlečne kisline. Ljubljana, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo: 8 str. - Hui. J. H Enciklopedia of food science and tehnology. Aurely Interscience Publication: 3 str. - Jeršek. B Navodila in delovni zvezek za vaje iz živilske mikrobiologije. Ljubljana, Biotehniška fakulteta: 27 str. - Likar. M Mikrobiologija. Ljubljana, Cankarjeva založba: Macrae R., Robinson. R. K., Sadler. M. J Encyclopedia of food science food technology and nutrition. London, Academic Press: 4603 str. - Ojimelukwe. P. C Effect of preservation with Saccoglottis gabonnensis on the biochemistry and sensory attributes of fermenting palm wine. Jourrnal of food biochemistry. 25, 5: Raspor. P Kvasovke. V: Biotehnologija. Raspor. P. (ur.). Ljubljana, Bia d.o.o.: 3 str. - Raspor. P Pomen mikrobiologije in biotehnologije v proizvodnji vina. Ljubljana, Biotehniška fakulteta: 2 str. - Steinkraus. H. K Handbook of indigenous fermented foods. New York, Cornell University: Trček. J Molecular identification of the acetic acid bacreria isolated from vinegar an plasmid vector construction for Acetobacter spp. Doktorska dizertacija. Ljubljana, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo: 32 str. - Uma. V., Polasa. H Nutritional value of the newly isolated Saccharomyces cerevisiae of palm wine. India, Osmania university: Uzochukwu. S. V. A., Balogh. E., Loefler. R. T., Ngoddy. P. O Structural analysis by C nuclear magnetic resonance spectroscopy of glucan extracted from natural palm wine. Department of Food Science and Tehnology. 76: Uzochukwu. S. V. A., Balogh. E., Tucknot. O. G., Lewis. M. J., Ngoddy, P. O Volatile constituents of palm wine and palm sap. Journal of the Science of Food and Agriculture, 64, 4: Uzochukwu. S. V. A., Ngoddy. P. O., Balogh. E The role of microbial gums in the color and consistency of palm wine. Journal of food quality. 17: Wijesuning. D. G. N. G., Samarajeewa. U Screeing yeasts from coconut inflorescence sap for continuous alcoholic fermentation. Food Microbiology. 5, 3: Wood., Brain. J. B Microbiology of fermented foods. Scotland, University of Strathclye, UK: Zaviršek J., Zidar K., Zubin V., Zupančič V Proizvodnja ocetne kisline. Ljubljana, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo: 7 str.

24 Biotehnološka proizvodnja palminega vina, Seminar, BF, Študij živilske tehnologije, http// - http//