LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS KLINIKINĖS FARMACIJOS KATEDRA MILDA STANKEVIČIŪTĖ

Transcription

1 LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS KLINIKINĖS FARMACIJOS KATEDRA MILDA STANKEVIČIŪTĖ ŽALIOSIOS ARBATOS (CAMELLIA SINENSIS L.) IR RAUDONOSIOS ARBATOS (ASPALATHUS LINEARIS (BURM.F)) LAPŲ EKSTRAKTŲ KOKYBĖS TYRIMAS Magistro baigiamasis darbas Darbo vadovas Prof. dr. Kristina Ramanauskienė KAUNAS, 2015

2 2 LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS KLINIKINĖS FARMACIJOS KATEDRA TVIRTINU: Farmacijos fakulteto dekanas Vitalis Briedis Data ŽALIOSIOS ARBATOS (CAMELLIA SINENSIS L.) IR RAUDONOSIOS ARBATOS (ASPALATHUS LINEARIS (BURM.F.) LAPŲ EKSTRAKTŲ KOKYBĖS TYRIMAS Magistro baigiamasis darbas Darbo vadovė Prof. dr. Kristina Ramanauskienė Data Recenzentas Data Darbą atliko Magistrantė Milda Stankevičiūtė Data KAUNAS, 2015

3 3 TURINYS TURINYS... 3 SANTRAUKA... 5 SUMMARY... 7 SANTRUMPOS... 9 ĮVADAS LITERATŪROS APŽVALGA Žalioji arbata (Camellia sinensis L.), kilmė, paplitimas, rūšys Raudonoji arbata (Aspalathus linearis (Burm. F.)), kilmė, paplitimas, rūšys Žaliosios arbatos žaliavos (Camellia sinensis L.) cheminė sudėtis Raudonosios arbatos (Aspalathus linearis (Burm. F.)) cheminė sudėtis Fenolinių junginių apžvalga Žaliosios arbatos (Camellia sinensis L.) ir raudonosios arbatos (Aspalathus linearis (Burm. F.)) antimikrobinis aktyvumas Laisvieji radikalai ir antioksidantai, antioksidacinio poveikio įvertinimas Žaliosios ir raudonosios arbatos antioksidacinio aktyvumo tyrimai Žaliosios arbatos (Camellia sinensis L.) ir raudonosios arbatos (Aspalathus linearis (Burm. F.)) farmakologinės savybės Žaliosios arbatos (Camellia sinensis L.) augalinės žaliavos nepageidaujamas poveikis Vaistažolių arbatos gamybos metodai Pagrindiniai veiksniai, darantys įtaką ekstrahavimo procesui arbatos gamybos technologijoje TYRIMO METODIKA Medžiagos ir tirpikliai Analitiniai metodai... 33

4 Žaliosios arbatos (Camellia sinensis L.) ir raudonosios arbatos (Aspalathus linearis (Burm. F.)) vandeninių ekstraktų gamyba Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas spektrofotometrinio metodo pagalba Bendro antioksidacinio aktyvumo nustatymas naudojant DPPH* radikalą Antimikrobinio aktyvumo nustatymas in vitro Statistinė duomenų analizė TYRIMŲ REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS Žaliosios arbatos (Camellia sinensis L.) ir raudonosios arbatos (Aspalathus linearis (Burm. F.)) buitiniu metodu pagamintų augalinių žaliavų skystųjų ekstraktų spektrofotometrinio tyrimo rezultatai Žaliosios arbatos (Camellia sinensis L.) ir raudonosios arbatos (Aspalathus linearis (Burm. F.)) užpilų ir nuovirų vertinimas Taikytų buitinio ir standartinių metodų tyrimų rezultatų aptarimas įvertinant fenolinių junginių kiekį Žaliosios arbatos (Camellia sinensis L.) ir raudonosios arbatos (Aspalathus linearis (Burm. F.)) ekstraktų antiradikalinio aktyvumo nustatymo rezultatai Taikytų metodų, buitinio, užpilo ir nuoviro, tyrimų rezultatų aptarimas įvertinant antioksidacinį aktyvumą Antimikrobinio aktyvumo nustatymo rezultatai buitiniu metodu paruoštose vandeniniuose ekstraktuose IŠVADOS LITERATŪROS ŠALTINIAI PRIEDAI MAGISTRINIO DARBO REZULTATŲ MOKSLINĖ SKLAIDA... 59

5 5 SANTRAUKA M. Stankevičiūtės magistro baigiamasis darbas Žaliosios arbatos (Camellia sinensis L.) ir raudonosios arbatos (Aspalathus linearis (Burm. F.)) lapų ekstraktų kokybės tyrimas / mokslinė vadovė prof. dr. K. Ramanauskienė; Lietuvos Sveikatos Mokslų Universiteto, Farmacijos fakulteto Klinikinės farmacijos katedra. Kaunas. Darbo tikslas. Žaliosios arbatos (Camellia sinensis L.) ir raudonosios arbatos (Aspalathus linearis (Burm. F.)) augalinių žaliavų vandeninių ekstraktų kokybės tyrimas, įvertinant antioksidacines ir antimikrobines savybes. Uždaviniai. 1. Buitiniu metodu pagaminti tiriamųjų žaliavų vandeninius ekstraktus, nustatyti technologinių veiksnių daromą įtaką ekstraktų kokybei. 2. Pagaminti augalinių žaliavų užpilus ir nuovirus bei įvertinti jų kokybę. 3. Palyginti ekstraktų kokybės rezultatus pagal bedrą fenolinių junginių kiekį ir antioksidacinį aktyvumą bei įvertinti žaliavos daromą įtaką ekstraktų kokybei. 4. Ištirti ir nustatyti tiriamųjų vandeninių ekstraktų antibakterinį aktyvumą in vitro. Darbo metodai. Vandeniniai ekstraktai gaminti buitinėmis paruošimo sąlygomis, užpilo ir nuoviro gamybos metodu. Nustatytas bendras fenolinių junginių kiekis ir antioksidacinis aktyvumas. Ekstraktų antibakterinis aktyvumas vertintas pagal Ph.Eur. 01/2002, Tyrimo objektas. Skirtingų fermentacijų žaliosios arbatos bei raudonosios arbatos žaliavų vandeniniai ekstraktai. Ekstraktų gamybai naudotos žaliavos pateiktos 1 priede. Tyrimo rezultatai. Buitiniu metodu pagamintuose ekstraktuose nustatytas didesnis bendras fenolinių junginių kiekis lyginant su nuovirais ir užpilais. Nustatytas antioksidacinis aktyvumas pagal augalinę žaliavą: rudoji (N4)> baltoji (N3)> žalioji (N1)> žalioji (N2)> raudonoji (N5). Ekstraktai pasižymėjo antibakteriniu veikimu prieš S. aureus ir B. cereus bakterijų kultūras. Išvados. Buitiniu metodu pagamintuose vandeniniuose ekstraktuose aukščiausia kokybė pasiekiama, jei atsižvelgiama į technologinius veiksnius, nes aukštesnės temperatūros ir ilgesnės ekstrahavimo trukmės parinkimas, turi lemiamą įtaką fenolinių junginių kiekio išsiskyrimui. Rekomendacijos. Siekiant detalesnio ekstraktų sudėties ištyrimo, tikslinga atlikti fenolinių junginių identifikavimą efektyviosios skysčių chromatografijos metodu su pokolonėline DPPH reakcijos detekcija.

6 6 Raktiniai žodžiai: Camellia sinensis, Aspalathus linearis, žalioji arbata, antioksidacinis aktyvumas, vandeniniai ekstraktai.

7 7 SUMMARY The topic of the master thesis by Milda Stankevičiūtė is Investigation of the quality of extracts of green tea (Camellia sinensis L.) and red tea (Aspalathus linearis (Burm.F) leaves. The supervisor is prof. dr. K. Ramanauskienė, Lithuanian University of Health Sciences, Academy of Medicine, Faculty of Pharmacy, Department of Clinical Pharmacy. Kaunas. The study objective. To analyze the qualitative parameters of aqueous Camellia sinensis L. and Aspalathus linearis (Burm. F.) leafs extracts and to focus on exploring anti-microbial activity. The object of the research. Aqueous extracts of Camellia sinensis L. teas with different fermentation: green tea, white tea, brown tea, - and of Aspalathus linearis (Burm. F.) tea (red tea). Methods. Teas were prepared using guidelines provided by manufacturer, infusion and decoction methods. 2. During the study the total phenolic content and antioxidant activity was analyzed. Antibacterial activity of these extracts was tested according to the recommendations of Ph.Eur. 01/2002, Results. The higher amount of phenolics compounds was determined in usual tea preparation comparing to decoction or infusion. The antioxidant activity was determined in objects by Camellia sinensis L. and Aspalathus linearis (Burm. F.) raw material: brown tea (N4)> white tea (N3)> green tea (N1)> green tea (N2)> red tea (N5). Conclusion. The results demonstrate that aqueous extracts, prepared in usual tea preparation method, have significantly higher qualitative parameters when temperature is higher and extraction time is longer. Studies have shown that time and temperature directly affects the amount of phenolic compounds of discharge. Recommendations. The obtained results show a great potential for further exploration of C.sinensis L. and A. linearis (Burm. F.) extracts. It is recommended to assess the detailed composition of extracts to identifying the phenolic compounds by postcolumn high performance liquid chromatography (HPLC) DPPH method. extract. Key words. Camellia sinensis, Aspalathus linearis, green tea, antioxidative activity, aqueous

8 8 PADĖKA Nuoširdžiai dėkoju baigiamojo magistrinio darbo vadovei prof. dr. Kristinai Ramanauskienei už konsultacijas ir įkvėpimą bei padrąsinimus siekti užsibrėžtų tikslų. Dėkoju visam LSMU MA Klinikinės farmacijos katedros kolektyvui už visapusišką pagalbą ir materialinę bazę. Dėkoju už nuoširdžią pagalbą ir bendradarbiavimą doc. dr. Aidui Grigoniui ir Linai Babickaitei, kurie padėjo atlikti antibakterinius tyrimus.

9 9 SANTRUMPOS A. linearis Aspalathus linearis; AŽ augalinė žaliava; B. cereus Bacillus cereus; C. sinensis Camellia sinensis; DPPH - 2, 2 difenil 1 pikrilhidrazilo (DPPH) laisvasis radikalas; E. coli Escherichia coli; E. faecalis Enterococcus faecalis; EMA Europos vaistų agentūra; Gram (-) Gram neigiama; Gram (+) Gram teigiama; GRE galo rūgšties ekvivalentas; LR laisvieji radikalai; P. aeruginosa Pseudomonas aeruginosa; Pav. paveikslas; Proc. procentai; Ph. Eur. Europos farmakopėja; S. aureus Staphylococcus aureus; S.enteritidis Salmonella enterica enteritidis; UVB ultravioletiniai B spinduliai ( nm).

10 10 ĮVADAS Įvairūs organizmą žalojantys veiksniai (stresas, infekcinės ligos ir kt.) gali sutrikdyti organizmo natūralią pusiausvyrą, o todėl dažnai atsigręžiama į gamtos dovanas, o viena iš jų žaliosios arbatos (Camellia sinensis L.) ir raudonosios arbatos (Aspalathus linearis (Burm. F.)) augalinės žaliavos. Žalioji arbata yra vienas iš populiariausių ir seniausių gėrimų pasaulyje, vertinamų ne tik dėl juslinių, bet ir jos gydomųjų savybių [1]. Abi augalinės žaliavos (AŽ) garsėja farmakologinio poveikio ivairove ir dėl kaupiamųjų biologiškai aktyvių medžiagų pasižyminčių stipriomis antioksidacinėmis savybėmis [1, 7, 10], turi priešuždegiminį [3, 4, 13], antimikrobinį [5, 6, 7, 10, 21], priešnavikinį [3, 4, 7, 27] poveikius, slopina lėtinių ligų vystymąsi [3, 4, 13, 15, 29, 30], riebalų peroksidaciją [4, 30] bei senėjimą [3, 4, 37],- todėl mokslininkai siekia, kuo nuodugniau ištirti šias augalines žaliavas ir efektyviau bei plačiau pritaikyti sveikatai gerinti [8]. Planuojama ištirti žaliosios ir raudonosios arbatos vandeninių ekstraktų kokybinį tyrimą, nustatant fenolinių junginių kiekį, antiradikalinį ir antimikrobinį aktyvumą. Atlikus eksperimentinius tyrimus įvertinti ir aptarti gautus rezultatus teoriniu bei praktiniu požiūriu. Tyrimo objektas skirtingų fermentacijų (žalioji, baltoji, rudoji) žaliosios arbatos (Camellia sinensis L.) žaliavų bei raudonosios arbatos (Aspalathus linearis (Burm. F.)) žaliavos vandeniniai ekstraktai. Ekstraktų gamybai naudotos žaliavos pateiktos 1-5 prieduose. a) China Gunpowder (Camellia sinensis L.); b) Japan Bancha (Camellia sinensis L.); c) Pai Mu Tan (Camellia sinensis L.); d) Jade Oolong (Camellia sinensis L.); e) Rooibos Original (Aspalathus linearis (Burm. F.)). Problema. Trūksta duomenų apie Camellia sinensis L. ir Aspalathus linearis (Burm. F) vandeninių ekstraktų antioksidacinį ir antimikrobinį aktyvumą. Lietuvoje nėra minėtųjų tyrimų su Aspalathus linearis (Burm. F) augaline žaliava. Darbo naujumas. Pirmą kartą tirta skirtingų fermentacijų Camellia sinensis L. (žaliosios, baltosios ir rudosios arbatos) ir Aspalathus linearis (Burm. F., raudonosios arbatos) augalinių žaliavų kokybė, nustatant fenolinių junginių kiekius ir antiradikalinį aktyvumą. Ištirtas tiriamjųjų objektų antibakterinis aktyvumas.

11 11 Rekomendacijos. Camellia sinensis L. ir Aspalathus linearis (Burm. F.) yra vieni iš perspektyviausių, lengvai prieinamų augalinių žaliavų, kurių istorinis vartojimas pagrindžiamas šiuolaikiniais tyrimais, todėl derėtų tęsti tyrimus in vitro, kurie koreliuotų su tyrimais in vivo. Siekiant detalesnio kokybinio ištyrimo būtų tikslinga atlikti kokybinį fenolinių junginių identifikavimą efektyviosios skysčių chromatografijos metodu su pokolonėline DPPH reakcijos detekcija. Vienos analizės metu būtų galima identifikuoti junginius ir nustatyti, kuris junginys ir kokio stiprumo antioksidacinį aktyvumą sąlygoja. Darbo metodai. 1. Žaliosios arbatos (Camellia sinensis L.) ir raudonosios arbatos (Aspalathus linearis (Burm. F.)) buitinio ekstraktų paruošimo sąlygomis, užpilo ir nuoviro vandeninių ekstraktų gamyba. 2. Ekstraktuose bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu, atliekant reakciją su Folin Ciocalteu reagentu. 3. Ekstraktų antioksidacinio aktyvumo nustatymas naudojant 2, 2 difenil 1 pikrilhidrazilo (DPPH) laisvojo radikalo surišimo metodą. 4. Antibakterinio aktyvumo įvertinimas pagal Ph.Eur. 01/2002, Tikslas - žaliosios arbatos (Camellia sinensis L.) ir raudonosios arbatos (Aspalathus linearis (Burm. F.)) augalinių žaliavų vandeninių ekstraktų kokybės tyrimas, įvertinant antioksidacines ir antimikrobines savybes. Tyrimo uždaviniai. 1. Buitiniu metodu pagaminti tiriamųjų žaliavų vandeninius ekstraktus, nustatyti technologinių veiksnių daromą įtaką ekstraktų kokybei. 2. Pagaminti augalinių žaliavų užpilus ir nuovirus bei įvertinti jų kokybę. 3. Palyginti ekstraktų kokybės rezultatus pagal bedrą fenolinių junginių kiekį ir antioksidacinį aktyvumą bei įvertinti žaliavos daromą įtaką ekstraktų kokybei. 4. Ištirti ir nustatyti tiriamųjų vandeninių ekstraktų antibakterinį aktyvumą in vitro.

12 12 1. LITERATŪROS APŽVALGA 1.1. Žalioji arbata (Camellia sinensis L.), kilmė, paplitimas, rūšys Arbata yra viena iš populiariausių gėrimų visame pasaulyje, nes pasižymi patraukliu aromatu, skoniu ir turi teigiamą poveikį organizmui [1]. Ji susideda iš vienos ar daugiau augalinių medžiagų, vartojama į vidų vandeninių ištraukų forma, paruošiama nuoviro, infuzijos arba maceravimo gamybos būdu [2, 4]. Jos paruošimo technika priklauso nuo tradicijų ir medicininių tikslų. Arbatos paruoša galima įvairiais būdais skirtingose pasaulio šalyse: užplikoma su vandeniu, rekomenduotinu skirtingomis temperatūromis, patiekiama su pieno (Jungtinė Karalystė, Airija, Kanada, Indija), citrinos sulčių, medaus ar cukraus (Rytų Europa ) priedais [3]. Žalioji arbata yra dažniausiai naudojama Azijoje, ypač Japonijoje ir Kinijoje, o apie 1610 ji buvo pristatyta kaip gėrimas ir Europai dėka Olandų Rytų Indijos Kompanijos. Pirmiausiai pradėta vartoti valdant Kinijos imperatorių Song ų dinastijai ( ) susmulkinus žaliosios arbatos lapelius į miltelius, vadintus "purvo arbata". Tokios paruošos arbata vis dar plačiai vartojama Japonijoje, kuri imta vartoti vienuolių, Zen budistų XI amžiuje. Jie taip pat sukūrė žaliosios arbatos miltelių perdirbimo ir rengimo metodiką "Matcha", japonų kalboje "Ma" reiškia milteliai, ir "cha" - arbata. Pagal vienuolių paruošos rekomendacijas viena porcija turi atitikti 2-3 g. augalinės žaliavos miltelių, kurie išgeriami karštos vandeninės suspensijos forma [2]. Arbata ruošiama iš kininio arbatmedžio (Camellia sinensis L.) perdirbtų ir išdžiovintų lapų bei pumpurų. Pagrindinės arbatos rūšys mažalapis kininis arbatmedis (Camellia sinensis, rūšis - sinensis) ir didžialapis kininis arbatmedis (Camellia sinensis rūšis assamica) [1]. Arbatos augalai yra plačiai auginami Pietryčių Azijoje (Kiniją, Indija, Japonija, Taivanas, Šri Lanka ir Indonezija) ir Centrinėje Afrikos šalyse [5]. Kadangi fermentacijos procesas turi įtakos arbatos sudėčiai, ji skirstoma į tris pagrindines grupes pagal gamybos procesus: nefermentuota arbata (išvengiama oksidacija inaktyvuojant polifenolio oksidazes, todėl gaminama džiovinant ir garinant šviežius lapelius). Šiam tipui priklauso žalioji ir baltoji arbatos;

13 13 dalinai fermentuota arbata (atliekama dalinė fermentacija prieš džiovinimą šviežiams lapams). Šiam tipui priklauso Oolong (Camellia sinensis L.) ir raudonoji arbatos Rooibos (Aspalathus linearis (Burm. F.)); fermentuota arbata (po derliaus nuėmimo dar prieš džiovinimą ir garinimą atliekama fermentacija). Šiam tipui priklauso juodoji arbata. Juodosios arbatos fermentacija vyksta dėl oksidacijos, kurią katalizuoja polifenolio oksidazės [1,6 ]. Apdorojimo įvairovės skirtumai gamybos procese pateikti 6 pav. 6 pav. Gamybos procesai lemiantys Camellia sinensis L. grupes ir raudonosios arbatos (Aspalathus linearis (Burm. F.)) apdorojimo metodika

14 14 Apibendrinant mokslinės literatūros duomenis galima išskirti gamybos proceso etapus, kurie daro įtaką fermentacijai, o nuo to priklauso arbatos rūšis [3, 5, 6, 7] Raudonoji arbata (Aspalathus linearis (Burm. F.)), kilmė, paplitimas, rūšys Raudonoji arbata, dažniausiai vadinama rooibos pavadinimu, gaminama iš Aspalathus linearis (Burm. F.) krūmo lapelių ir stiebų [40]. Raudonoji arbata Aspalathus linearis (taip pat A. contaminate, A. corymbosus, Borbonia pinifolia ar Psoralea linearis) priklauso pupinių šeimai (Fabaceae), o gimtasis regionas Cedarberg kalnai Pietų Afrikoje. Po derliaus nuėmimo adatėlių formos lapeliai ir stiebeliai gali būti sutrinami ir prieš džiovinimą atliekama fermentacija arba džiovinama iš karto, be fermentacijos. Neatlikus fermentacijos produktas lieka žalios spalvos ir vadinamas žaliąja Rooibos. Fermentacijos proceso metu, dėl polifenolių oksidacijos, AŽ žalia spalva pasikeičia į raudoną [41]. Raudonoji arbata laikoma antioksidantų šaltiniu ne tik dėl kaupiamų flavonoidų, bet ir dėl dihidrochalkonų aspalatino, notofagino bei neseniai nustatyto aspalalinino [40, 41]. Viena iš pagrindinių flavanoidų grupių, aptinkamų ir Aspalathus linearis (Burm. F). džiovintuose, adatėlių formos lapeliuose, ir Camellia sinensis L. pumpuruose ir lapeliuose, yra flavonoliai kvercetinas, miricetinas, kemferolis. Lyginant žaliąją arbtatą su raudonąja katechinų atžvilgiu, Camellia sinensis L. augale flavonoliai yra sintezuojami formuoti katechinus, bet šis sintezės mechanizmas nevyksta Aspalathus linearis (Burm. F.) augale, o biosintezės neįvykimo priežastis nėra žinoma. Kol kas mokslininkams kyla klausimas, kodėl vieni augalai formuoja šiuos antrinius metabolitus, o kiti ne. Taigi, Camellia sinensis L. augale vieni iš pagrindinių biologiškai aktyvių junginių lemiančių gydomąsias savybes yra flavanoliai (flavan-3-oliai), o Aspalathus linearis (Burm. F.) augale flavonoliai [3] Žaliosios arbatos žaliavos (Camellia sinensis L.) cheminė sudėtis Arbatos rūšis, sezonas, nuskintų lapų amžius, klimatas ir sodininkystės praktika gali lemti arbatos sudėties pokyčius. Cheminėje sudėtyje aptinkami:

15 15 angliavandeniai; amino rūgštys (teaninas, glutaminas, alaninas, leucinas, izoleucinas, valinas, treoninas); baltymai; purino grupės alkaloidai (metilksantinai: kofeinas (2,5 4,2 %, teofilinas (0,02 0,04 %) ir teobrominas (0,15 0,2%)); polifenoliai: a) flavonoliai (kvercetinas, kemferolis, miricetinas); b) flavonai (apigeninas, luteolinas); c) flavanoliai (flavan-3-oliai) 10 25%: I. monomerai (katechinai): (-) epikatechinas (EC), (-) epikatechino 3 O galatas (ECG), (-) epigalokatechinas (EGC) ir (-) epigalokatechino 3 O galatas (EGCG)); II. dimerai (teaflavinai): (teaflavinas (TF), teaflavino 3 galatas, teaflavino- 3'-galatas, ir teaflavin-3,3'-digalatas (TF3)); III. oligomerai (taninai). Fenolinės rūgštys: galo rūgštis, chlorogeninė rūgštis, teogalinas; d) fenolinės rūgštys : galo rūgštis, chlorogeninė rūgštis, teogalinas; e) terpenų saponinai: baringtogenolis C, R1 - baringenolis; kai kurie mineralai ir mikroelementai [2, 3, 5, 8] Raudonosios arbatos (Aspalathus linearis (Burm. F.)) cheminė sudėtis Apžvelgus literatūrą ir susisteminus kitų autorių mokslinių tyrimų duomenis, pateikiama Aspalathus linearis (Burm. F.) fitocheminė sudėtis: Dihidrochalkonai aspalatinas iki 50 mg/g, notofaginas, aspalalininas. Flavonoidai: rutinas (1,3-1,7 mg/g), hiperozidas (0,3 0,4 mg/g), izokvercetinas (0,3 0,4 mg/g), kvercetinas (0,04 0,11 mg/g), luteolinas (0,02 0,03 mg/g). Flavonoidų C glikozidai (C glikozil flavonai) isoorientinas (3,6 mg/g), orientinas (2,3 mg/g), izoviteksinas (0,7 mg/g) ir viteksinas (0,5 mg/g).

16 16 Fenolinės rūgštys kavos, vanilo, ferulo, p kumaro, p hidroksibenzoinė. Viename užplikytame puodelyje yra iki 300 mg baltymų su Cu (7,8 proc.), Fl (5,5 7,3 proc.), Mn (1,7-2,2 proc.), o Ca, Fe, K, Mg, Na, Zn aptinkama mažiau nei 1 proc. Vitamino C aptinkama iki 15,7 mg/ 100 mg sausoje AŽ. Neturi purino grupės alkaloido kofeino; Flavan-3-oliai: ( - )-epikatechino galatas (ECG) ir ( - )-epikatechinas (EC); Eterinio aliejaus sudėtyje aptinkami net 99 junginiai, pagrindiniai komponentai gvajakolis (24%), 6 metil-3,5-heptadien-2-ono izomeras (5,2%), damascenonas (5,0%), geranilacetonas (4,2%), β-feniletil alkoholis (4,1%) ir 6-metil-5-hepten-2-onas (4,0%) [3, 6, 7, 22, 40] Fenolinių junginių apžvalga Augaluose fotosintezės metu susidaro pirminiai metabolitai, kaip lipidai, proteinai, aminorūgštys, chlorofilas, ligninas, angliavandeniai, kurie būtini, nes dalyvauja ląstelės pagrindiniuose procesuose. Tolimesnėse sintezės etapuose susidaro antriniai metabolitai, kurie nėra būtini augalo išgyvenimui ir saugomi ląstelės vakuolėse. Pastarieji skirstomi į 3 pagrindines grupes: terpenus, alkaloidus ir fenolinius junginius [3]. Fenoliniai junginiai skirstomi į flavonoidus, fenolines rūgštis, stilbenus, chinonus, kumarinus, ligninus, ksantonus ir chromonus [43]. Plačiau aptariami flavonoidai, nes yra svarbiausi fenolinių junginių atstovai Camellia sinensis L. bei Aspalathus linearis (Burm. F.) žaliavoje. Flavonoidai tai vandenyje tirpūs pigmentai aptinkami augalinės ląstelės citozolyje ir/ ar saugojami vakuolėse. Flavonoidų struktūros pagrindą sudaro C6-C3-C6 konfigūracija. Gamtoje dažniausiai aptinkami C- ir O- glikozidų pavidalu, sujungtų su cukraus molekule per C3 ir C7 padėtį, rečiau aglikonų pavidalu [3, 43]. Flavonoidai pagal cheminę sandarą ir propaninio fragmento oksidacijos laipsnį klasifikuojami į: Flavonoidus, turinčius (-OH) gupę C3 padėtyje: flavonolius (kvercetinas, kemferolis, rutinas), katechinus/flavanolius, antocianidinus (cianidinas,pelargoninas), leukoantocianidinus (leukopianidinas); Flavonoidus, neturinčius pakaito C3 padėtyje: flavonus (apigeninas, liuteolinas, diosminas), flavanonus (hesperidinas);

17 17 Flavonoidus, kurie nepriskiriami jokiai grupei: izoflavononai, chalkonai, auronai, neoflavonoidai (struktūriškai ir biologiškai panašūs į izoflavonoidus), biflavonoidai (polimerai iš kelių flavonoidų poklasių) [3, 7, 40, 43, 44]. Vertinant Camellia sinensis L. kokybinės sudėties atžvilgiu, plačiau apžvelgiami katechinai (flavan-3-oliai/ flavanoliai/ flavanai), pagrindiniai antriniai metabolitai Camellia sinensis L. augale, kurie priskiriami didžiausiai fenolinių junginių grupei flavonoidams. Tai aktualus tyrimo objektas farmacijoje, medicinoje, nes Camellia sinensis L. žaliavoje iš bendrųjų flavonoidų, flavan-3-oliai, išsiskiria sąlyginai dideliu kiekiu lyginant su jų aptikimo kiekiu kituose maisto produktuose. Flavan-3- oliai grupuojami pagal polimerizacijos laipsnį. Monomerams priklauso katechinai, tokie kaip (-)- epigalokatechino-3-galatas (EGCG), (-) -epigalokatechinas (EGC), (-) - epikatechinas (EC), (-) - galokatechinas (GC) ir (+) - katechinas (C). Dimerams priklauso teaflavinai, pvz., teaflavinas (TF), teaflavino-3-galatas, teaflavino-3'-galatas, ir teaflavin-3,3'-digalatas (TF3),- ir oligomerams priskiriami taninai (tearubiginai), kurių struktūra nėra žinoma. Kitų flavonoidų, kaip flavonų (apigeninas, luteolinas) ir flavonolių (kvercetinas, kempferolis, myricetinas) aptinkama santykinai mažesnis kiekis. EGCG yra itin biologiškai aktyvus katechinas ir jo gausiausia žaliosios arbatos žaliavoje lyginant su baltąja, rudąja Oolong, raudonąja Rooibos ir juodąja arbatomis [5, 6]. Juodosios arbatos gamybos metu monomerai flavan-3-oliai veikiami oksidacinės polimerizacijos proceso, kuris priklausomas nuo polifenolio oksidazės, ir taip formuojasi galimi oligomerai - bis flavanoliai, teaflavinai, tearubiginai [3, 5]. S. M. Karori ir kt. (2007) nustatė, kad pastarasis procesas lemia iki 85 proc. katechinų kiekio sumažėjimą, o teaflavin-3-3 -digalatų ir tearubiginų atsiradimą Camellia sinensis L. apdorojamoje žaliavoje. Atsirandantys kiekybiniai pokyčiai biologiškai aktyvių junginių augalinės žaliavos paruošimo metu turi lemiamą įtaką gydomajam poveikiui. Remiantis pateikiamais Europos Vaistų Agentūros (EMA) duomenimis, rekomenduojama paros dozė yra mg polifenolių, o trijuose užplikytos žaliosios arbatos puodeliuose aptinkama apie mg polifenolių [4] Žaliosios arbatos (Camellia sinensis L.) ir raudonosios arbatos (Aspalathus linearis (Burm. F.)) antimikrobinis aktyvumas Lyginant bendrųjų antibiotikų poveikį su augalinėmis antimikrobinėmis medžiagos, pastarosios turi silpną poveikį. Tačiau antibiotikų efektyvumui turi įtaką atsparumas vaistams, neišvengiamas šalutinis poveikis ir ribotas specifiškumas, o kai kurie augalinės kilmės vaistai gali itin mažomis dozėmis

18 18 inhibuoti patogenus, ypač Gram (+) bakterijas, kartu su mažesne toksiškumo tikimybe ląstelėms [8]. Katechinai, arbatoje esantys polifenoliai, proantocianidinai ir hidrolizuoti taninai rodo antimikrobinį aktyvumą. Bakterijų tolerancija polifenoliams priklauso nuo bakterijų rūšių ir polifenolių struktūros. Atliktų tyrimų duomenys rodo, kad įvairių arbatų ekstraktai gali inhibuoti maisto patogenus kaip Staphylococcus aureus, Shigella disenteriae, Vibrio cholera, Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes ir padėti sumažinti maiste plintančių mikroorganizmų skaičių išlaikant mikrobiologinę saugą [6]. Kitose studijose patvirtinamas žaliosios arbatos lapų ekstrakto antimikrobinis aktyvumas prieš odos ligų sukėlėjus in vitro. Staphylococcus epidermidis, Micrococcus luteus, Brevibacterium linens, Pseudomonas fluorescens ir Bacillus subtilis patogenai, kurie per diskų difuzijos tyrimą (inhibavimo zona ne mažesnė nei 7 mm) parodė jautrumą C. sinensis ekstraktams [8]. Lyginant penkių bakterijų (Bacillus cereus, Micrococcus luteus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Lactobacillus acidophilus) tyrimus, pastebėta, kad padermė B. cereus yra jautriausia, nes parodė didžiausią arbatos ekstraktų slopinimo skersmenį. Visų arbatų ekstraktai turėjo inhibitorinį efektą šiai padermei (žalioji> baltoji> juodoji> raudonoji). Antroji labiausiai jautri padermė buvo M. luteus (baltoji> žalioji> juodoji> raudonoji), o jai seka P. aeruginosa (juodoji> žalioji> baltoji). Priešingai, E. coli silpnai inhibuojama žaliosios ir baltosios arbatų ekstraktų, o visiems ekstraktams rezistentiška L. acidophilus [6]. Atsižvelgiama ir į galimybę apsisaugoti nuo dantų ėduonies, nes vandeniniai ekstraktai gali slopinti burnos ertmėje aptinkamus patogenus (Streptococcus mutans ir Streptococcus sobrinus) ir juos pašalinti [10]. Metanoliniuose (be kofeino) C.sinensis L. lapų ekstraktuose nustatytas antimikrobinis aktyvumas prieš 111 bakterijų atliekant in vitro tyrimus. Ekstraktai, μg /ml koncentracijos, inhibavo dauguma padermių, o net keletą padermių paveikė ir mažesnė nei 5 μg/ml koncentracija. Bakterijas galima suskirstyti pagal jautrumą mažėjimo tvarka: Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae, Escherichia coli, Shigella spp., Salmonella spp., Bacillus spp., Klebsiella spp. ir Pseudomonas aeruginosa [2]. Mokslinių studijų rezultatuose duomenys pagrindžia vieną iš vykdyto eksperimentinio tyrimo tikslų: žaliosios arbatos žaliavos vandeninių ištraukų inhibitorinį aktyvumą prieš įvarios kilmės patogenus. Kuriant sinergistinius arbatos polifenolių poveikius ir kombinuojant su įprastais antimikrobiniais veiksniais prieš klinikinius daugeliui vaistų atsparius mikroorganizmus gali teikti galimybę taikyti efektyvesnius farmacinius preparatus bei padėti pritaikyti klinikiniame gydyme (1 lentelė). 1 lentelė. Moksliniai tyrimai pagrindžiantys Camellia sinensis L. žaliavos antimikrobinį aktyvumą.

19 19 Testuotos kultūros eksperimentiniuose tyrimuose * Bacillus cereus, Micrococcus luteus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Lactobacillus acidophilus. Staphylococcus epidermidis, Micrococcus luteus, Brevibacterium linens, Pseudomonas fluorescens, Bacillus subtilis. Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae, Escherichia coli, Shigella spp., Salmonella spp., Bacillus spp., Klebsiella spp. ir Pseudomonas aeruginosa Streptococcus sanguinis, Streptococcus mutans Streptococcus mutans, Streptococcus sobrinus (burnos patogenai); Listeria monocytogenes, Shigella flexneri, Salmonella enterica (maiste atsirandantys patogenai) Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa Augalinės žaliavos Šaltiniai Žalioji arbata Baltoji arbata Raudonoji arbata Juodoji arbata [6] [8] + [2] + [21] + [10] + + [23] Stenotrophomonas maltophilia + [24] Staphylococcus aureus, Acinetobacter + [25] baumannii Candida glabrata, Clavispora lusitatiae, Cryptococcus laurentii, Filobasidiella neoformans, Issatchenkia orientalis, Saccharomyces Cerevisiae, Prototheca wickerhamii + [5] * Testuotų kultūrų teigiami (+) ir neigiami (-) priešmikrobinio aktyvumo įvertinimo rezultatai.

20 20 Nors yra nustatyti nefermentuotose išdžiovintuose lapuose aptinkamų polifenolinių junginių katechinų biologiniai ir farmakologiniai aktyvumai, vis dar keliamos įvairios hipotezės apie galimus jų veikimo mechanizmus. Vienoje iš jų pateikiama, kad Camellia sinensis L. geba negrįžtamai pažeisti bakterijų citoplazminę membraną, todėl kinta bakterijų adhezija (sukibimas) su ląstelėmis [8]. Pastebėta, kad Gram (-) bakterijos pasižymi didesniu rezistentiškumu polifenoliams nei Gram (+) bakterijos dėl ląstelės sienelės kompozicijos skirtumų (Gram (-) bakterijose lipopolisacharidai veikia kaip barjeras, kuris lemia mažesnį jautrumą katechinų poveikiui) [6, 8]. Kitas galimas veikimo mechanizmas aiškinamas C. sinensis poveikiu dihidrofolato reduktazei (DHFR), fermentui, kuris svarbus odos patogenams purinų ir pirimidinų sintezei ir didinti epidermio storėjimą [8]. Eksperimentinių studijų rezultatuose mėginiai su didžiausiu antimikrobiniu aktyvumu koreliuoja ir su didžiausiu antioksidaciniu aktyvumu, mažiau su bendru polifenolių kiekiu. Kad, ne visi polifenoliai turi antimikrobinį poveikį parodo nustatymas, kad EGCG (sudaro apie % visų katechinų) ir EGC turi didžiausią antioksidacinį ir antimikrobinį poveikį, o jų didžiausios koncentracijos aptinkamos žaliosios ir baltosios arbatų ekstraktuose [6, 8, 9]. Katechinų sinergistinis veikimas paaiškina kodėl neapdorotos žaliosios arbatos lapų ekstraktas pasižymi aukštesniu antimikrobiniu veikimu nei izoliuoti katechinai [8]. Nors raudonosios arbatos sudėty nėra katechinų, ji pasižymi silpnu antimikrobiniu veikimu dėl kitų biologiškai aktyvių medžiagų (rutino, orientino, izoorientino ir aspalatino) kurios gali prisidėti prie antimikrobinio ir antioksidacinio poveikių. Didžiausiu antimikrobiniu aktyvumu pasižymi nefermentuota arbata (žalioji, baltoji), mažiau dalinai fermentuota (raudonoji, oolong) ir fermentuota (juodoji) arbatos [6]. Tokių natūralių antioksidantų panaudojimas konservantų forma gali būti dažnesnis maiste bei kosmetikoje, nes vartotojai noriau renkasi natūralaus skonio maisto produktus, kuriuose nėra cheminių konservantų, pasižymi šviežumu, trumpesnio galiojimo, bet natūralesnės sudėties gaminius. Todėl baltosios ir žaliosios arbatų ekstraktų panaudojimas kaip mikrobiologiniais inhibitoriais kombinuotai su kitomis antimikrobinėmis medžiagomis ar metodais gali būti alternatyvus būdas siekiant aukštos farmacinio produkto sudėties kokybės ir skonio, be tradicinių konservantų [9].

21 Laisvieji radikalai ir antioksidantai, antioksidacinio poveikio įvertinimas Laisvieji radikalai (LR) tai reaktyviosios deguonies formos (ROS) žmogaus organizme, gaminamos ląstelinio aerobinio kvėpavimo metu kaip šalutiniai produktai ir lemia oksidacinį stresą. Ne tik ROS, bet ir azoto reaktyvios formos atakuoja ląstelių membranas, DNR, baltymus, lipidus bei angliavandenius, o oksidacinio streso metu LR sukeltos grndininės reakcijos sutrikdo organizmo veiklą [10, 39]. Antioksidacinis pajėgumas tai gebėjimas neutralizuoti LR veikiant natūraliai organizmo gynybinei sistemai arba natūraliai egzistuojantiems junginiams, kurie yra kaupiami augaluose. Medžiagos, kurios turi antioksidacinių savybių ir aptinkamos vaisiuose, daržovėse, uogose, gyvūninės kilmės ir augalinės kilmės maiste, maisto papilduose, vadinamos antioksidantais [14, 41, 42]. Antioksidacinei sistemai priskiriami antioksidaciniai fermentai, pvz., superoksidismutazė, katalazė, glutationo peroksidazė, glutationo S transferazė, - ir nefermentiniai substratai, pvz., glutationas, šlapimo rūgštis, lipoinė rūgštis, bilirubinas, kofermentas Q, vitaminas C (askorbo r.), vitaminas A (retinolis), vitaminas E (tokoferolis), flavonoidai, karotinoidai (astaksantinas, zeaksantinas), likopenas, bioflavanoidas resveratrolis. Kai kurios biomolekulės laikomos itin biologiškai aktyviomis ir kliniškai reikšmingais antioksidantais, pvz., transferinas, feritinas, laktoferinas, haptoglobinas, šlapimo rūgštis [41, 42]. Bet dažniausiai antioksidantai kaip medžiagos, turinčios gebą trukdyti formuotis LR bei blokuoti tolimesnes LR susidarymo reakcijas, yra grupuojamos į tris grupes [34]: 1) Nefermentiniai junginiai (prisijungiant elektroną iš LR ar atiduodant elektroną LR, sudaro stabilius tarpinius produktus, blokuojamos tolimesnės grandininės reakcijos); 2) Antioksidaciniai fermentai (pvz: superoksido dismutazė superoksidą paverčia vandenilio peroksidu, kurio suirimą katalizuoja katalazė, glutationo peroksidazė neutralizuoja peroksido radikalinį poveikį); 3) Antioksidaciniai vitaminai (vitaminas C nutraukia tolimesnes laisvųjų radikalų susidarymo reakcijas vandeninėje terpėje, o vitaminas E lipidinėje terpėje) [35, 39, 40, 41]. Antioksidantų geba stabilizuoti/inaktyvuoti laisvuosius radikalus susidariusius kūno audiniuose metabolinių procesų metu, lemia antioksidacinį aktyvumą, nes sumažėja organizme ląstelių ir audinių degradacija, kurioje tarpininkauja laisvieji radikalai. Antioksidantų veikla yra apibrėžiama kaip lipidų,

22 22 baltymų, DNR ar kitų molekulių oksidacijos slopinimu, blokuojant grandinines oksidacijos reakcijų etapus. Pirminiai antioksidantai tiesiogiai sąveikauja su laisvaisiais radikalais, o antriniai antioksidantai netiesiogiai, neleidžia formuotis laisviesiems radikalams Fentono (Fenton s) reakcijos metu [10, 42]. Antioksidantai geba inaktyvuoti LR dvejopai prisijungti nesuporuoto LR elektroną ar atiduoti vandenilio atomą LR. Nors reakcijos kinetika gali skirtis, bet antioksidanto poveikio galutiniame rezultate susidaro neutralizuotas prooksidantas [3, 18, 19, 42, 43]. Naturalūs augalinai šaltiniai (fenolinės rūgštys, flavonoidai, taninai ir terpenoidai, - fenoliniai junginiai) pasižymi ir pirminiu ir antriniu pajėgumu. Fenolinių junginių antioksidacinis gebėjimas pasireiškia per redokso (redox) mechanizmą: komponentai veikia kaip reduktoriai, vandenilio donorai, singletinio deguonies slopikliai ir metalų chelatoriai. Fenoliniai junginiai užkerta kelią formuotis reaktyvioms deguonies (ROS) ir reaktyvioms azoto (RNS) formoms, įskaitant tokius laisvuosius radikalus kaip superoksido anijonradikalas, hidroksiradikalas, azoto oksidas bei ne laisvieji radikalai kaip vandenilio peroksidas ir azoto rūgštis [10]. Biologiškai pavojingiausi oksidantai tai singulentinis deguonis (perėjęs iš tripletinės būsenos sužadintas deguonis), superoksido anijonradikalas, vandenilio peroksidas, hidroksiradikalas, azoto monoksido ir peroksinitrilo radikalai [10, 39, 41]. Siekiant efektyviai sumažinti oksidacinį stresą yra ieškomi potencialūs antioksidantų šaltiniai. Skiriamas didelis dėmesys natūralios kilmės antioksidantams, nes sintetiniai sukelia toksinį poveikį organizmui, todėl atliekami vaistinių augalų antioksidacinio aktyvumo tyrimai taikant įvairias modelines sistemas su įvairiais radikalais [3, 18, 43]. Nustatyta, kad tiriamų biologiškai aktyvių junginių antioksidacinis aktyvumas reikšmingai skiriasi taikant skirtingus metodus. Antioksidantų analizėje taikomus metodus galima suskirstyti į grupes: 1) Metodai, kurie paremti antioksidanto vandenilio atomo atidavimu laisvajam radikalui (pvz: fotochemiliuminescencinis, mažo tankio lipoproteinų oksidacijos metodai irk t.); 2) Metodai, kurie paremti laisvojo radikalo nesuporuoto elektrono prisijungimu prie antioksidanto (pvz: CUPRAC metodas); 3) Metodai, kurie paremti antioksidanto geba atiduoti savo vandenilio atomą arba prisijungti elektroną (pvz: DPPH, ABTS) [1-3, 5, 10, 18, 19, 43].

23 Žaliosios ir raudonosios arbatos antioksidacinio aktyvumo tyrimai Arbatžolių vandeniniai ekstraktai natūralūs antioksidacinių medžiagų šaltiniai, gebantys sumažinti organizme laisvųjų radikalų sukeliamus audinių ląstelių pažeidimus. Šis teigiamas poveikis žmogaus sveikatai ypač aktualus [4, 6, 10-12, 26, 27,46]. M.P. Almajano ir kt. (2008) atliko antioksidacinių ir antimikrobinių aktyvumo tyrimus analizuojant įvairių arbatų užpilus. Katechinų antioksidacinis gebėjimas įvertintas difenilpikrilhidrazilo (DPPH) metodu: EGCG> ( - )-epikatechino galatas (ECG)> EGC> ( - )-epikatechinas (EC)> katechinas (C). Pateikiama, kad žalioji arbata turi daugiausiai EGC, EGCG, EC, ECG, baltoji arbata šių junginių atitinkamai mažiau, o raudonoji arbata - mažiausiai ir tik EC ir ECG. Suminis fenolinių junginių kiekis (Folin-Ciocalteu metodu), TEAC (radikalinio sąveikavimo aktyvumo analizė) ir PAC vertės (fenolių antioksidacinis koeficientas, apskaičiuojamas iš TEAC ir bendro fenolinių junginių santykio) parodė, kad žalioji ir baltoji arbata turi labai panašų suminį fenolinių junginių kiekį, o raudonoji - 2,6 karto mažiau; TEAC didžiausią vertę turi žalioji> baltoji> raudonoji; PAC vertės išsiskirsto analogiška seka. Pastarieji duomenys leidžia daryti išvadą, kad stipriausiomis antioksidacinėmis savybėmis pasižymi žalioji arbata [6]. E. Joubert ir kt. (2004; 2005) ištyrė žaliosios ir raudonosios arbatos vandeninius ekstraktus, norėdami nustatyti flavonoidų gebą surišti DPPH ir O2 - radikalus. Kvercetinas pasižymėjo kaip stipriausias potencialus tirtų radikalų surišėjas. Silpnesnis antioksidacinis aktyvumas nustatytas aspalatino, orientino, luteolino ir izokvercetino [45]. Ta pati tyrėjų komanda tęsė antioksidacinio aktyvumo tyrimus su raudonosios arbatos vandeniniais ekstraktais, norėdami ištirti fermentacijos įtaką augalinei žaliavai. Fermentuotos AŽ vandeniniai ekstraktai pasižymėjo mažesniu antioksidaciniu aktyvumu lyginant su nefermentuotos (O2 - radikalų surišimas 69,2 proc. ir 78,2 proc., atitinkamai; DPPH radikalo surišimas 83,0 proc. ir 87,3 proc.) [46]. Kiti tyrėjai vertino fermentacijos, žaliavos paruošos ir ekstraktų paruošimo sąlygų įtaką Aspalathus linearis (Burm. F) antioksidaciniam aktyvumui. Pasirinkę įvertinti 5 skirtingų fermentacinių laipsnių AŽ, nustatė jų gebą surišti DPPH ir superoksido radikalus. Remiantis nustatytais rezultatais, paaiškėjo panaši fermentacijos įtakos tendencija: augalinės žaliavos ekstraktai su didesniu fermentaciniu laipsniu pasižymi mažesne geba surišti radikalus (Standley ir kt., 2001). Atliekant literatūros studijas, pastebėtas tyrėjų susidomėjimas natūralios kilmės antioksidantais, o aptarti antiradikalinių tyrimų rezultatai pateikia, kad Camellia sinensis L. ir Aspalathus

24 24 linearis (Burm. F.) pasižymi reikšmingomis antioksidacinėmis savybėmis dėl kaupiamųjų fenolinių junginių Žaliosios arbatos (Camellia sinensis L.) ir raudonosios arbatos (Aspalathus linearis (Burm. F.)) farmakologinės savybės Žalioji ir raudonoji arbatos yra turtingos biologiškai aktyviais junginiais, ypač flavonoidais, todėl pasižymėdamos plačiu terapiniu poveikiu yra aktualūs objektai tyrimams [11, 13]. Intensyvių mokslinių tyrimų in vitro ir in vivo dėka nustatyta, kad šios AŽ pasižymi terapinėmis savybės: Priešuždegiminiu [3, 4, 7, 13, 47]. Nustatyta, kad flavonoidai geba slopinti uždegimo mediatorius ciklooksigenazę ir lipooksigenazę, todėl sumažinamas uždegimo metabolitų fomavimąsis (arachidono rūgšties, prostaglandinų); Antimikrobiniu [5, 6, 8-10, 12, 20, 21]; Priešvėžiniu [3, 4, 7, 12, 27]. Eksperimentinių tyrimu metu nustatytas inhibuojamas poveikis tirozinkinazėms, todėl sutrikdomas nekontroliuojamas ląstelių augimas, angiogenezė, todėl navikas reikšmingai mažiau aprūpinamas krauju ilgainiui nebesusidarant kraujagyslėms; Antioksidaciniu [1, 10, 11, 14, 18, 20, 27, 42]. Nustatytas fenolių, ypač katechinų, gebėjimas surišti laisvuosius radikalus, todėl mažinama rizika įvykti ląstelių mutacijoms; Mažina neurodegeneracinių ligų vystymąsi [4, 17]; Mažinti riziką susirgti širdies ir kraujagyslių ligomis, nutukimu, antilipideminis poveikis [3, 4, 13, 15, 28, 31]. Antioksidantai stabdo mažo tankio lipoproteinų oksidaciją, todėl mažina kraujagyslių pažeidimo riziką, aterosklerozės vystymąsi; Stabdo odos senėjimo procesus [4, 30]. Stabdo kolageno mažėjimą odoje ir padidėjusį jo irimą, didina odos elastingumą, mažina raukšlių formavimąsi; Mažina osteoporozės vystymąsi [4, 16]. Už sveikatą stiprinančius poveikius atsakingas vienas iš pagrindinių žymenų - polifenolis epigalokatechin-3-galatas [5, 6, 8, 10, 21, 22, 29-33, 38].

25 25 Arbata susilaukia visuomenės dėmesio ne tik kaip polifenolių šaltinis, bet ir dėl aktualaus įvairiapusio teigiamo ryšio tarp jos vartojimo ir poveikio sveikatai, kur panaudojimas atskleidžiamas farmakologiniais duomenimis in vitro ir in vivo tyrimuose. Mokslinėse publikacijose skelbiami klinikiniai tyrimai: Svorio kontrolė svarbus veiksnys pacientams, turintiems padidėjusią širdies ir kraujagyslių riziką. Žaliosios arbatos katechinai gali padėti sumažinti riebalų kiekį ir padailinti kūno kompoziciją. Eksperimentuose in vivo su graužikais įrodyta, kad katechinai spartina riebalų oksidaciją ir mažina su maistu gaunamų riebalų sukeliamą svorio prieaugį. Klinikiniame tyrime dalyvavus anstvorį ir nutukimą turintiems žmonėms nustatyti riebalų pasiskirstymo pokyčiai. Tyrime, trukusiame 12 savaičių, dalyviai (n=132) atsiktinai suskirstyti į dvi grupes. Pirmoji grupė gerdavo gėrimą su 625 mg katechinų ir 39 mg kofeino sudėtimi, o antroji gerdavo gėrimą, kuriame 39 mg kofeino, bet neaptinkami katechinai. Dalyviai paprašyti laikytis pastovaus energijos suvartojimo ir užsiimti 180 min. vidutinio intensyvumo fizine veikla ne mažiau kaip 3 kartus/ savaitę. Tyrimo pradžioje ir po 12 savaičių buvo atliekami kūno sudėties (dviguba rentgeno absorbciometrija), pilvo riebalų matavimai (kompiuterinė tomografija) ir klinikiniai testai. Procentiniai pokyčiai nustatyti didesni viso pilvo riebalų srityje, poodinio pilvo riebalų plote bei trigliceridų koncentracija serume nevalgius katechino grupėje tirtų žmonių nei kontrolinėje, todėl katechinų vartojimas pagerino fizinio krūvio sukeltus pilvo riebalų ir trigliceridų serumo pokyčius. Tyrimas praktiškai gali padėti siekiant akivaizdesnių rezultatų svorio kontrolės programose bei mažinant riziką susirgti diabetu, širdies ligomis [29]. Odos pažeidimus, sukeltus UVA ir UVB, sumažinti gali padėti žalioji arbata (C. sinensis). Fotosenėjimas tai kolageno degradacija (nykimas) ir nenormalaus elastino kaupimasis (proliferacija, išvešėjimas) paviršiniame dermos sluoksnyje. In vivo tyrimo rezultatai su plikomis pelėmis, patyrusiomis UV fotosenėjimą, parodė žaliosios arbatos (C. sinensis) vandeninių ekstraktų, pagamintų iš žaliosios, baltosios ir juodosios arbatų, veiksmingumą raukšlių būklės gerinime, mažinant odos tarpląstelinio matrikso žalą, odos barjero pažeidimą ir uždegimą. CSWE (C. sinensis vandeniniai ekstraktai) lyginant su kontroline grupe, sumažino raukšlių sritis, veikiant negilias vagelias ir plonas keterėles (bangelių), blokavo raukšlių formavimąsi (baltoji ir juodoji> žalioji), didino odos drėgmę (baltoji> juodoji> žalioji; odos drėgmės talpa bet kurio ekstrakto buvo žymiai didesnė už kontrolinę grupę). Moksliniame tyrime nustatytas baltosios ir juodosios arbatos didesnis priešrauklinis aktyvumas nei žaliosios arbatos, bet visi vandeniniai ekstraktai mažina UVA sukeliamą odos šiurkštumą ir stabdo kolageno mažėjimą odoje, taip

26 26 pat stabdo UV sukeliamą padidėjusį kolageno irimą ir didina odos elastingumą. Atliktas fiziologinis ir histologinis žaliosios arbatos (C. sinensis) augalinės žaliavos vertinimas pagrindžia praktinę antioksidacinių savybių panaudojimo galimybę kaip vietiškai veikiančias priemones gerinant odos būklę ir mažinant raukšlių susidarymą [30]. Mityba yra itin svarbi pasireiškus aterosklerozinės ligos rizikos veiksniams, o glaudų aterosklerozės ir dislipidemijos ryšį patvirtina epidemiologiniai tyrimai. Tiriant žaliosios arbatos (C. sinensis) 250 mg kapsulių poveikį pacientams (n=33) sergantiems dislipidemija per trumpą stebėjimo laikotarpį (8 savaites), įrodyta geba sumažinti (3,9%) bendro cholesterolio ir MTL cholesterolio koncentraciją (4,5%). Reikšmingų lipidų kiekio skirtumų neužfiksuota tiriant placebu [31]. Osteoporozė degeneracinė kaulų liga, dažniausiai pasireiškianti moterims po menopauzės. o siekiant sušvelninti oksidacinius pažeidimus tirtas žaliosios arbatos (C. sinensis) polifenolių 500 mg veiksmingumas 6 mėnesius trukusiame ir placebu kontroliuojame tyrime. Atsitiktinai atrinktoms 171 moterims imti kraujo ir šlapimo mėginiai, vertintas oksidacinės DNR pažeidimo žymuo (8-hidroksi-2'- dezoksiguanozinas (8 - OHdG)) ir polifenolių koncentracija serume bei šlapime. Nustatytas reikšmingas 8 OhdG koncentracijos sumažėjimas šlapime dėka polifenolių intervencijos ir gebos mažinti oksidacinio streso pasireiškimą osteoporozės atveju po menopauziniu laikotarpiu [32]. Tyrimo objektas gali būti ir veiksminga priemonė užkirsti kelią būsimiems širdies ir kraujagyslių sutrikimams lėtiniams rūkaliams. Tirtas žaliosios arbatos (C. sinensis) poveikis endotelio funkcijai ir endotelio pirmtakinių ląstelių santykiui, kur pastebėta pirmtakinių ląstelių atvirkštinė koreliacija su endotelio disfunkcija, o tai rodo, kad trumpalaikis vartojimas gali pagerinti endotelio disfunkciją, nes ir flavonoidai sudaro su geležimi chelatus. Tyrimo objekto teigiamo poveikio rezultatai patvirtina sumažinti širdies ir kraujagyslių sutrikimo pasireiškimo tikimybę [33]. Mokslinių studijų rezultatuose pateikiama, kad žalioji arbata (C. sinensis) ir izoliuotas EGCG gali padėti pagerinti gliukozės toleranciją ir praktiškai pritaikyti nutukimo prevencijos programose. Viename iš atliktų tyrimų nustatytas ilgas žaliosios ir juodosios arbatų bei izoliuoto EGCG (1mg/ kg per dieną) poveikis gliukozės tolerancijos ir geno raiškos, susijusio su energijos apykaitos ir lipidų homeostaze, tyrime in vivo. Rezultatuose pateikiama, kad žaliosios arbatos ir juodosios arbatos augalinės žaliavos slopino adipocitų diferenciaciją ir riebalų rūgšties patekimą į riebalinį audinį, kol buvo didinama žiurkėse riebalų sintezė ir ir oksidacija kepenyse, be riebalų kaupimosi kepenų srityje, o EGCG padidino termogenezės žymenis ir diferenciaciją riebaliniame audinyje [28].

27 Žaliosios arbatos (Camellia sinensis L.) augalinės žaliavos nepageidaujamas poveikis Nors iš epidemiologinių ir klinikinių intervencijos tyrimų pateikiami teigiami rezultatai sveikatos naudai, bet yra ir prieštaringų rezultatų bei nuomonių dėl saugumo. Žalioji arbata (C. sinensis) žinoma kaip polifenolių šaltinis, dėl kiekybiškai dominuojančių katechinų (flavonoidų pogrupio - flavanolių), kurių sistemingas ir dažnas vartojimas kelia nerimą dėl galimos žalos sveikatai [2, 36, 37]. Kiekybiniai polifenolių, katechinų ir antioksidacinio aktyvumo tyrimai rodo, kad tos pačios rūšies arbatos, bet skirtingų gamintojų turi ir skirtingą cheminę sudėtį, todėl lemia ir kitokias terapines savybes [3]. Perdozavimas (300 mg kofeino arba 5 puodeliai arbatos) pasireiškia drebuliu, neramumu, jaudrumu, vėmimu ir pilvo spazmais [2]. Žaliosios arbatos vartojimo saugumo klausimas naujai iškeltas, po pranešimų apie hidroalkoholinio žaliosios arbatos ekstrakto Exolise sukeltus sveikatos sutrikimus Prancūzijoje ir Ispanijoje. Exolise svorio mažinimo produktas, kurio šalutinis poveikis pasireiškė ūmiu kepenų pažeidimu. Nuo metų pranešimuose nustatinėjančiuose žaliosios arbatos (C. sinensis) hepatotoksiškumą, histologiniai kepenų tyrimai parodė uždegimo infiltratų patologines charakteristikas, cholestazę, steatozę ir nekrozę. Manoma, kad hepatotoksiškumo pasireiškimą lemia katechinai, ypač biologiškai aktyvus EGCG. Citotoksiniai veikimo mechanizmai aiškinami mitochondrijų membranų destrukcija (ardymas, pažeidimas) ir reaktyvaus deguonies formavimo sužadinimu (indukcija). Nustatyta, kad tipinis kepenų pažeidimas gali pasireikšti po 3 mėnesių vartojimo [37]. Didelėmis dozėmis tyrimo objekto ekstraktai gali sąveikauti su antihipertenziniais vaistais, antitrombocitiniais vaistais ar varfarinu. Taip pat neatmetama galimybė potencinė sąveika su psichoanaleptiniais vaistais [2]. Siūloma daugiau atlikti tyrimų su CYP3A4 metabolizuojamais vaistais (buspironas, midazolamas ir kt.), nes in vitro ir in vivo tyrimuose su gyvūnais ir sveikais savanoriais yra nustatyti žaliosios arbatos ekstraktų sąveikos įrodymai su CYP3A4 substratais. Tikslios žinios apie vaistažolių ir vaistų sąveikas yra svarbios atliekant klinikinės rizikos vertinimą, siekiant sumažinti riziką iki minimalios pasireiškimo galimybės ir nedvejoti žolinio vaisto saugumu [38]. Prieštaringas reguliaraus žaliosios arbatos (C. sinensis) polifenolių vartojimo klausimas sietinas su kepenų toksiškumu paneigiamas atlikto tyrimo rezultatais: lėtinis polifenolių poveikis (3 savaites po

28 28 6 kaps/dieną, atitiko 714 mg/d polifenolių) nesukėlė sveikuose vyruose fiksuojamų kepenų funkcijos biomarkerių pakitimų [36]. Raudonosios arbatos neigiamo poveikio duomenų nepateikiama [3, 7, 11, 46, 47] Vaistažolių arbatos gamybos metodai Ekstraktai kietos, skystos ar tirštos konsistencijos preparatai, kurių gamybai vartojama išdžiovinta augalinės ar gyvūlinės kilmės medžiaga. Ekstraktai priskiriami Galeniniams preparatams, kurie gaunami ekstrahuojant augalinės ar gyvūlinės kilmės žaliavą, o vėliau apdorojant įvairiais metodais. Aprašus apie ekstraktus galima rasti Europos (Ph.Eur. 1997:0765), Vokietijos (DAB10), Austrijos (OAB 90), Nyderlandų (Ned.6), Šiaurės šalių (Nord.63), Rusijos (SSRS GF 9-11), Japonijos (Jap. 61), Didžiosios Britanijos (BP 68), JAV (USP XVII) ir kitų šalių farmakopėjose. Ekstraktas pagal konsistenciją gali būti skystas (Extracta fluida), tirštas (Extracta spissa), pusiau tirštas pusiau skystas (Extracta tenua s. mollia) ir sausas (Extracta sicca) [34]. Vaistažolinių arbatų paruošimo metodai turi atitikti Europos Farmakopėjoje bendrojoje monografijoje Vaistažolinės arbatos pateiktus reikalavimus (Ph.Eur. 2008:1435), nes skirtingas paruošimas gali lemti skirtingą pagamintų formų saugumą. Vaistinės AŽ arbatos tai natūralūs vaistiniai preparatai, vartojami į vidų vandeninių ištraukų/ekstraktų forma, kuri gaminama prieš pat vartojimą maceracijos, užpilo ar nuoviro gamybos metodais. Užpilo (lot.infusum) ruošimui vartojami lapai, žolė, žiedai ir kitos vaistinės augalinės dalys, kurios lengvai atiduoda savo veikliąsias medžiagas. Jei užpilas gaminamas karštuoju būdu, tai bus taikomas 15 min. kaitinimas ir 45 min aušinimas. Užpilas gali būti gaminamas šaltuoju būdu [4, 39]. Buitinė ištrauka paruošiamas užpilant verdantį vandenį ant susmulkintos augalinės žaliavos, laikoma 5 15 minučių [4]. Europos vaistų agentūros pateiktame Camellia sinensis L. įvertinime rekomenduoja paruošti nefermentuotą žaliąją arbatą užpilant ml verdančiu vandeniu ant vieno šaukštelio susmulkintų lapelių ir palikti 3 5 minutes [2, 4]. Nuoviras (lot. decoctum) ruošiamas užpilant apskaičiuotą šalto vandens kiekį ant vaistinės AŽ infundiriniame indelyje, kuris uždengiamas ir įstatomas į infundavimo aparato vandens vonią, kaitinama

29 29 30 min., vėliau aušinama 10 min. [35]. Vaistinės AŽ, kuriose aptinkami lakieji junginiai, nėra vartojamos nuovirų gamyboje. Taigi, užpilai ir nuovirai yra vandeninės AŽ ištraukos arba kaip specialūs ekstraktų vandeniniai tirpalai, vartojami išoriniu ar peroraliniu būdu. Vandeninių ištraukų gamybos stadijos: žaliavos smulkinimas, dulkių nusijojimas, ekstrahavimas (kaitinimas ir aušinimas), košimas, pagamintos ištraukos tūrio korekcija, įpakavimas ir apipavidalinimas. Šioms vaistinėms formoms būdingas trumpas tinkamumo naudoti laikas [35, 39]. Maceracijos metodas pasižymi paprastu atlikimu: susmulkinta žaliava užpilama apskaičiuotu kiekiu ekstrahento ir laikoma sandariame inde 5 7 paras. Maceracija ilgai tęsiasi, nes lėtai vyksta difuzija bei susidaro nuostolių dėl išgaravusio ekstrahento kiekio [35]. Nuovirų ruošimui ir maceracijai yra tinkamesnės šaknys, šakniastiebiai, žievė, išdžiovinti vaisiai, stambūs lapai ir kitos augalinės dalys, sunkiai atiduodančios savo veikliąsias medžiagas [4, 35, 39]. Taip pat maceracija gali būti atliekama 30 minučių mirkant susmulkintą augalinę žaliavą vandenyje, kurio temperatūra palaikoma didesnė nei kambario, bet mažesnė, nei virimo [4] Pagrindiniai veiksniai, darantys įtaką ekstrahavimo procesui arbatos gamybos technologijoje Pagrindiniai veiksniai, turintys įtakos ekstrahavimo procesui yra žaliavos kokybės faktoriai ir faktoriai, veikiantys masės pernašą AŽ dalelių viduje ir ekstrahente. Žaliavos kokybės faktoriai: AŽ smulkumas; smulkinimo būdas; drėgmės kiekis [39]. Gaminant AŽ ištraukų/ ekstraktų vandeninių tirpalų formas, užpilus ir nuovirus, reikia atkreipti dėmesį į AŽ smulkumą, nes tai turi įtakos biologiškai aktyvių junginių išsiekstrahavimui [2, 35]. AŽ smulkumas lapams ir žolei nurodomas ne didesnis nei 5 mm dalelių dydis, šaknims, šakniastiebiams, stiebams ir žievei 3mm, o vaisiams ir sėkloms 0,5 mm. Jeigu recepte nėra nurodytas augalinės

30 30 žaliavos kiekis, tai ištrauka gaminama santykiu 1:10 [35]. Didesnis AŽ smulkumas lemia padidėjusį susilietimo paviršių su ekstrahentu, todėl difuzija greitesnė lyginant su stambiu AŽ smulkumu, kuris lemia lėtesnį ekstrahavimo procesą, kadangi ekstrahentas sunkiau prasiskverbia į ląsteles ir išplauna mažai veikliųjų medžiagų. Netinkamai parinktas smulkinimo būdas AŽ gali lemti ekstrahavimo proceso sulėtėjimą, pvz., atliekant malimą AŽ ir per daug susmulkinus, iš labiau suardytų ląstelių išsiskiria balastinės augalinės medžiagos iš AŽ, kurios lėtina ekstrahavimo procesą. O AŽ esantis per didelis drėgmės kiekis neigiamai veikia AŽ kokybę. Faktoriai, veikiantys masės pernašą AŽ dalelių viduje ir ekstrahente: hidrodinaminės sąlygos; temperatūra; žaliavos ir ekstrahento santykis; ekstrahavimo trukmė, ekstrahento ph. Ekstrahavimo metu būtina palaikyti kuo didesnį koncentracijų gradientą, nes difuzija vyksta koncentracijų skirtumo dėka, pvz., maišant fazių sąlyčio vietoje palaikomas koncentracijų skirtumas, todėl sudaromos sąlygos vykti molekulinei difuzijai iš žaliavos dalelių į ekstrahentą (daleles skalauja mažesnės koncentracijos tirpalas), o ekstrahente vyksta konvekcinė difuzija. Jei ekstrahuojant palaikoma aukštesnė temperatūra, tai pagerėja medžiagų tirpumas, intensyviau vyksta molekulinė difuzija, todėl ekstrahavimas vyksta greičiau [39]. Norint apskaičiuoti reikalingą vandens kiekį gaminamai vaistinei formai vartojamas sugerties koeficientas Ks. Šaknims šis koeficientas yra nurodytas 1,5 karto daugiau už žaliavos masę, o lapams, žolei ir žievei 2 kartus daugiau [35]. Vandens kiekiui, reikalingam ištraukai gaminti, apskaičiuojamas daugeliui vaistinių augalinių žaliavų vartojant formulę: X=V+M Ks X vandens kiekis, reikalingas ištraukai gaminti, ml; V recepte išrašytas užpilo ar nuoviro tūris, ml; M augalinės žaliavos masė, g; Ks sugerties koeficientas [39].

31 31 Ilga ekstrahavimo trukmė nėra ekonomiška, nes laikui bėgant ekstrahavimo greitis mažėja dėl to, kad pirma išplaunamos medžiagos iš suardytų ląstelių, o po to iš nepažeistų. Ekstrahento ph gali būti koreguojama atsižvelgiant į veikliųjų medžiagų sudėties duomenis ir nustatant, kokioje terpėje ekstrahuojamos medžiagos geriausiai tirpsta [2, 39].

32 Medžiagos ir tirpikliai 2. TYRIMO METODIKA Tirpikliai: 1. Išgrynintas vanduo (Phönix, Vokietija) 2. C2H5OH etanolis, 96 % (UAB Stumbras, Lietuva) Reagentai: 1. Folin Ciocalteau fenolinis reagentas (Sigma Aldrich chemie, Šveicarija) 2. DPPH* - 2,2 difenil 1 pikrilhidrazil hidratas (Sigma Aldrich chemie, Vokietija) 3. Na2CO3 natrio karbonatas (Sigma Aldrich chemie, Prancūzija) Medžiagos standartams: 1. Galo rūgštis (Sigma Aldrich chemie, Vokietija) Tyrimo objektas. Analizės atliekamos 5 skirtingoms augalinėms žaliavoms, kurios yra vienarūšės, grynos arbatos, be papildomų priemaišų, pvz., priedų, kurie sodrintų skonį, ryškintų aromatą, spalvą ir kt. China Gunpowder, žalioji arbata (Camellia sinensis L.). Gamintojai rekomenduoja užpilti 80 o C temperatūros vandeniu ir vartoti po 3 5 min.ekstrakcijos; Japan Bancha, žalioji arbata (Camellia sinensis L.). Gamintojai rekomenduoja užpilti 80 o C temperatūros vandeniu ir vartoti po 5 min.ekstrakcijos; Pai Mu Tan, baltoji arbata (Camellia sinensis L.). Gamintojai rekomenduoja užpilti o C temperatūros vandeniu ir vartoti po 10 min.ekstrakcijos; Jade Oolong, rudoji arbata (Camellia sinensis L.). Gamintojai rekomenduoja užpilti 90 o C temperatūros vandeniu ir vartoti po 5 min.ekstrakcijos; Rooibos Original, raudonoji arbata (Aspalathus linearis (Burm. F.)). Gamintojai rekomenduoja užpilti 80 o - 90 o C temperatūros vandeniu ir vartoti po 5 min.ekstrakcijos. ir nuoviro. Šių žaliavų vandeninės ištraukos paruošiamos 3 skirtingais gamybos metodais: buitiniu, užpilo

33 Analitiniai metodai Žaliosios arbatos (Camellia sinensis L.) ir raudonosios arbatos (Aspalathus linearis (Burm. F.)) vandeninių ekstraktų gamyba Buitinės paruošos gamybos technologija arbatos lapeliai (lapelių diametras ne didesnis nei 5 mm ( FS B22:2002)) užpilami su 80 o C, 90 o C ir 100 o C distiliuotu vandeniu atskiriems bandiniams santykiu 1:10, atsižvelgus į sugėrimo koeficientą (2). Mėginiai imami praėjus 5, 10, 15, 20 minučių nuo užpylimo. Užpilo gamybos technologija žaliava dedama į pašildytą infundirę, užpilama distiliuotu vandeniu santykiu 1:10, sugėrimo koeficientas 2 ir šildoma vandens vonioje 10 min. pakartotinai maišant, vėliau paliekama stovėti 30 min., košiama per marlę, ant kurios yra nedidelis kiekis vatos ir nuspaudžiama (ES B 23:2002), bet pastebėjus vizualines priemaišas po nuspaudimo, pasirinkta atlikti filtravimą per filtrą. Nuoviro gamyba žaliava dedama į pašildytą infundirę, užpilama distiliuotu vandeniu santykiu 1:10, sugėrimo koeficientas 2 ir šildoma infundirė vandens vonioje 30 min. pakartotinai maišant, vėliau paliekama aušinamui 15 min., košiama per marlę, ant kurios yra nedidelis kiekis vatos ir nuspaudžiama (ES B 23:2002), bet pastebėjus vizualines priemaišas po nuspaudimo, pasirinkta atlikti filtravimą per filtrą Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas spektrofotometrinio metodo pagalba Suminiai fenolinių junginių kiekiai nustatyti spektrofotometriškai (FS B 21:2002), atliekant reakciją su Folin-Ciocalteu reagentu ir naudojant Agilent 8453 UV- Vis spektrofotometrą (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, JAV). Ištraukos (1 ml) matavimo kolbutėje sumaišomos su 3 ml išgryninto vandens, 1 ml Folin-Ciocalteu reagentu, pridedama 1,5 ml 20 % vandeninio Na2CO3 tirpalo. Mišinys skiedžiamas išgrynintu vandeniu iki 10 ml. Tirpalai laikomi 30 min. kambario temperatūroje.

34 34 Absorbcija matuojama prie 765 nm bangos ilgio [6, 28]. Šios spektrofotometrinės analizės duomenys įvertinti pagal galo rūgšties etaloninio tirpalo gradavimo grafiko tiesinės regresijos lygtį. Kalibracinė kreivė sudaryta, naudojant šešis galo rūgšties standartinius tirpalus, todėl visur bendras fenolinių junginių kiekis išreiškiamas g/ml GRE (galo rūgšties ekvivalentas). Galo rūgšties gradavimo grafikas pateikiamas darbo priede (7 priedas) Bendro antioksidacinio aktyvumo nustatymas naudojant DPPH* radikalą Norint įvertinti ar junginiai pasižymi antioksidaciniu aktyvumu, yra naudojamas laisvojo radikalo (DPPH) surišimo metodas, nes nustatoma kiek laisvojo radikalo suriša fenoliniai junginiai. Laisvieji radikalai inaktyvinami paverčiant juos stabiliais DPPH-H junginiais. Rezultatai išreiškiami procentais, kurie apskaičiuojami pagal inaktyvuotą DPPH kiekį. Tyrimo eiga: į kiuvetę pilama 2,9 ml 40 µg/ml (t.y. 0,1 mm) koncentracijos DPPH (2,2 defenil 1 pikrilhidrazilo) tirpalo ir 0,1 ml tiriamosios augalinės žaliavos tirpalo. Paliekama stovėti 15 min. tamsoje, po to supurtoma ir laikoma dar 15 min. Lyginamasis tirpalas 96 proc. etanolio tirpalas. Matuojama absorbcija spektrofotometru esant 518 nm bangos ilgiui [22]. Apskaičiavimas: Inaktyvuotas DPPH kiekis (proc.) = [ Ao At Ao ] 100; Ao bandinio be tiriamojo tirpalo absorbcija, gryno DPPH optinis tankis; At bandinio su tiriamuoju tirpalu absorbcija pusiausvyroje.

35 Antimikrobinio aktyvumo nustatymas in vitro Mikrobiologinis tyrimas atliktas siekiant įvertintiti skirtingų fermentacijų buitiniu metodu pagamintų vandeninių ekstraktų antimikrobinį aktyvumą šulinėlių metodu. Tyrimo metu naudotos bakterijų kultūros sterilios zonos nustatymui: Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Enterococcus feacalis (ATCC 29212), Bacillus cereus (ATCC 11778), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), Escherichia coli (ATCC 25922), Salmonella enterica enteritidis (ATCC 13076). Kultivavimo terpei naudotas Miulerio Hintono agaras (Mueller- Hinton broth II, BBL, Cockeysville, JAV). Pirmiausia paruošta terpė išpilstoma į sterilias Petri lėkšteles (20 ml terpės į kiekvieną lėkštelę). Terpei sustingus ant jos paviršiaus paskleidžiama naudojamų bakterijų kultūros. Kitas etapas Petri lėkštelėse esančiame agare padaromi šulinėliai (6 mm diametro), kurie pripildomi tiriamais preparatais: į šulinėlius dedamas 0,1 ml tiriamojo užpilo, o į kontrolinį distiliuotas vanduo. Baigus paruošiamuosius darbus, turimos Petri lėkštelės, kurių kiekvienoje kultivuojamos skirtingos mikroorganizmų kultūros, o šulinėliuose tiriamų preparatų pavyzdžiai. Paruoštos Petri lėkštelės su mikroorganizmų kultūromis 24 valandas inkubuojamos termostate, esant 37 o C temperatūrai. Antibakterinis aktyvumas vertinamas išmatavus zonų, kuriose inhibuojamas mikroorganizmų dauginimasis, pločius. Remiantis bendro fenolinių junginių kiekio nustatymo rezultatais buitiniu metodu pagamintuose vandeniniuose ekstraktuose, didžiausias biologiškai aktyvių medžiagų kiekis nustatytas 90 o C ir 100 o C temperatūros atveju, po 10 min. ekstrahavimo taško, po to išsiskyrimas lėtėjantis. Todėl tiriamųjų AŽ antimikrobinių savybių nustatymui in vitro, ekstraktai gaminami 90 o C 100 o C temperatūros sąlygomis, laikomi 10 minučių (santykis 1:10).

36 Statistinė duomenų analizė Statistinė duomenų analizė atlikta MS Excel 2013 ir SPSS Statistics 17.0 programomis. Statistiniai reikšmingi skirtumai tarp grupių apibrėžti, kai p < 0,05. Duomenys grafiškai pateikti naudojantis minėtomis programomis. 3. TYRIMŲ REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS Žaliosios arbatos (Camellia sinensis L.) ir raudonosios arbatos (Aspalathus linearis (Burm. F.)) buitiniu metodu pagamintų augalinių žaliavų skystųjų ekstraktų spektrofotometrinio tyrimo rezultatai Eksperimentinio tyrimo metu vertinama 80 o C, 90 o C, ir 100 o C temperatūros įtaka gaminamų ištraukų kokybei. Ekstrahavimas atliekamas remiantis gamintojų instrukcijomis, laikomi minučių, bei pasirinkti papildomi laiko taškai, ankstesnis laiko taškas po 5 minučių ir praėjus rekomenduotinam ekstrakcijos laikymui, po 20 minučių, siekiant atlikti detalesnį kokybinį ištraukų vertinimą. Tiriamieji objektai tai skirtingų fermentacijų žaliosios arbatos Camellia sinensis L. žaliavos: N1 China Gunpowder (žalioji), N2 Japan Bancha (žalioji), N3 Pai Mu Tan (baltoji), N4 Jade Oolong (rudoji),- ir raudonosios arbatos augalinė žaliava (Aspalathus linearis (Burm. F)) N5 Rooibos Original (raudonoji). Fermentavimas viena iš svarbiausių arbatos lapelių apdorojimo stadijų gamybos procese, todėl tiriamos skirtingų fermentacijų žaliosios arbatos (C.sinensis L.) ir raudonosios arbatos (A.linearis (Burm. F.)) vandeninės ištraukos paruoštos rekomenduotinomis temperatūrinėmis sąlygomis 80 o C, 90 o C ir 100 o C ir įvertintos spektrofotometru 5, 10, 15 ir 20 minučių ekstrahavimo laiko taškuose. Atlikus matavimus pastebėti suminiai fenolinių junginių kiekių išsiskyrimai augalinėse žaliavose.

37 Bendras fenolinių junginių kiekis pagal galo rūgšties ekvivalentą, g/ml LAIKAS, MIN N1. N2. N3. N4. N5. 11 pav. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas atlikus buitinį užpylimą su 80 o C distiliuotu vandeniu, kur N1 China Gunpowder (žalioji), N2 Japan Bancha (žalioji), N3 Pai Mu Tan (baltoji), N4 Jade Oolong (rudoji), N5 Rooibos Original (raudonoji) Tiriant gamintojų rekomenduojamą 80 o C temperatūros sąlygos atveju, didžiausi suminiai fenolinių junginių kiekiai visais laiko taškais būdingi N3 (atitinkamai 76 ± 0, 97 g/ ml GRE po 10 min., 77 ± 0, 29 g/ ml GRE po 15 min., 81 ± 0, 77 g/ml GRE po 20 min.) ir N4 (atitinkamai 74 ± 1, 25 g/ ml GRE po 10 min., 86 ± 0, 92 g/ ml GRE po 15 min., 75 ± 2, 03 g/ ml GRE po 20 min.) ištraukų mėginiuose (11 pav.). Mažesniu suminiu fenolinių junginių kiekiu pasižymėjo N1 (atitinkamai 60 ± 1, 21 g/ ml GRE po 10 min., 77 ± 3, 79 g/ ml GRE po 15 min., 73 ± 3, 51 g/ ml GRE po 20 min.), o mažiausi kiekiai aptikti N2 (56 ± 1, 14 g/ ml GRE po 20 min.) ir N5 (66 ± 1, 49 g/ ml GRE po 20 min.) ištraukų mėginiuose. Laiko atžvilgiu fenolinių junginių kiekis iki 15 min. laiko taško tolygiai didėjo, 15 min. laiko taške fiksuotas žymus biologiškai aktyvių medžiagų padidėjimas visuose mėginiuose, o po 20 min. laiko taško nežymus padidėjimas N2, N3 ir N5 mėginiuose bei nedidelis sumažėjimas N1 (atitinkamai nuo 77 ± 3, 79 g/ ml GRE po 15 min. iki 73 ± 3, 51 g/ ml GRE po 20 min.) ir N4 (atitinkamai, nuo 86 ± 0, 92 g/ ml GRE po 15 min. iki 75 ± 2, 03 g/ ml GRE po 20 min.) mėginiuose.

38 Bendras fenolinių junginių kiekis pagal galo rūgšties ekvivalentą, g/ml LAIKAS, MIN N1. N2. N3. N4. N5. 12 pav. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas atlikus buitinį užpylimą su 90 o C distiliuotu vandeniu, kur N1 China Gunpowder (žalioji), N2 Japan Bancha (žalioji), N3 Pai Mu Tan (baltoji), N4 Jade Oolong (rudoji), N5 Rooibos Original (raudonoji) Temperatūros įtaką patvirtino padidėjusios fenolinių junginių skaitinės reikšmės visuose laiko taškuose, pakeitus temperatūrinę bandymo sąlygą iš 80 o C į 90 o C (12 pav.). Šio bandymo metu nustatytas mažiausias fenolinių junginių kiekis N5 ir N1 tiriamuosiuose, bet tolygus biologiškai aktyvių medžiagų didėjimas fiksuotas 5 15 min. laiko intervale, o 20 min. taške nežymus sumažėjimas. Ryškesnis tolygus fenolinių junginių padidėjimas nustatytas tiriamuosiuose po 20 min., ypač, N4 >N2 >N3 (atitinkamai, 93,79 ± 2,40 g/ml GRE, 91,53 ± 0,89 g/ml, 90,44 ± 1,31 g/ml GRE) Bendras fenolinių junginių kiekis pagal galo rūgšties ekvivalentą, g/ml LAIKAS, MIN N1. N2. N3. N4. N5.

39 39 13 pav. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas atlikus buitinį užpylimą su 100 o C distiliuotu vandeniu, kur N1 China Gunpowder (žalioji), N2 Japan Bancha (žalioji), N3 Pai Mu Tan (baltoji), N4 Jade Oolong (rudoji), N5 Rooibos Original (raudonoji) Kaip matyti iš 13 paveiksle pateiktų tyrimo rezultatų, pakeitus 90 o C temperatūrinę sąlygą į 100 o C, fenolinių junginių skaitinės reikšmės padidėjo visuose laiko taškuose lyginant su ankstesniais duomenimis žemesnių temperatūrų sąlygomis (80 o C, 90 o C). Nuo 5 10 min. laiko intervalo fenolinių junginių kiekis labai padidėjo N2 AŽ vandeniniame ekstrakte (nuo 60,23 ± 2,12 iki 87,32 ± 0,89 g/ml GRE), o vėlesniuose laiko taškuose tolygus biologiškai aktyvių junginių kiekio didėjimas (92,04 ± 2,60 94,51 ± 1,54 g/ml). Vertinant temperatūros įtaka ekstraktyvių medžiagų kiekiui spektrofotometriniu metodu nustatyta, kad 90 o C ir 100 o C temperatūros vanduo itin padidino suminį ekstraktyvių medžiagų išsiskyrimą (kiekį). Ilgėjant ekstrahavimo laikui buvo fiksuotas ir tolygiai didėjantis išsiekstrahavusių medžiagų kiekis buitiniu metodu paruoštose vandeniniuose ekstraktuose, todėl galima teigti, kad ekstrahavimo laiko ir fenolinių junginių kiekio sąryšis yra tiesioginis. Aukščiausiomis skaitinėmis reikšmėmis pasižymėjo N4 ir N2, mažesnėmis, bet artimomis N1 ir N3, mažiausiomis N5 (dalinai fermentuota C. sinensis (rudoji) > nefermentuota C. sinensis (žalioji) > nefermentuota C. sinensis (baltoji) > dalinai fermentuota A. linearis (raudonoji)). Didžiausias biologiškai aktyvių medžiagų kiekis išsiekstrahuoja po 10 min., po to išsiskyrimas lėtėja. Po 20 min. laikotarpio ekstraktyvių medžiagų kiekis padidėjo 6,6 % vertinant 80 o C temperatūros įtaką, 10,2 % vertinant 90 o C temperatūros įtaką bei 4,7 % vertinant 100 o C temperatūros įtaką. Nustačius buitiniu užpilimu pagamintuose AŽ vandeniniuose ekstraktuose suminius fenolinių junginių kiekius 80 o C, 90 o C ir 100 o C temperatūrinėmis sąlygomis ir 5, 10, 15, 20 min. laiko trukmės ekstrakcijų įtakose, įvertinta, kad aukščiausios skaitinės reikšmės nustatytos užpylus 100 o C temperatūros vandeniu ir atlikus 20 min. trukmės ekstrakcijas. Bendras fenolinių junginių kiekis, taikant buitinio užpilimo gamybos technologiją, Camellia sinensis L. AŽ vandeniniuose ekstraktuose nustatytas nuo 47,56 ± 3,00 iki 96,24 ± 2,16 g/ml GRE, o Aspalathus linearis (Burm. F.) AŽ vandeniniuose ekstraktuose nustatytas nuo 44,20 ± 0,78 iki 70,56 ± 1,61 g/ml GRE.

40 Žaliosios arbatos (Camellia sinensis L.) ir raudonosios arbatos (Aspalathus linearis (Burm. F.)) užpilų ir nuovirų vertinimas Ištyrus buitiniu metodu pagamintus žaliosios arbatos (Camellia sinensis L.) ir raudonosios arbatos (Aspalathus linearis (Burm. F.)) AŽ vandenius ekstraktus ir įvertinus technologinių veiksnių daromą įtaką vandeninių ištraukų fenoliniams junginių kiekiams, taip pat įvertinta standartinių vaistinių formų, užpilų ir nuovirų, paruošos daroma įtaka pastarųjų biologiškai aktyvių junginių kiekiams ir tiriamų arbatų rūšių kokybė Bendras fenolinių junginių kiekis užpiluose ir nuoviruose pagal galo rūgšties ekvivalentą, g/ml N1. N2. N3. N4. N Užpilas Nuoviras 14 pav. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas ir jų priklausomybė nuo paruošos būdo bei žaliavos rūšies, kur N1 China Gunpowder (žalioji), N2 Japan Bancha (žalioji), N3 Pai Mu Tan (baltoji), N4 Jade Oolong (rudoji), N5 Rooibos Original (raudonoji) Kaip matyti iš 14 paveiksle pateiktų tyrimo rezultatų, bendrai didžiausiu suminiu junginių kiekiu abiejuose gamybos paruošose išsiskyrė nefermentuotos Camellia sinensis L. AŽ N1, N2 ir N3. Skaitine išraiška pastebimi ženkliai skirtingi rezultatai, lyginant bendrą fenolinių junginių kiekį, nustatytą abiejuose gamybos formose. Nuovirai išsiskyrė didesni fenolinių junginių suminiu skaičiaus skirtumu (t.y. nuoviruose didesni fenolinių junginių kiekiai nei užpiluose). Nuovirų atveju, didžiausias fenolinių junginių kiekis nustatytas dalinai fermentuotoje (N4) ir nefermentuotoje (N2) Camellia sinensis L. AŽ, (atitinkamai 93,27 ± 1, 82 g/ ml GRE ir 92, 11 ± 1, 05 g/ ml GRE), o užpilų atveju nefermentuotose (N1 ir N2) Camellia sinensis L. AŽ (atitinkamai 85,69 ± 2, 36 g/ ml GRE ir 78,1 ± 1, 78 g/ ml GRE). Nuovirų pranašumą užpilų atžvilgiu lemia virimo/ aušinimo santykio skirtumas (užpilų kaitinimo trukmė

41 41 15 min., aušinimas 45 min., o nuovirų kaitinimas 30 min., aušinimas 15 min.). Bendrą išsiekstrahavusių medžiagų sumažėjimą gali lemti įrangos technologiniai parametrai (krepšelio tinklelio porų dydis), temperatūra ir laikas [39] Taikytų buitinio ir standartinių metodų tyrimų rezultatų aptarimas įvertinant fenolinių junginių kiekį Atlikus trijomis gamybos technologijomis, pagamintuose tiriamųjų AŽ vandeniniuose ekstraktuose nustatyti suminių fenolinių junginių kiekių rezultatai pateikiami 15 paveiksle ir 2 lentelėje Bendras fenolinių junginių kiekis pagal galo rūgšties ekvivalentą, g/ml 0 N1. N2. N3. N4. N5. Užpilas Nuoviras Buitininės paruošos ekstraktas 15 pav. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas ir jų priklausomybė nuo paruošos būdo bei žaliavos rūšies, kur N1 China Gunpowder (žalioji), N2 Japan Bancha (žalioji), N3 Pai Mu Tan (baltoji), N4 Jade Oolong (rudoji), N5 Rooibos Original (raudonoji) Bendras fenolinių junginių kiekis skirtingomis gamybos technologijomis pagamintuose AŽ vandeniniuose ekstraktuose nustatytas nuo 44,43 ± 1,78 iki 96,24 ± 2,16 mg/ml GRE. 2 lentelė. Tyrimų duomenys pasiskirstantys Camellia sinensis L. ir Aspalathus linearis (Burm. F.) žaliavose rūšiniu atžvilgiu ir pagal skirtingą paruošimo technologiją

42 42 *N1 China Gunpowder (žalioji), N2 Japan Bancha (žalioji), N3 Pai Mu Tan (baltoji), N4 Jade Oolong (rudoji), N5 Rooibos Original (raudonoji). 1 Atlikus statistinę duomenų analizę, nustatytas statistiškai reikšmingas skirtumas tarp tirtųjų vandeninių ištraukų, pagamintų iš augalinių žaliavų skirtingomis technologijomis. Rūšiniu atžvilgiu, vertinant žaliosios arbatos (Camellia sinensis L.) ir raudonosios arbatos (Aspalathus linearis (Burm. F.)) žaliavose nustatytus fenolinių junginių kiekius užpiluose ir nuoviruose, atrandami rezultatų sutapimai su buitiniu metodu ruoštais vandeniniais ekstraktais (t.y. bendro fenolinių junginių kiekio pasiskirstymas yra panašus ir nuoviruose, ir buitiniu metodu ruoštuose N1, N2, N3 ir N4 vandeniniuose ekstraktuose prie 100 o C, 20 min. laiko taške). Pateikti 2 lentelėje duomenys, atitinkantys užpilų, nuovirų ir buitiniu metodu paruoštų ištraukų tyrimo rezultatus, rodo, kad buitinėmis paruošomis ir nuovirais gaunamos aukštesnės kokybės ištraukos pagal bendrą fenolinių junginių kiekį nei užpilais. Kito tyrėjo eksperimentiniame tyrime pastebėta kitokia tyrimo rezultatų tendencija tiriant žaliosios arbatos buitines ištraukas, užpilus ir nuovirus fenolinių junginių kiekiai didesni užpiluose ir nuoviruose (Armoškaitė, 2009). Įvertinus vandeninių ekstraktų paruošimo technologijas, didžiausias fenolinių junginių kiekis būdingas N4 ir N2, atitinkamai mažesnis N1 ir N3, o mažiausias N5 AŽ (žr. 2 lentelė). 1 Atlikus statistinę duomenų analizę, nustatytas statistiškai reikšmingas skirtumas tarp tirtųjų ištraukų, pagamintų skirtingomis technologijomis iš augalinių žaliavų: N2 tarp d ir e, kur p < 0,05, tarp e ir f, kur p < 0,05; N3 tarp g ir h, kur p < 0,05, tarp h ir i, kur p < 0,05; N4 tarp y ir j, kur p < 0,05, j ir k, kur p < 0,05; N5 tarp l, m, n, kur p < 0,05.

43 Žaliosios arbatos (Camellia sinensis L.) ir raudonosios arbatos (Aspalathus linearis (Burm. F.)) ekstraktų antiradikalinio aktyvumo nustatymo rezultatai Radikalų surišimo testas (DPPH) nusako tiriamųjų objektų gebėjimą surišti mutagenezės iniciatorius laisvuosius radikalus. Ištraukos buvo skiedžiamos ir vėliau veikiamos laisvojo radikalo DPPH tirpalu. Atsižvelgiant į praskiedimą, iš nustatytų duomenų buvo apskaičiuojamas antioksidacinis aktyvumas. 120 Bendro fenolinių junginių kiekio ir bendro antioksidacinio aktyvumo palyginimas buitiniu metodu paruoštuose vandeniniuose ekstraktuose (100 o C) ,96 76,45 94,51 72,53 96,24 80,2881,22 80,86 70,5671, N1. N2. N3. N4. N5. Bendr.fenol.jung.kiekis pagal GAE (mkg/ml) DPPH (proc.) 16 pav. Tirtų augalinių žaliavų vandeninių ekstraktų, kurie ruošti prie 100 o C ir laikyti 20 min., bendro fenolinių junginių ir antioksidacinio aktyvumo tyrimų rezultatų grafinė išraiška Vandeninių ekstraktų, kurių paruošimo technologija yra buitinis užpilimas 100 o C temperatūros vandeniu ir 20 minučių ekstrahavimo laiko taikymas, nustatyto bendro antioksidacinio aktyvumo rezultatai pateikiami 16 paveiksle. Antioksidacinis aktyvumas didžiausias N3 (81,22 proc.) ir N4 (80,86 proc.) AŽ, atitinkamai mažesnis N1 (76,45 proc.) AŽ, mažiausias N2 (72,53 proc.) ir N5 (71,05 proc) AŽ. Nustatyta silpna koreliacija (0,34), p > 0,05.

44 Bendro fenolinių junginių kiekio ir bendro antioksidacinio aktyvumo palyginimas užpiluose ,1 93,59 85,6982,11 78,179,84 75,94 58,26 44,43 83,8 0 N1. N2. N3. N4. N5. Bendr.fenol.jung.kiekis pagal GRE (mkg/ml) DPPH (proc.) 17 pav. Skirtingų fermentacijų žaliosios arbatos ir raudonosios arbatos užpilų bendro fenolinių junginių ir antioksidacinio aktyvumo tyrimų rezultatų grafinė išraiška Atlikus radikalų surišimo testą užpilų forma pagamintoms ištraukoms, gauti rezultatai neproporcingai išsiskyrė lyginant su fenolinių junginių kiekiu (17 pav.), nustatyta neigiama koreliacija. Didžiausiu antioksidaciniu aktyvumu užpiluose pasižymi N4 (93,59 proc.) ir N3 (92,1 proc.), atitinkamai mažesniu N5<N1<N Bendro fenolinių junginių kiekio ir bendro antioksidacinio aktyvumo palyginimas nuoviruose 80,7377,46 92,11 82,6 82,179,81 93,27 85,9 64,34 59,29 N1. N2. N3. N4. N5. Bendr.fenol.jung.kiekis pagal GRE (mkg/ml) DPPH (proc.) 18 pav. Skirtingų fermentacijų žaliosios arbatos ir raudonosios arbatos nuovirų bendrofenolinių junginių ir antioksidacinio aktyvumo tyrimų rezultatų grafinė išraiška

45 45 Atlikus radikalų surišimo testą nuovirų technologija pagamintoms ištraukoms, gauti bendro antioksidacinio rezultatai tiesiogiai proporcingi fenolinių junginių kiekiui nustatyta labai stipri koreliacija (0,97). Didžiausias DPPH kiekio surišimas nustatytas N4 (85,9 proc.) ir N2 (82,6 proc.) nuovirams, atitinkamai mažesnis N3 ir N1, mažiausias N Taikytų metodų, buitinio, užpilo ir nuoviro, tyrimų rezultatų aptarimas įvertinant antioksidacinį aktyvumą Ištyrus skirtingų technologinių paruošimų vandeninius ekstraktus pastebėti panašūs antioksidacinio aktyvumo dėsningumai atitinkamose arbatų rūšyse (3 lentelė). Antioksidacinis aktyvumas įvertintas nuo 59,29 ± 1,01 proc. iki 93,59 ± 1,92 proc. 3 lentelė. Antioksidacinio aktyvumo tyrimų duomenys pasiskirstantys žaliosios arbatos (Camellia sinensis) ir raudonosios arbatos (Aspalathus linearis) žaliavose rūšiniu atžvilgiu ir pagal skirtingą paruošimo technologiją Paruošimo technologija Arbatos rūšis * Buitinė paruoša (100 o C) Užpilas Nuoviras Antioksidacinis aktyvumas, proc. N1 N2 N3 N4 N5 76,45± 2,89 a 72,53± 2,03 d 81,22± 2,91 g 80,86± 1,87 y 71,05± 2,66 l 82,11± 1,21 b 79,84± 2,07 e 92,10± 2,53 h 93,59± 1,92 j 83,8± 1,06 m 77,46± 1,42 c 82,6± 0,96 f 79,81± 1,02 i 85,9± 1,80 k 59,29± 1,01 n *N1 China Gunpowder (žalioji), N2 Japan Bancha (žalioji), N3 Pai Mu Tan (baltoji), N4 Jade Oolong (rudoji), N5 Rooibos Original (raudonoji). 2 Atlikus statistinę duomenų analizę nustatytas statistiškai reikšmingas skirtumas tarp tirtųjų vandeninių ekstraktų, pagamintų skirtingomis technologijomis iš AŽ. Įvertinus visas skirtingų 2 Atlikus statistinę duomenų analizę nustatytas statistiškai reikšmingas skirtumas tarp tirtųjų ištraukų, pagamintų skirtingomis technologijomis iš augalinių žaliavų: N1 tarp a ir b, kur p < 0,05, tarp b ir c, kur p < 0,05; N2 tarp d ir e, kur p < 0,05, tarp d ir f, kur p < 0,05;

46 46 technologinių paruošimų nustatytas vertes, vidutiniškai didžiausiu antioksidaciniu aktyvumu pasižymi N4 (rudoji) 86 proc. ir N3 (baltoji) 84 proc., mažesniu, bet panašiu N1 (žalioji) ir N2 (žalioji) abi 78 proc., o mažiausiu N5 (raudonoji) 71 proc. (žr. 3 lentelė). Vertinant trijų vandeninių ekstraktų paruošimo technologijas, fenolinių junginių kiekį (didžiausias N4 ir N2, atitinkamai mažesnis N1 ir N3, o mažiausias N5 (žr.2 lentelė)) ir antiradikalinį aktyvumą, praktiniu požiūriu, skirtingų fermentacijų C.sinensis L. ekstraktų oksidacinių savybių prieinamumas yra tikslingiausias trejose paruošimo technologijose (buit.paruoša, užpilai ir nuovirai) vartojant N4 (rudoji) > N3 (baltoji) ir N2 (žalioji), mažiau N1 (žalioji) arbatų rūšis. Nuovirų technologija paruoštos N5 (raudonosios arbatos) ištraukas, būtų netikslinga vartoti siekiant, kuo didesnės oksidacinės pažaidos sumažinimo Antimikrobinio aktyvumo nustatymo rezultatai buitiniu metodu paruoštose vandeniniuose ekstraktuose Nors yra nustatyta Žaliosios arbatos (Camellia sinensis L.) augalinės žaliavos geba slopinti Gram (+) ir Gram (-) bakterinių padermių, kaip Bacillus cereus [4, 6], Micrococcus luteus [6], Pseudomonas aeruginosa [4, 6, 23], Escherichia coli [4, 6], Staphylococcus aureus [4, 23, 25], Shigella spp.[4], Vibrio cholera ir kitų bakterijų augimą [4-6, 8, 21-25], bet remiantis atlikto eksperimentinio tyrimo in vitro rezultatais, nustatytas tik Gram (+) bakterinėms padermėms antimikrobinis aktyvumas (žr. 4 lentelė). Atlikto tyrimo duomenimis 10 proc. koncentracijos A.linearis (Burm. F.) N5 ištrauka nepasižymėjo antimikrobiniu aktyvumu, nes neturėjo nei Gram (+), nei Gram (-) bakterijoms slopinančio poveikio. 4 lentelė. 10 proc. koncentracijos paruoštų mėginių antimikrobinio aktyvumo nustatymo rezultatai, sterilios zonos skersmuo, mm N3 tarp g ir h, kur p < 0,05, tarp h ir i, kur p < 0,05; N4 tarp y, j, k, kur p < 0,05;

47 47 ** N1 China Gunpowder (žalioji), N2 Japan Bancha (žalioji), N3 Pai Mu Tan (baltoji), N4 Jade Oolong (rudoji), N5 Rooibos Original (raudonoji). * statistinis reikšmingumas, p < proc. koncentracijos Camellia sinensis L. vandeninis ekstraktas N2 (nefermentuota žaliosios arbatos rūšis) geriausiai slopino klinikinės S.aureus (sterilios zonos skersmuo 17,41 ± 0,34 mm, p < 0,05) padermės augimą (19 pav.). 10 proc. koncentracijos Camellia sinensis L. vandeninis ekstraktas N3 (nefermentuota baltosios arbatos rūšis) veikė silpniau klinikinę S.aureus (sterilios zonos skersmuo 16,73 ± 0,96 mm, p < 0,05) padermę nei N2, bet iš tiriamųjų augalinių žaliavų vienintelė turėjo slopinantį poveikį ir referentinei S.aureus padermei (sterilios zonos skersmuo 12,44 ± 1,11 mm, p < 0,05). Silpniausiai klinikinę S. aureus padermės augimą slopino N4 ir N1, kurių sterilios zonos skersmenų vidurkiai turi nežymų skirtumą (sterilios zonos skersmuo 16,36 ± 0,29 mm ir 16,24 ± 0,32 mm, p < 0,05). 19 pav. 10 proc. koncentracijos žaliosios arbatos (Camellia sinensis) vandeninio ekstrakto Japan Bancha (N2) slopinamo poveikio klinikinei S.aureus (sterilios zonos skersmuo 17,41 ± 0,34 mm, p < 0,05) padermės augimui nustatymas

48 48 4 lentelėje pateikta, kad 10 proc. koncentracijos Camellia sinensis L. vandeninių ekstraktų N1, N3 ir N4 mėginiai turėjo slopinantį poveikį tiek referentinei, tiek klinikinei B.cereus padermėms, bet didesnį slopinantį poveikį referentinei padermei nei klinikinei. Stipriausiai 10 proc. koncentracijos N1 slopino abiejų B. cereus padermių, referentinę (sterilios zonos skersmuo 14,81 ± 1,19 mm) ir klinikinę (sterilios zonos skersmuo 13,06 ± 0,94 mm), bakterijų augimą (p < 0,05). Silpnesnį slopinantį poveikį referentinei B.cereus padermei turėjo N2 (sterilios zonos skersmuo 14,75 ± 0,76 mm, p < 0,05), o klinikinei padermei N4 (sterilios zonos skersmuo 11,65 ± 0,83 mm, p < 0,05). Silpniau veikė N3 ištraukos B.cereus referentinę (sterilios zonos skersmuo 14,4 ± 0,44 mm, p < 0,05) ir klinikinę (sterilios zonos skersmuo 10,93 ± 1,58 mm, p < 0,05) padermes. Silpniausiai N4 slopino referentinės B. cereus bakterijos augimą (sterilios zonos skersmuo 14,14 ± 1,52 mm, p < 0,05). Remiantis literatūros studijomis, didžiausiu antimikrobiniu aktyvumu pasižymi nefermentuota arbata (žalioji, baltoji), mažiau dalinai fermentuota (raudonoji, oolong) ir fermentuota (juodoji) arbatos [6]. Gauti duomenys parodė, kad nefermentuotos žaliosios (N1- China gunpowder, N2 Japan bancha) ir baltosios arbatos (N3 Pai Mu Tan) turėjo stipresnį slopinantį poveikį S. aureus ir B.cereus bakterijų augimui nei dalinai fermentuota rudoji arbata (N4 Jade Oolong), o tirtų bakterinių kultūrų neveikė dalinai fermentuota raudonoji arbata (Asphalatus linearis, N5 Rooibos Original). Nefermentuotoje žaliosios arbatos (Camellia sinensis L.) augalinėje žaliavoje iš bendrųjų flavonoidų išsiskiria flavan-3- olių (flavanoliai/ flavanai) monomerai katechinai ((-)(EGCG), (-)(EGC), (-)(EC), (-)(GC) ir (+) (C) (2 pav.), o EGCG tai katechinas išsiskiriantis biologiniu aktyvumu ir jo gausiausia žaliosios arbatos žaliavoje lyginant su baltąja, rudąja Oolong, raudonąja Rooibos ir juodąja arbatomis [5, 6, 22, 37]. Literatūros šaltiniuose pateikiama, kad gamybos procesas lemia (Camellia sinensis L.) augalinės žaliavos sudėties pokyčius: žaliosios arbatos augalinei žaliavai atliekamas tik dehidratacijos procesas išsaugoma nepaveiktų katechinų sudėtis ir jų biologinis aktyvumas, o pritaikant fermentacijos procesą, dalinį ar pilną, lemia pagrindinių junginių pokyčius. Ne visi polifenoliai turi antimikrobinį poveikį, bet EGCG (sudaro apie % visų katechinų) ir EGC turi didžiausią antioksidacinį ir antimikrobinį poveikį, o jų didžiausios koncentracijos aptinkamos nefermentuotuose žaliosios ir baltosios arbatų ekstraktuose [6, 8, 9, 22, 36, 37]. Raudonosios arbatos (Aspalathus linearis (Brum.f.)) dalinė fermentacija vyksta mikroorganizmų pagalba, nors sudėty nėra katechinų, moksliniuose tyrumų duomenyse pateikiama, kad ji pasižymi silpnu antimikrobiniu veikimu dėl kitų biologiškai aktyvių medžiagų (rutino, orientino, izoorientino ir aspalatino), bet atlikto tyrimo rezultatuose nebuvo nustatytas priešmikrobinis aktyvumas. Rudosios arbatos gamybos proceso pradžioje atliekama dalinė fermentacija, juodosios pilna

49 49 fermentacija, kai dėl polifenolio oksidazės, kuri katalizuoja oksidacinės polimerizacijos procesą, paveikiami monomerai katechinai, formuojasi galimi oligomerai - bis flavanoliai, teaflavinai, tearubiginai. Taigi, EGCG, vienas iš pagrindinių žaliosios arbatos junginių, turintis priešmikrobinių savybių, po fermentacijos išnyksta, nes suformuojami oligomerai juodojoje arbatoje. Tyrime rudoji arbata pasižymėjo mažiausiu priešmikrobiniu aktyvumu lyginant su žaliosios ir baltosios arbatų aktyvumo duomenimis. Skirtingus antimikrobinio aktyvumo rezultatus tarp fermentuotos ir fermentacijos nepaveiktos augalinės žaliavos, gali lemti cheminių junginių sudėties pokyčiai atliekant augalinės žaliavos apdorojimą gamybos procese, todėl tarp didėjančio fermentacijos stiprumo laipsnio pasireiškia mažėjanti antimikrobinio aktyvumo savybių priklausomybė [1, 5, 6, 8, 9, 22, 41]. Literatūroje pateikiami duomenys, kad Gram (-) bakterijos pasižymi didesniu rezistentiškumu polifenoliams nei Gram (+) bakterijos, sutampa su nustatytais tyrimo rezultatais. Rezistentiškumą lemia Gram(+) ir Gram (-) bakterijų ląstelės sienelės kompozicijos skirtumai (Gram (-) bakterijose lipopolisacharidai veikia kaip barjeras, kuris lemia mažesnį jautrumą katechinų poveikiui) [6, 8].

50 50 4. IŠVADOS 1. Tyrimais nustatyta, kad buitiniu metodu pagamintuose vandeniniuose ekstraktuose aukščiausia kokybė pasiekiama, jei atsižvelgiama į technologinius veiksnius, nes aukštesnės temperatūros ir ilgesnės ekstrahavimo trukmės parinkimas, turi lemamą įtaką suminio fenolinių junginių kiekio išsiskyrimui. Rekomenduotina paruošti buitinį ekstraktą ne mažesnėje nei 90 o C temperatūroje ir taikyti minučių trukmės ekstrahavimą; 2. Pasirinkta vaisto forma turi įtakos fenolinių junginių išsiskyrimui iš žaliavos ir jų biologiniam aktyvumui. Nustatyta, kad didesnis kiekis veikliųjų junginių išskiriamas kai taikomas vandeninių ekstraktų gamyboje nuovirų technologija, o didesniu antioksidaciniu aktyvumu pasižymi užpilai. Rezultatai dar kartą patvirtino, kad temperatūra ir ekstrahavimo faktoriai yra lemiantys ekstraktų kokybę; 3. Pagal augalinėse žaliavose nustatytus fenolinių juginių kiekius ekstraktuose, pastaruosius galima išdėstyti didėjimo tvarka: užpilai< nuovirai< buitinis užpilimas. Pagaminti buitinio užpilimo ekstraktai ir užpilai pasižymėjo didesniu antiradikaliniu poveikiu nei nuovirai; 4. Tyrimo rezultatai parodė, kad ne tik ekstraktų paruošimo technologija turi įtakos ekstraktų biologiniam poveikiui, bet ir žaliava. Dalinai fermentuota žaliosios arbatos ekstraktai pasižymi didesniu antioksidaciniu aktyvumu nei nefermentuotos žaliavos ekstraktai. Raudonosios arbatos ekstraktai pasižymi silpniausiu atioksidaciniu aktyvumu. Didžiausias fenolinių junginių kiekis išekstrahuojamas iš dalinai fermentuotos žaliosios arbatos žaliavos, o mažiausias - iš raudonosios arbatos žaliavos; 5. Antimikrobinio tyrimo rezultatai parodė, kad nefermentuotos Camellia sinensis L. augalinių žaliavų ekstraktai (N3, N2, N1) pasižymi stipresniu poveikiu B. cereus ir S. aureus, lyginant su fermentuotos augalinės žaliavos ekstraktais. Raudonosios arbatos (Aspalathus linearis (Burm. F.), N5) 10 proc. koncentracijos vandeniniai ekstraktai nepasižymėjo antimikrobiniu aktyvumu, nes neturėjo nei Gram (+), nei Gram (-) bakterijoms slopinančio poveikio..

51 51 5. LITERATŪROS ŠALTINIAI 1. Bancirova M. Comparison of the antioxidant capacity and the antimicrobial activity of black and green tea. Food Research International 2010;43: EMEA. Assessment report on Camellia sinensis (L.) Kuntze, non fermentatum folium. Committee on Herbal Medicinal Products. Prieiga per internetą: 3. Preedy Viktor R. Tea in health and disease prevention. First edition [online]. Churchill Livingstone Elsevier; 2013 (cited 2014 Sep 24). Prieiga per internetą: &_idxType=TC&md5=e464460c0917edff67fc1033b51d2785); e_summary_r&cad=0#v=onepage&q&f=false; 4. EMEA. Glossary on herbal teas. Committee on Herbal Medicinal Products (HMPC). Prieiga per internetą: 5. Bansal S, Choudhary S, Sharma M, Kumar Suthar S, Lohan S, Bhardwaj V, Syan N, Jyoti S. Tea: A native source of antimicrobial agents. Food Research International 2013;53: Almajano MP, Carbo R, Angel Lopez Jimenez J, Gordon MH. Antioxidant and antimicrobial activities of tea infusions. Food Chemistry 2008;108: McKay DL, Blumberg JB. A Review of the Bioactivity of South African Herbal Teas: Rooibos (Aspalathus linearis) and Honeybush (Cyclopia intermedia). Phytotherapy research 2007;21: Sharma A, Gupta S, Sarethy IP, Dang S, Gabrani R. Green tea extract: Possible mechanism and antibacterial activity on skin pathogens. Food Chemistry 2012;135: Nazer AI, Kobilinsky A, Tholozan JL, & Dubois-Brissonnet F. Combinations of food antimicrobials at low levels to inhibit the growth of Salmonella sv. Typhimurium: A synergistic effect? Food Microbiology 2005; 22(5): Oh J, Jo H, Cho AR, Kim S-J, Han J. Antioxidant and antimicrobial activities of various leafy herbal teas. Food Control 2013;31: Karori SM, Wachira FN, Wanyoko JK, Ngure RM. Antioxidant capacity of different types of tea products. African Journal of Biotechnology 2007;6:

52 Wu SC, Yen GC, Wang ZS, Chiu CK, Yen WJ, Chang LW. Antimutagenic and antimicrobial activities of pu-erh tea. Food Science and Technology 2007;40: Scalbert A, Manach C, Morand C, Rémésy C. Dietary polyphenols and the prevention of diseases. Critical Reviews in Food Science and Nutrition 2005;45: Staszewski MV, Pilosof AMR, Jagus RJ. Antioxidant and antimicrobial performance of different argentinean green tea varieties as affected by whey proteins. Food Chemistry 2011; 125: Klaus S, Pultz S, Thone-Reineke C, Wolfram S. Epigallocatechin gallate attenuates dietinduced obesity in mice by decreasing energy absorption and increasing fat oxidation. International Journal of Obesity 2005;29: Devine A, Hodqson JM, Dick IM, Prince RL. Tea drinking is associated with benefits on bone density in older women. The American Journal of Clinical Nutrition 2007; 86: Ramassamy C. Emerging role of polyphenolic compounds in the treatment of neurodegenerative diseases: a review of their intracellular targets. European Journal of Pharmacology 2006; 545: Yanai N, Shiotani S, Hagiwara S, Nabetani H, Nakajima M. Antioxidant combination inhibits reactive oxygen species mediated damage. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 2008; 72(12): Huang D, Ou B, Prior RL. The chemistry behind antioxidant capacity assays. Journal of Agricultural and Food Chemistry 2005;53(6): Chan EWC, Lim YY, Chong KL, Tan JBL, Wong SK. Antioxidant properties of tropical and temperate herbal teas. Journal of Food Composition and Analysis 2010; 23(2): Tsai T-H, Tsai T-H, Chien Y-C, Lee C-W, Tsai P-J. In vitro antimicrobial activities against cariogenic streptococci and their antioxidant capacities: A comparative study of green tea versus different herbs. Food Chemistry 2008; 110: Nijveldt RJ, van Nood E, van Hoorn DEC, Boelens PG, van Norren K, van Leeuwen PAM. Flavonoids: a review of probable mechanisms of action and potential applications. The American Journal of Clinical Nutrition 2001; 74: Radji M, Agustama RA, Elya B, Tjampakasari CR. Antimicrobial activity of green tea extract against isolates of methicillin resistant Staphylococcus aureus and multi drug resistant Pseudomonas aeruginosa. Asian Pac. J Trop Biomed 2013; 3(8):

53 Gordon NC, Wareham DW. Antimicrobial activity of the green tea polyphenol (-)- epigallocatechin-3-gallate (EGCG) against clinical isolates of Stenotrophomonas maltophilia. International Journal of Antimicrobial Agents 2010; 36: Osterburg A, Gardner J, Hyon SH, Neely A, Babcock G. Highly antibiotic-resistant Acinetobacter baumannii clinical isolates are killed by the green tea polyphenol ( )- epigallocatechin-3-gallate (EGCG). Clin Microbiol Infect 2009; 15: Napolitano JG, Gödecke T, Lankin DC, Jaki BU, McAilpine JB, Chen SN, Pauli GF. Orthogonal analytical methods for botanical standardization: determination of green tea catechins by qnmr and LC MS/MS. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2014; 93: Nederkassel AM, Daszykowski M, Massart DL, Heyden YV. Prediction of total green tea antioxidant capacity from chromatograms by multivariate modeling. Journal of Chromatography A. 2005; 1096: Atoui AK, Mansouri A, Boskou G, Kefalas P. Tea and herbal infusions: Their antioxidant activity and phenolic profile. Food Chemistry 2005; 89: Maki KC, Reeves MS, Farmer M, Yasunaga K, Matsuo N, Katsuragi Y, Komikado M, Tokimitsu I, Wilder D, Jones F, Blumberg JB, Cartwright Y. Green Tea Catechin Consumption Enhances Exercise-Induced Abdominal Fat Loss in Overweight and Obese Adults. The Journal of Nutrition 2009; 139: Lee KO, Kim SN, Kim YC. Anti-wrinkle Effects of Water Extracts of Teas in Hairless Mouse. Toxicological Research 2014; 30: Batista GAP, Cuncha CLP, Scartezini M, Heyde R, Bitencourt MG, Melo SF. Prospective Double-Blind Crossover Study of Camellia Sinensis (Green Tea) in Dyslipidemias. Arq Bras Cardiol 2009; 93: Qian G, Xue K, Tang L, Wang F, Song X, Chyu M-C. Mitigation of Oxidative Damage by Green Tea Polyphenols and Tai Chi Exercise in Postmenopausal Women with Osteopenia. [Internet] 2012 [cited 2015 Jan 24]. Available from: ne pdf;

54 Kim W, Jeong MH, Cho SH, Yun JH, Chae HJ, Ahn YK, Lee MC, Cheng X, Kondo T, Murohara T, Kang JC Effect of green tea consumption on endothelial function and circulating endothelial progenitor cells in chronic smokers. Circ J 2006; 70: Jašmontaitė L. Kvapiųjų rozmarinų, vaistinių ramunių ir paprastųjų pankolių skystųjų ekstraktų technologijos ir kokybės vertinimas: magistrinis baigiamasis darbas. Kaunas; Keturakytė V. Skystųjų preparatų iš Juglans nigra L. lapų gamyba, biologiškai aktyvių junginių kiekio įvertinimas ir antioksidacinio aktyvumo tyrimas: magistro baigiamasis darbas. Kaunas; Frank J, George TW, Lodge JK, Rodriquez-Mateos AM, Spencer JP, Minihane AM, Rimbach G. Daily consumption of an aqueous green tea extract supplement does not impair liver function or alter cardiovascular disease risk biomarkers in healthy men. The Journal of Nutrition 2009; 139: Patel SS, Beer S, Kearney DL, Phillips G, Carter BA. Green tea extract: A potential cause of acute liver failure. World Journal of Gastroenterology 2013; 19(31): Colalto C. Herbal interactions on absorption of drugs: Mechanisms of action and clinical risk assessment. Pharmacological Research 2010; 62: Armoškaitė V. Žaliosios arbatos ištraukų kokybės analizė ir antioksidacinio aktyvumo tyrimas: magistro baigiamasis darbas. Kaunas; Marnewick JL, Rautenbach F, Venter I, Neethling H, Blackhurst DM, Wolmarans P, Macharia M. Effects of rooibos (Asphalathus linearis) on oxidative stress and biochemical parameters in adults at risk for cardiovascular disease. Journal of Ethnopharmacology 2011; 133: Nekvapil T, Kopriva V, Boudny V, Hostovsky M, Dvorak P, Malota L. Decrease in the Antioxidant Capacity in Beverages Containing Tea Extracts during Storage. The Scientific Worl Journal [Internet] 2012 [cited 2015 Apr 29]. Available from: Jain DP, Pancholi SS, Patel R. Synergistic antioxidant activity of green tea with some herbs. Journal of Advanced Pharmaceutical Technology & Research 2011; 2(3): Meškauskaitė D. Vaistinio augalo Leonurus cardiaca L. eterinių aliejų, fenolinių junginių ir antioksidacinio aktyvumo vertinimas: magistro baigiamasis darbas. Kaunas; Janulis V, Puodžiūnienė G, Malinauskas V. Fitocheminė analizė. Mokomoji knyga. Kaunas: KMU leidykla; 2008.

55 Joubert E, Winterton P, Britz TJ, Ferreira D. Superoxide anion and alpha, alpha-diphenyl-betapicrylhydrazyl radical scavenging capacity of rooibos (Aspalathus linearis) aqueous extracts, crude phenolic fractions, tannin and flavonoids. Food Res Intern 2004; 37: Joubert E, Winterton P, Britz TJ, Gelderblom WC. Antioxidant and pro-oxidant activities of aqueous extracts and crude polyphenolic fractions of rooibos (Aspalathus linearis).j Agric Food Chem 2005; 53: Standley L, Winterton P, Marnewick JL, Gelderblom WC, Joubert E, Britz TJ. Influence of processing stages on antimutagenic and antioxidant potentials of rooibos tea. J Agric Food Chem 2001; 49:

56 56 6. PRIEDAI 1 priedas. China Gunpowder 2 priedas. Japan Bancha 3 priedas. Pai Mu Tan

57 57 4 priedas. Jade Oolong 5 priedas. Rooibos Original 6 priedas. 10 proc. koncentracijos žaliosios arbatos Japan Bancha (N2) antimikrobinio aktyvumo prieš klinikinę S.aureus padermę apskaičiuoto sterilios zonos skersmenų dažnio analizė (p < 0,05)

58 58 7 priedas. Galo rūgšties gradavimo grafiko sudarymas spektrofotometriniams tyrimams atlikti. Galo rūgšties konc. taškai μg/ ml.; Abs ribos 0,12 1,2